Influência das fontes hidrotermais marinhas de baixa profundidade na composição das comunidades de meiofauna

Relatório de Estágio da Licenciatura em Biologia Marinha.Este trabalho tem como objectivo o conhecimento da influência das fontes hidrotermais de baixa profundidade na composição da meiofauna. A recolha de sedimento foi efectuada a uma profundidade máxima de 7 metros, por mergulho com escafandro autónomo na zona em estudo (Ribeira Quente) e numa zona de controlo (Caloura). Em laboratório crivou-se e preparou-se o material recolhido para microscopia. Contaram-se e identificaram-se, em grandes grupos, os organismos com base em bibliografia especializada. Foram identificados 16 taxa no total da amostragem. Os grupos dominantes na Ribeira Quente foram o estado larvar Nauplii, os taxa Harpacticoida e Foraminifera e na Caloura os taxa Foraminifera, Ostracoda e Gastropoda. A Ribeira Quente demonstrou uma maior diversidade e uma menor abundância de organismos que a Caloura. Foram efectuados testes estatísticos para determinar a similaridade dos locais de amostragem, no entanto, esta hipótese foi rejeitada. A composição e distribuição da meiofauna pode ser influenciada pelas fontes hidrotermais de baixa profundidade, no entanto, é necessário determinar a extensão desta influência e considerar a realização de mais estudos sobre a composição e densidade da meiofauna nos Açores

An exact optimization approach for personnel scheduling problems in the call center industry

Dissertação de mestrado em Engenharia de SistemasNowadays, the importance of the call center industry is increasing because they are a major mean of communication between organizations and their costumers. So, ensuring good and optimized personnel schedules in call centers is crucial and has several advantages: reduction of total labor costs, reducing overstaffing, employees’ satisfaction, meeting their preferences, and costumers’ satisfaction, presenting acceptable waiting times. The considered problem concerns personnel scheduling in a 24/7 call center where the scheduling process is done manually. So, the main goal is to explore exact solution approaches in order to obtain solutions whose quality is preferable to the manually achieved ones and to reduce the processing time. The proposed optimization model is an Integer Programming model. The purpose of this model is to assign shifts to workers, while minimizing the total penalization that are associated to employees’ time preferences. The model is implemented on ILOG CPLEX Optimization Studio 12.7.0.0, using OPL, and tested with various instances, including randomly generated and real-world data instances. In order to analyze the quality of the model, a computational study of its linear relaxation was carried out, concluding that the model presents null integrality gaps in all the tested instances. So, the proposed model has a strong formulation, that is, a good quality model. Additionally, to evaluate the performance of the model when running large instances, several randomly generated instances were tested using ILOG CPLEX Optimization Studio 12.10.0.0, achieving good computational results.Hoje em dia, a importância da indústria dos call centers tem vindo a aumentar, uma vez que estes são um grande meio de comunicação entre as empresas e os respetivos clientes. Nesse sentido, garantir um bom e otimizado escalonamento de pessoal é crucial e traz consigo bastantes vantagens: redução dos custos totais de trabalho, reduzindo excesso de trabalhadores, aumento da satisfação dos empregados, atendendo às suas preferências, e ainda aumento da satisfação dos clientes, apresentando tempos de espera aceitáveis. O problema considerado envolve escalonamento de pessoal num call center que opera 24 horas por dia, 7 dias por semana. Atualmente, o processo de escalonamento é feito manualmente. Assim, o principal objetivo é explorar abordagens de resolução exata para obter soluções que apresentam qualidade preferível às das soluções obtidas até ao momento e para reduzir o tempo gasto em todo o processo. O modelo de otimização proposto é um modelo de Programação Inteira, cujo objectivo é associar turnos de trabalho aos trabalhadores, minimizando o total das penalizações associadas às preferências horárias dos mesmos. O modelo é implementado no ILOG CPLEX Optimization Studio 12.7.0.0, utilizando linguagem OPL, e testado com várias instâncias, incluindo instâncias geradas aleatoriamente e instâncias com dados reais. A análise da qualidade do modelo passou pelo estudo computacional da sua relaxação linear, podendo concluir-se que o modelo apresenta um intervalo de integralidade nulo em todas as instâncias testadas. Assim, o modelo proposto é um modelo forte, isto é, um modelo de boa qualidade. De forma a avaliar o desempenho do modelo a resolver instâncias grandes, várias instâncias geradas aletoriamente são testadas utilizando o software ILOG CPLEX Optimization Studio 12.10.0.0., apresentando bons resultados computacionais

Activities of an aqueous plant extract against Herpes simplex virus type 2 (HSV 2): role in virus replication and progeny yield

