Neue Wege zur rekombinanten Oligomerisierung von Peptiden und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9-Komplex

Das Ziel dieser Arbeit war der Aufbau und die Etablierung eines rekombinanten Oligomerisierungsverfahrens von Peptiden und kleinen Proteinen über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex. Das System sollte in Hinsicht auf die Generierung bispezifischer Oligomere, der Oligomerisierung von Proteinen, der Bindung und Modulation pharmazeutisch relevanter Rezeptoren und der chemischen Funktionalisierung untersucht werden. Im ersten Abschnitt der Arbeit erfolgte der Aufbau eines robusten Expressionsystems zur Bereitstellung funktionaliserter Tim10/9‐Komplexe. Es war möglich sowohl ein bicistronisches als auch ein duales Expressionssystem zu etablieren. Beide Systeme stellten funktionalisierte Tim10/Tim9‐Komplexe für weitere Analysen in ausreichender Mengen bereit. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Integrität der hexameren Struktur bei N‐ oder C‐terminaler Fusion einer Passagierdomäne an die Tim9‐ oder Tim10‐Untereinheit erhalten bleibt. Der zweite Abschnitt beschäftigte sich mit der Generierung biofunktionaler Tim10/Tim9‐Komplexe. Dabei war es möglich sowohl pseudozyklische Peptide, als auch Cystin‐Knoten‐Mikroproteine über Fusion an den Tim10/Tim9‐Komplex zu oligomeriseren. Es konnte gezeigt werden, dass durch die Oligomeriserung eines VEGFR‐2 spezifischen Bindepeptids über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex eine höhere Affinität gegenüber dem Rezeptor erreicht werden kann. Zudem war es durch die Kombination ErbB2‐ und VEGFR‐2‐bindender Tim10/Tim9‐Komplexe möglich eine bispezifische Variante herzustellen. Bei der Inhibition beider Signaltransduktionswege konnte in verschiedenen Arbeiten ein synergistischer Effekt in Bezug auf die Supression von Tumorwachstum erzielt werden. Als Vertreter der Proteinfamilie konnten hinsichtlich ihrer Faltung komplexe Cystin‐Knoten‐Mikroproteine oligomerisiert werden. Die verwendete Variante ET‐TP‐020 stimulierte in oligomeriserter Form die Proliferation von M‐07e Zellen (humane Megakaryoblasten). Die Stimulation der Zellproliferation setzt eine Darreichung des Bindeproteins in oligomerer Form voraus. Diese Ergebnisse zeigen an, dass die in