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015Herpes simplex virus type 2 (HSV-2) is widely distributed through the human population, infecting more than 500 million people globally. Although causing generally mild infections this virus may cause severe symptoms occasionally, mainly in immunocompromised patients. Presently, there are a number of systemic antiviral agents against herpesvirus, the most commonly used being acyclovir (ACV) and its prodrugs. However, long term treatments with these drugs may result in the development of resistance, especially in immunocompromised patients, which leads to a continuous search for new and better therapeutic alternatives. According to the World Health Organization (WHO) plants would be the best sources for obtaining a wide variety of drugs. In fact, in the last decades many pharmacological and chemical studies have focused on medicinal plants and the discovery of new natural therapeutic compounds. In this study the anti-herpetic action of an aqueous extract was evaluated. The product was obtained by decoction of stem and leaves from Solidago virgaurea, a perennial herb member of the Asteraceae family. The study of the aqueous extract activity included a preliminary evaluation of its cytotoxicity in Vero cells – by the MTT assay - in the same conditions that are applied for viral production. Extract direct effect on viral particles – virucidal effect – was also assessed, having proved null. Anti-herpetic activity was investigated through two kinds of experiments: treatment of infected cells during virus production that revealed a mean yield reduction of 94 % in treated relatively to non-treated cells and an IC50 of 35.1 μg/mL; and treatment of infected cells during virus titration, which revealed slighter inhibition but significant size differences between virus plaques formed in treated and control conditions (smaller in treatment conditions). To further evaluate the mechanisms that mediate the aqueous extract inhibitory effect, infected cells – treated and non-treated - and virus particles – produced in treated and non-treated cells - were visualized through Transmission Electron Microscopy (TEM), revealing less damage due to infection in treated cells and a reduced amount of viral particles in HSV-2 suspensions produced in treated cells, relatively to controls. A kinetic of the first hours of the infection was performed with and without treatment, to assess possible differences in DNA production. Extracted samples were subjected to qPCR and results showed that the amount of viral DNA raises significantly slower in treated versus non-treated infected cells, throughout the infection. This is consistent with the effective reduction of the extract when added at later infection times - 4-6 h p.i. - when DNA replication is already in an advanced stage. Our results suggest that the aqueous extract inhibits HSV-2 replication, when present at the beginning of the infection, possibly by interfering with the viral DNA synthesis.O vírus Herpes simples tipo 2 (HSV-2) é um vírus de simetria icosaédrica e grandes dimensões, pertencente à família Herpesviridae, subfamília Alphaherpesvirinae da ordem Herpesvirales. Infecta mais de 500 milhões de pessoas em todo o mundo, surgindo, em cada ano, mais de 20 milhões de casos. A sua prevalência é geralmente mais elevada entre mulheres do que homens e varia substancialmente entre diferentes regiões do globo, alcançando os mínimos na Europa Ocidental - 18 % para mulheres e 13 % para homens – e percentagens máximas na África Subsaariana – 70 % para mulheres e 55 % para homens. O HSV infecta as células da mucosa oral ou genital e tem a capacidade de infetar as dendrites e os gânglios sensoriais que enervam estes tecidos onde estabelece latência. Estas infeções causam normalmente patologias ligeiras – gengivite, herpes labialis ou herpes genitalis – podendo até ser assintomáticas. Porém, infeções com HSV-2 podem causar complicações sérias a nível ocular - sendo a primeira causa de cegueira devida a infeção no mundo Ocidental -, neurológico - causando meningites e encefalites, especialmente comuns em neonatos – e dermatológico. Estas patologias mais severas, associadas à infeção com HSV, ocorrem com maior frequência em pacientes imuno-comprometidas, nomeadamente em indivíduos HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana) positivos. Aliás, a infeção com HSV-2 aumenta 3 a 4 vezes a probabilidade de adquirir HIV e a sua disseminação, sendo esta relação recíproca, uma vez que pacientes HIV positivos têm maior probabilidade de adquirir HSV-2 e sofrem mais reativações da infeção. Atualmente, existem vários agentes com atividade antiviral contra HSV, como o Aciclovir (ACV) e as suas pró-drogas, no entanto, tratamentos prolongados com estes compostos podem resultar no desenvolvimento de resistência. De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) as plantas são a melhor fonte para a obtenção de novas drogas e, nas últimas décadas, as plantas medicinais têm sido alvo de vários estudos químicos e farmacológicos. Neste estudo foi avaliado o efeito anti-herpético do extrato aquoso de Solidago virgaurea, uma planta perianal, membro da família Asteraceae. O extrato utilizado foi obtido por decocções de caules e folhas de S. virgaurea e a solução stock foi preparada a 100 mg/mL em DMSO. Antes de ser sujeito a testes de actividade anti-herpética foi ensaiado o efeito do extracto aquoso na viabiliade de células hospedeiras não infectadas, através do método do MTT – um ensaio colorimétrico que se baseia na capacidade de reduzir metabolicamente o sal de tetrazolio das células viáveis. Para isso culivaram-se células Vero em placas de 96 poços – em meio de cultura com FBS (Soro Fetal Bovino) a 10 % – até à sub-confluência. O meio de cultura foi depois substituido por meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extracto (25 - 250 μg/mL), ou meio com FBS a 2 % sem adição de extrato no caso dos testemunhos, e as placas foram incubadas 24 ou 48 horas a 37 °C. No final do período de tratamento fez-se o teste do MTT para determinação da viabilidade das culturas tratadas, por comparação com as culturas não tratadas. Os conteúdos de cada poço da P96 foi analisado espectofotometricamente num leitor de placas Elisa. Para caracterizar a actividade citotóxica do extracto foram comparadas as absorvâncias obtidas em poços com células tratadas e relação a células não tratadas e determinaram-se os parametros CMNC (Concentração Máxima Não Citotóxica) - 150 μg/mL - e CC50 (Concentração que inviabiliza 50 % das células) – 177,3 μg/mL. O efeito directo do extracto nas partículas de HSV-2 foi testado através da comparação dos títulos de suspensões virais previamente tratadas com 100 μg/mL de extrato em meio com FBS a 2 % com os títulos de suspensões não tratadas. O extrato não demonstrou efeito virucida sobre partículas virais em suspensão, uma vez que os títulos das suspensões tratadas foram muito semelhantes aos títulos dos testemunhos. Para testar o efeito do extrato na formação de placas virais infetaram-se células, em placas de 24 poços, com diluições seriadas de HSV-2. Depois da entrada do vírus – 30 minutos pós infeção – os inóculos foram removidos e foi adicionado meio de cultura com FBS a 2 % com ou sem 100 μg/mL de extrato, às culturas tratadas e testemunho, respetivamente. No final do período de tratamento – 3 a 4 horas pós infeção (h p.i.) – foi adicionado meio com FBS e Sephadex a 2 %. A redução de título em culturas tratadas foi 71,6 ± 26,8 %, em relação às não tratadas. Foi ainda evidente uma redução no diâmetro das placas produzidas nas culturas tratadas. Foram também levadas a cabo várias experiências envolvendo a produção de vírus em condições de tratamento, em que culturas celulares sub-confluentes foram infetadas com cerca de 3 pfu/célula e tratadas com extrato em diferentes concentrações e durante diferentes períodos da infeção. Os títulos das suspensões produzidas em condições de tratamento foram comparados com os títulos dos testemunhos para o cálculo das percentagens de inibição. A redução média de título – com concentrações de extrato não citotóxicas – foi de 93,65 ± 8 %, relativamente a vírus produzido na ausência do extrato. Para determinar os parâmetros IC50 e IC90 (concentrações que reduzem o rendimento viral em 50 e 90 %, respetivamente) foram produzidas suspensões de HSV-2 em meio com FBS a 2 % e diferentes concentrações de extrato (10-175 μg/mL) que foram posteriormente tituladas. Os IC50 e IC90 foram calculados através de regressão linear da curva dose-resposta e foram 35,1 e 128,1 μg/mL, respetivamente. Para investigar a etapa da infeção afetada pelo extrato produziram-se suspensões de HSV-2 sob tratamento - com 100 μg/mL de extrato – iniciado em diferentes horas pós infeção. Foi observável uma redução da percentagem de inibição do extrato para cerca de 50 % em tratamentos começados entre as 3 e as 6 h p.i. e para 0 % a partir das 15 h p.i. Células infetadas tratadas e não tratadas, e partículas virais produzidas em ambas as condições, foram observadas por Microscopia Eletrónica de Transmissão (TEM), revelando a existência de menos danos, devidos à infeção, em células infetadas tratadas do que em não tratadas e uma quantidade significativamente menor de partículas de HSV-2 em suspensões virais produzidas em células tratadas, apesar dos viriões produzidos sob tratamento não apresentarem defeitos morfológicos. Por fim foi executada uma cinética da infeção em condições de tratamento (e uma cinética testemunho, em condições normais de produção viral), para tal, células infetadas – tratadas e não tratadas - foram raspadas para o meio de cultura a diferentes horas pós infeção – 2 a 7. O DNA de cada cultura infetada recolhida foi extraído, quantificado e submetido a PCR para a deteção de DNA viral. O resultado não permitiu visualizar diferenças significativas na quantidade de DNA de HSV-2 em células tratadas e não tratadas, mas mostrou um aumento considerável na quantidade de DNA a partir das 5 horas pós infeção. As mesmas amostras foram depois utilizadas para PCR em tempo real (qPCR) para avaliar possíveis diferenças na quantidade de DNA viral. O resultado mostrou que, embora nas horas iniciais – 3-4 h p.i. – as diferenças na quantidade de DNA sejam mínimas, entre amostras de DNA extraído de células tratadas e não tratadas, é visível um aumento muito mais lento no número de cópias de DNA viral ao longo da infeção em culturas tratadas do que em não tratadas, indicando que a replicação de DNA é afetada durante o tratamento com extrato aquoso de S. virgaurea

Gamification framework for a document management system

Este projeto consiste na definição e implementação de uma estratégia de ludificação para um software de gestão documental, cuja função principal é ser uma alternativa aos métodos de arquivo de documentos tradicionais em empresas, incluindo a sua gestão e a dos processos a eles associados, através de workflows, isto é, dos fluxos de trabalho para cada documento, incluindo a sua respetiva alocação a diferentes utilizadores. Assim, o trabalho desenvolvido no projeto consiste numa primeira fase no estudo teórico da experiência do utilizador e das estratégias de ludificação existentes. Posteriormente, é feita uma análise da experiência atual do utilizador com o software, e uma avaliação do seu nível de ludificação atual através da framework Octalysis. Por fim, é definida e implementada uma estratégia de ludificação com base na metodologia de Werbach and Hunter, de modo a melhorar a experiência do utilizador e otimizar a eficácia dos objetivos da ferramenta.The aim of this dissertation is to define and implement a gamification strategy to a document management software. On this project is analyzed a real document management platform that has been applied as an alternative to the conventional document archive methods, including documents management and the processes associated to them in a business context through workflows associated to each document that allocates the document's related tasks to specific users. First, the aim of the research were the literature review about user experience and gamification strategies. Subsequently, a user experience analysis is made, incluing the evaluation of the actual gamification level of the software, using the Octalysis framework. Finally, in order to improve the user experience and optimize the software funcionalities a gamification strategy was defined, following the Werbach and Hunter methodology

Banks and sovereigns: an econometric analysis of an entangled relationship

In this discussion OLS regressions are used to study the factors that influence sovereign yield spreads and domestic bank indeces for a set of euro area countries. The results show that common factors explain changes in bank indeces better than in the yields. Moreover, although there is some country differentiation, a common pattern among all is visible. A contemporary spillover effect between banks and sovereigns emerged after bank bailouts and became stronger with the burst of the sovereign debt crisis. The vicious cycle between the two has contributed to the escalation of spreads and to painful austerity measures.UNL - NSB

Development of a normative base in pathologies of the rheumatologic forum based on posturography and elec-tromyography

Maintaining a stable standing position and body orientation are fundamental tasks to perform everyday activities and ensure the quality of life. The ability to control these conditions can be damaged by various conditions, for example rheumatologic diseases, muscular diseases, aging, vestibular diseases and others. For that reason is important to know how the postural control reacts to different situation and how is affected by different anomalies like those that were mention before. The main goal of this project is to define the normal population pattern of up-right standing position using posturography and electromyography (EMG). A protocol was developed for achieve this goal and 39 healthy subjects participated in the study. An extra 10 subject diagnosticated with anquilosant spondylitis took part in the study. Results obtained on this study were very interesting. It was concluded that right Rectus Abdominis played an important role in maintaining the upright standing posi-tion, by its constantly activation along the conditions of the protocol. Analyzing center of pressure (COP) and EMG parameters, it was concluded that visual feedback has an important role in maintaining the postural control. By analyzing the 10 extra subjects, it was concluded that EMG is an essential tool in order to compare the two groups and identify differences

Understanding the interactions between retroviral vectors and the genome of human keratinocytes

Tese de mestrado. Biologia (Microbiologia aplicada). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2010Retroviruses are a unique family of infectious agents, its diverse life cycle and survival strategies have been an important object of study to modern biology. The integration pattern of gamma-retroviruses (RV) and lentiviruses (LV) in the human genome follows a non-random very distinct distribution, but the precise factors involved in choice of the integration sites are still unknown. To further study this question, RV (MLV) and LV (HIV) integration sites were mapped after infection of primary human keratinocytes with vectors derived from these viruses. 3020 and 1601 unique sites for MLV and HIV, respectively, were retrieved and analysed for correlation with several genomic sites. Moreover, a comparative analysis between the new dataset and previously obtained datasets on lymphocytes T and haematopoietic stem cells Cd34+ was performed to understand the involvement of the cellular program in viral integration choices. The outcome of this project suggests substantial differences in the molecular mechanisms tethering RV and LV PICs to human chromatin. Both vectors’ integration locates preferably inside genes and target mostly active genes with a higher frequency in lymphocytes, these characteristics showed a higher frequency in HIV’s integrations. MLV is attracted to TSS proximal regions with a higher frequency in lymphocytes, while HIV is repelled by these regions independently of the cell-type. MLV positively associates with epigenetic markers of promoters and enhancers and has a higher integration in evolutionary conserved non-coding sequences in mammals (CNCs). Additionally it targets regions rich in transcription factor binding sites (TFBS) with a cell-specific pattern, revealing a possible preference for functional TFBS rather then a general feature preference. HIV associates with epigenetic markers for the body of transcribed genes and has no preference for CNCs. HIV showed a more widely distributed integration, with clusters that spread through much larger regions of the genome and, therefore, target more genes then MLV’s clusters which have a more packed distribution. Analysis of gene function revealed some cell-specificity in MLV’s targets although common genes probably related to the transcription machinery are also highly targeted. HIV targets genes involved essentially in general cell-functions. Furthermore we predict that retroviruses choose early replicating regions of the genome to integrate. Since primary human keratinocytes are clinically relevant in gene therapy for correction of inherited skin diseases, safety parameters related to both vectors were also analysed. The results of this study predict that HIV has a lower probability of generating insertional gene activation events that could lead to oncogene activation. Furthermore, since MLV has a more cell-specific integration pattern, there’s a different probability of integrating near specific oncogenes according to the cell-type. Findings of this work reveal cellular specific patterns of integration as well as common integration preferences, clarifying the cellular machinery’s role in integration site-selection mechanism. Overall these results strengthen models for integration targeting based on tethering of viral components to host proteins and suggest a higher involvement of the cellular transcriptional machinery in MLV’s integration in comparison to HIV’s.Os retrovírus fazem parte de uma família única de agentes infecciosos; as particularidades do seu ciclo de vida, a forma como interagem com o hospedeiro e as consequências desta interacção têm sido objecto de estudo fulcral da biologia moderna. O impacto dos retrovírus na sociedade actual é inegável e a busca pela sua compreensão tem direccionado esforço e recursos da comunidade científica. O processo de integração retroviral no genoma humano é de primordial importância uma vez que, dele depende a sobrevivência do vírus no hospedeiro. A integração dos retrovírus segue um padrão não-aleatório que varia entre as diversas famílias virais, podendo-se facilmente identificar uma família retroviral pelas suas preferências na escolha do local de integração (Bushman, 2005). Apesar dos mecanismos envolvidos nas reacções de corte e ligação do genoma viral ao do hospedeiro serem já bastante conhecidos, os factores envolvidos na escolha do local de integração são ainda uma questão em aberto. Para tentar compreender melhor esta questão, mapeei 3020 locais únicos de integração de moloney leukaemia virus (MLV) e 1601 locais de integração de human immunodeficiency virus (HIV) no genoma de queratinócitos humanos primários. Sendo MLV da família oncoretroviridae e HIV da família lentiviridae, procurei estabelecer as semelhanças e diferenças no processo de escolha do local de integração de cada um. A par de analisar as preferências integrativas neste tipo celular, realizei uma análise comparativa com dados anteriores obtidos em células estaminais hematopoiéticas (HSC) Cd34+ e linfócitos T de forma a tentar compreender o envolvimento do programa celular nas escolhas integrativas. Os resultados deste trabalho demonstram que MLV, membro da família gamma-retroviridae, e HIV, da família lentiviridae, apresentam padrões de integração não aleatórios muito distintos. Os vírus em estudo apresentam diferenças substanciais nos mecanismos moleculares que atraem os complexos de pré-integração viral (PICs) para a cromatina humana revelando estratégias evolutivas muito diversas. Ambos os vectores se integram preferencialmente dentro de genes e maioritariamente em genes activos, com uma frequência mais elevada em linfócitos. Estas características demonstraram-se mais exacerbadas nas integrações de HIV. MLV é atraído por regiões próximas de transcription start sites (TSS), com uma frequência mais elevada em linfócitos, enquanto HIV é repelido por estas mesmas zonas do genoma com igual frequência em todos os tipos celulares. Ambos os vírus se integram preferencialmente dentro de genes em comparação com o controlo, no entanto, esta preferência é bastante mais acentuada em HIV, em particular em linfócitos, apresentando mais de 80% das integrações em genes em comparação com 50% das integrações de MLV. Genes com expressão activa são candidatos preferenciais para a integração viral, incluindo ≈70% dos hits únicos. Esta preferência é privilegiada nas integrações dentro de genes de HIV, sendo mais elevada em Cd34+HSC quando comparada com queratinócitos. MLV, mas não HIV, revela alguma preferência por zonas do genoma conservadas não-codificantes (CNCs) entre mamíferos e relaciona-se positivamente com regiões ricas em transcription factor binding sites, com um padrão particular para cada tipo celular. Esta particularidade sugere uma preferência por TFBS activos mais do que uma preferência geral pela vizinhança destas regiões genómicas. Foram também analisados diversos marcadores epigenéticos para os diversos tipos celulares. Esta análise revelou uma forte associação de MLV a regiões com promotores e enhancers e uma associação negativa a zonas com marcadores geralmente associados a cromatina inactiva ou repressão da expressão génica. Por outro lado, HIV associa-se positivamente a marcadores epigenéticos para o corpo de genes transcritos e negativamente para marcadores de regiões com promotores e enhancers, assim como zonas de cromatina inactiva. Clusters de integração viral foram definidos estatisticamente, tendo em conta o tamanho da amostra e a distância entre uma integração e a integração consecutiva. Verificou-se que MLV apresenta clusters com maior densidade de integração, enquanto os clusters de HIV se expandem através de uma área mais vasta da cromatina. Consequentemente, os clusters de HIV incluem um maior número de genes relativamente a MLV. Através da utilização do programa Ingenuity analisei os genes alvo de ambos os vírus relativamente à sua função em todos os tipos celulares. Verifica-se que MLV tem como alvo genes específicos do tipo celular assim como genes relacionados com funções mais gerais. HIV integra-se essencialmente em genes com funções de regulação da expressão génica. Seguidamente, coloquei a hipótese de que as integrações retrovirais se localizariam em zonas dos cromossomas que se replicam cedo durante o ciclo replicativo, uma vez que, estas zonas se relacionam com zonas de cromatina activa assim como com genes de elevada expressão em determinado tipo celular. Apesar de considerar os resultados com alguma cautela, tendo em conta a reduzida informação disponível em relação ao tempo de replicação, é previsível uma forte correlação com zonas dos cromossomas que replicam cedo, por parte de ambos os vírus. Uma vez que os vírus estudados são aplicáveis ao nível da terapia génica de doenças epiteliais hereditárias, verifiquei alguns parâmetros de segurança relativamente a ambos os vectores virais. Após confronto de uma lista de common insertion sites e oncogenes com os genes alvo de MLV e HIV, prevê-se que os lentivírus sejam vectores mais seguros no entanto, dadas as limitações das análises, não foi possível concluir com bastante fiabilidade sobre esta questão. A partir do seu padrão de integração, é possível que os gamma-retrovirus tenham desenvolvido um mecanismo que tira proveito da maquinaria celular transcripcional para promover a sua própria expressão, ligando integração do provírus com regiões de elevada actividade no genoma, ricas em TFBS, TSS, promotores, enhancers e com uma conformação epigenética característica de uma cromatina activa. Isto sugere um modelo no qual factores de transcrição (TFs) ubíquos ligados aos complexos de pré-integração (PICs) de retrovírus, interagem com componentes gerais dos complexos de ligação a enhancers, por exemplo co-reguladores, complexos de remodelação da cromatina ou complexos mediadores, em vez de TFs ou famílias de TFs específicas. A ligação dos PICs a fábricas transcripcionais, onde promotores e regiões regulatórias são relocalizadas através de mecanismos específicos do tipo celular, pode ser a causa dos clusters específicos com alta frequência de integração de MLV assim como do targeting preferencial de genes associados a redes regulatórias específicas do tipo celular. Trabalhos recentes dão suporte a esta hipótese, propondo uma interacção directa entre integrase e remodelação da cromatina, reparação de DNA e factores transcripcionais. De um ponto de vista evolutivo, esta cooperação pode ser interpretada como o desenvolvimento dos mecanismos através dos quais os retrotransposões escolhem regiões alvo específicas através da ligação a proteínas da célula hospedeira. Um mecanismo ligando selecção de locais alvo a regulação génica pode ter evoluído para maximizar a probabilidade de que os gammaretrovírus sejam transcritos no genoma da célula-alvo e, possivelmente para induzir a expansão das células infectadas através de desregulação insercional de reguladores de crescimento específicos do tipo celular. Por outro lado, os lentivírus desenvolveram uma estratégia totalmente diferente, interagindo com muito menos interferência com a cromatina e maquinaria celular do hospedeiro, isto é, não provocando situações de desregulação insercional uma vez que não escolhem a proximidade de regiões regulatórias para se integrar. Esta estratégia prolonga o tempo de vida das células hospedeiras e consequentemente do hospedeiro, aumentando a probabilidade de disseminação viral para novos hospedeiros. Este trabalho contribui assim significativamente para aprofundar as questões da integração retroviral no genoma humano, assim como para inferir sobre a segurança da utilização de vectores virais em doenças hereditárias da pele

Lipid signalling in grapevine resistance against fungal pathogens

Grapevine (Vitis vinifera L) is one of the most economically important crops worldwide, mostly due to its uses for wine and table grape production. However, it is prone to several diseases. Downy and powdery mildews and grey mold, caused by Plasmopara viticola, Erisiphe necator and Botrytis cinerea, respectively, are among the most devastating ones. Disease control strategies include phytochemical applications every growing season, jeopardizing the sustainability of viticulture. Understanding the molecular processes behind disease resistance or susceptibility is vital to define alternative control strategies and select new disease resistance traits for breeding programs. The identification of molecular markers that allow discriminating tolerant and susceptible grapevine genotypes to their pathogens is an important step to help breeders select genotypes for crossings to produce hybrids with good winemaking and disease tolerance traits. Lipids and lipid-derived metabolites are not only major structural and metabolic constituents of the cell, but they also function as modulators of a multitude of signal transduction pathways evoked by biotic stresses. It has been proposed that specific fatty acids (FA) may be involved in plant resistance against pathogens with different colonization strategies (biotroph, hemibiotroph and necrotroph). Previous results indicate that the content of several FA suffers alterations at early time-points after grapevine inoculation with the biotrophic oomycete Plasmopara viticola. These alterations are linked with reactive oxygen species and Jasmonic acid (JA) associated signalling. Moreover, lipid molecules and their derivatives, including JA, when applied externally, can cause a modulation of the lipid and FA signalling mechanisms in a similar manner to the pathogen challenge. Plants that are exposed to these elicitor molecules show a quicker and more intense defence response upon contact with a pathogen. The extracellular matrix (ie apoplast) is the first battlefield where pathogen recognition occurs and secretion of both defence molecules and pathogen effectors take place. Therefore, the apoplast is one of the most important cell compartments in plant-pathogen interaction. Nonetheless, despite our knowledge on apoplast involvement on several processes from cell growth to stress responses, its dynamics is still poorly known due to the lack of efficient extraction processes adequate to each plant system. Because apoplastic fluid extraction from woody plants is a challenging task, studies regarding grapevine apoplast are still scarce to this day. There are two published studies on the grapevine leaf apoplast proteome and none on its metabolome. In this work, the problems raised above were addressed. The analysis of the constitutive lipid and FA composition of tolerant and susceptible grapevine genotypes to P. viticola was carried out, along with the expression analysis of FA desaturase (FAD) genes. These studies allowed to identify lipids and FA as potential biomarkers for tolerance or susceptibility to P. viticola. The saturated FA, mainly in monogalactosyldiacylglycerol and phosphatidyl choline are candidate tolerance biomarkers and the polyunsaturated linoleic acid (C18:2) as well as the plastidial lipids are candidate susceptibility biomarkers. Moreover, the higher expression levels of FAD4, FAD6 and FAD8 in susceptible genotypes suggest that they might also be considered as candidate biomarkers for susceptibility. The analysis of the total leaf FA composition revealed corroborating results in terms of FA saturation degree and FAD expression, and it is a more rapid and less costly approach (discussed in the chapters II and III). Due to the relevance of the JA mediated lipid signalling in the grapevine-P. viticola interaction, another question that raised was whether this mechanism would be conserved in the interaction with other pathogens with different invasion and/or lifestyles. Therefore, the FA modulation events, crucial for JA synthesis and signalling, were also addressed in the grapevine interaction with E. necator (biotroph, invading the plant leaf in the adaxial page from wound apertures) and B. cinerea (necrotroph). While the interaction with the biotrophs may trigger a higher synthesis of polyunsaturated FA (PUFA) at early time-points with a tendency to return to basal levels, the interaction with B. cinerea may trigger a later and more durable induction of PUFA synthesis. In all interactions, membrane fluidity modulation occurred, which may be crucial to maintain cellular function during infection (discussed in chapter IV). Since lipid molecules and JA showed previously to play important roles in the grapevine defence responses to P. viticola, the potential role of this molecule as a FA signalling trigger was studied. In fact, FA modulation after JA elicitation is similar to that described previously after P. viticola inoculation even in a susceptible cultivar, highlighting the potential of this molecule as an alternative to prevent grapevine diseases (discussed in chapter V). To uncover the lipid signalling events of the first moments of plant pathogen interaction, a thorough analysis of the apoplastic fluid is necessary. A new methodological approach to isolate grapevine leaf apoplast compatible with proteomic and lipidomic based studies was defined. The constitutive metabolome was assessed by FTICR-MS, which allowed the identification of 514 unique putative compounds revealing a broad spectrum of molecular classes. Among them, lipids are the most abundant molecular class. This methodology represents an optimization to the existing protocols and opens the way to study the lipid signalling events in the first battlefield of the grapevine-pathogen interaction (discussed in chapter VI). This work allowed to bring us a few steps closer to the complete disclosure of the grapevine lipid mediated defence mechanisms highlighting also candidate molecules to be used in future breeding programs for disease tolerance

Status and conservation of Madeiran Storm-petrel Oceanodroma castro in Farilhão Grande, Berlengas, Portugal: relevance to the management plan of this protected area

Tese de mestrado. Biologia (Ecologia e Gestão Ambiental). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013A ordem Procellariiformes é uma das mais diversas das aves marinhas do mundo, podendo variar entre os grandes albatrozes, que podem atingir os 11kg, e os pequenos paínhos, que podem chegar a pesar 20g. Estas aves são geralmente cosmopolitas e sociais, e apresentam-se distribuídas por todos os oceanos do mundo. Taxonomicamente, a ordem Procellariiformes está num estado de fluxo, com novas e enigmáticas espécies a surgir dentro de populações de taxa conhecidos. Muitas das espécies de Procellariiformes são migradoras de longa distância, e algumas delas estão entre as mais numerosas do planeta. Algumas espécies desta ordem estão entre as espécies de aves mais ameaçadas do mundo. Existem atualmente 125 espécies de Procellariifomes reconhecidas, e quase metade dessas espécies apresentam estatuto de conservação Crítico, Em perigo ou Vulnerável, de acordo com os critérios da International Union for Conservation of Nature (IUCN). Entre as ameaças existentes está a perturbação humana e risco de introdução de espécies predadoras nas colónias, a poluição luminosa, a captura acidental por redes de pesca e, ainda que exista baixo risco de colisão, os moinhos de energia eólica são outra das ameaças. A sua baixa produtividade anual, longa época de reprodução, tardia maturação reprodutiva e grande longevidade torna-os vulneráveis às perturbações. A exploração direta também é uma conhecida ameaça que pode levar à extinção colónias inteiras. A disponibilidade de ninhos adequados nas ilhas não habitadas e livres de predadores que ainda restam está de algum modo a limitar o tamanho das populações reprodutoras mundiais. Os arquipélagos dos Açores, da Madeira e das Berlengas são extremamente importantes para as aves marinhas, e albergam várias colónias de Procellariiformes importantes, incluindo espécies endémicas. Nos Açores nidifica a maior população do Atlântico de Cagarra Calonectris diomedea borealis. Na ilha da Madeira nidifica a única colónia do mundo de Freira-da-Madeira Pterodroma madeira, que tem estatuto de conservação de Em perigo, e nidifica também nesta ilha a maior população de Portugal e Macaronésia de Bobo-pequeno Puffinus puffinus. Os arquipélagos das Desertas e das Selvagens, classificados como Reserva Natural, albergam a única população da Europa de Freira-do-bugio Pterodroma deserta e a maior população do Atlântico de Alma Negra Bulweria bulwerii. Nas Selvagens nidifica a maior colónia mundial de Cagarra. O arquipélago das Berlengas é a área de nidificação mais importante para aves marinhas em Portugal Continental, albergando as únicas colónias conhecidas de Procellariiformes do continente, e a maior colónia de Gaivota-de-patas-amarelas Larus michahellis do país. O arquipélago das Berlengas faz parte da Reserva Natural da Berlenga, protegida por lei desde 1981. A Área de Proteção Especial para as Aves Selvagens foi criada nas Berlengas, e integrada na Rede Natura 2000, sendo depois expandida em 2012. Uma área com o dobro do tamanho da presente Área de Proteção Especial, que a inclui, foi identificada pela Sociedade Para o Estudo das Aves (SPEA) como uma Área Importante para as Aves e o arquipélago foi ainda declarado uma Reserva da Biosfera pela UNESCO em 2011. Apesar da avifauna marinha que se reproduz na costa portuguesa ser modesta quando comparada com outros sectores costeiros da Europa, a zona costeira de Portugal é influenciada por ventos de norte e ventos de sudoeste tropicais-temperados, e dá lugar a fenómenos de upwelling, que tornas as águas altamente produtivas. Estes fatores contribuem para as características únicas da costa portuguesa. O Roque-de-castro Oceanodroma castro apresenta uma população mundial de 150000 aves, distribuída por arquipélagos dos oceanos Atlântico e Pacífico. Em Portugal Continental a espécie apenas foi encontrada no arquipélago das Berlengas, no grupo dos Farilhões. Nos Açores, apesar de se pensar que existiam duas populações de Roque-de-castro (uma “de verão” e uma “de inverno”), um estudo recente revelou que se tratavam de duas espécies, e assim surgiu o Paínho-de-Monteiro Oceanodroma monteiroi. O Roque-de-castro reproduz-se durante os meses frios e tende a nidificar em ilhas isoladas livres de predadores. No Farilhão os ninhos encontram-se em fendas nas rochas ou debaixo de Chorão. A espécie foi descoberta nos Farilhões em 1980 por um faroleiro, mas só descrita oficialmente em 1983, e é a única colónia reprodutora que existe perto da Europa Continental. O Farilhão é um ilhéu não habitado e isolado, livre de predadores e onde existem também colónias reprodutoras de Cagarra Calonectris diomedea borealis, Gaivota-de-patas-amarelas Larus michahellis e Corvo-marinho-de-crista Phalacrocorax aristotelis A época de reprodução do Roque-de-castro no Farilhão Grande tem início em Setembro/Outubro e termina em Janeiro/Fevereiro. Apesar do seu estatuto de conservação global ser Pouco preocupante, o Roque-de-castro apresenta estatuto Vulnerável em Portugal Continental, por ser uma espécie colonial com uma população pequena, com uma área de ocupação reduzida em apenas um local. Tendo em conta a falta de informação atual existente sobre a população de Roque-de-castro no Farilhão Grande, tentámos neste trabalho avaliar o tamanho da população reprodutora no ilhéu, avaliar o sucesso reprodutor da época de 2011-2012, além da avaliação da ocupação dos ninhos implementados em 2002-2003. Tentámos ainda com este trabalho verificar se existia, e qual era, o impacto da população de Gaivotas-de-patas-amarelas sobre a população de Roque-de-castro no Farilhão Grande. Com o objetivo de aumentar o número de locais de nidificação disponíveis para o Roque-de-castro, foram construídos mais ninhos artificiais. Os resultados deste trabalho sugerem que a população de Roque-de-castro do Farilhão Grande se tem mantido relativamente estável desde a sua descoberta em 1980, e verificou-se também que não existem atualmente ameaças diretas à população, mas devem ser tomadas medidas de prevenção. O método de escutas noturnas é útil para avaliar as variações anuais na abundância da população da ilha, mas por si só não permite obter uma estimativa do tamanho da população. Esta técnica é muito útil para avaliar a abundância relativa de aves na colónia ao longo da época de reprodução. Fatores como a fase da lua, o vento e a fase da época reprodutora podem influenciar as contagens de vocalizações, mas neste caso só se verificou o efeito da fase da época reprodutora, com o pico de abundância de Roque-de-castro no Farilhão em Outubro de 2012, que corresponde à fase de postura dos ovos. A população de Roque-de-castro no Farilhão Grande foi estimada através do método de Lincoln, com base nos dados de captura-marcação-recaptura de Outubro de 2012, em cerca de 500 indivíduos. Tanto este método como o de vocalizações apresentam erro relativamente à estimativa da população nidificante, pois os indivíduos não-reprodutores representam uma proporção variável da taxa de captura. Foram encontrados 68 ninhos no Farilhão Grande, resultado de uma contagem feita em Outubro de 2012, mas o número total de ninhos deve ser muito mais elevado, pois há uma grande área do ilhéu de difícil acesso, o que não permitiu a contagem. No entanto, a área prospetada neste trabalho foi muito superior à de trabalhos anteriores, e há que ter isso em conta em comparações com resultados desses trabalhos. A avaliação dos tipos de ninhos de Roque-de-castro presentes no Farilhão Grande revelou que estas aves apresentam preferência por ninhos em substrato de rocha, e por ninhos em rocha protegidos por Chorão. Verificou-se também que estas aves dão preferência a ninhos de entrada pequena, onde estão mais protegidos de perturbação e predação. Foram construídos 36 novos ninhos artificiais e espera-se que venham a ser ocupados nas próximas épocas reprodutoras. A estimativa da população de Gaivota-de-patas-amarelas revelou que esta diminuiu ligeiramente desde os últimos censos. Após a avaliação da dieta das gaivotas através da análise de regurgitações, concluiu-se que estas não representam atualmente uma ameaça para a população de Roque-de-castro. O Chorão, apesar de ser uma planta exótica invasora introduzida pelo homem, e ocupar uma grande parte da superfície do Farilhão Grande, revelou-se importante para o ilhéu, pois protege-o da erosão, conservando o habitat de nidificação do Roque-de-castro, e das outras aves que aqui nidificam. As técnicas usadas neste trabalho devem ser reproduzidas em trabalhos futuros neste ilhéu, com esta colónia, de modo a permitir uma monitorização contínua da população de Roque-de-castro no Farilhão Grande. A população nidificante de Roque-de-castro dos Farilhões é pequena, o que suscita preocupações de conservação, e recomenda-se ações que permitam o aumento da população. As medidas de gestão e conservação sugeridas devem ser usadas também em outras colónias de Procellariiformes, com características semelhantes, e onde a disponibilidade de habitat de nidificação esteja restrita ou comprometida.The order Procellariiformes is one of the most diverse orders of seabirds of the world. They are generally colonial and spread over all the oceans. Some species are among the most numerous, but some are among the most threatened seabird species of the world. The threats to Procellariiformes include human disturbance and risk of introduction of predatory species, light pollution and bycatch. The Portuguese archipelagos (Azores, Madeira and Berlengas) are very important to seabirds and house several colonies of Procellariiformes. The Berlengas archipelago is the most important area for seabirds in Portugal, harboring the only known mainland colonies of Procellariiformes, and the biggest colony of Yellow-legged Gull Larus michahellis in the country. The Madeiran Storm-petrel Oceanodroma castro has a worldwide distribution, over the Atlantic and Pacific oceans. In Portugal mainland it is only found in the Berlengas archipelago, in the small islet Farilhão Grande. The Madeiran Storm-petrel breeds during the cold months, in isolated, predator free islands. Although its worldwide population has a conservation status of Least Concern, in Portugal mainland this species is classified as Vulnerable. This work aimed to assess the status of the population of Madeiran Storm-petrel in Farilhão Grande, to improve the nesting habitat availability on the island by building artificial nests, and assess the effect of the population of Yellow-legged Gull on the population of Madeiran Storm-petrel. The results of this work suggest a relatively stable population of Madeiran Storm-petrel since its discovery in 1980, and that currently there are no direct threats to the population, nevertheless preventive measures are advised. The population and the artificial nests should be monitored regularly to evaluate the success of this habitat management measure. The measures suggested in this paper could be used in other colonies of Procellariiformes, where the availability of nesting habitat is reduced or compromised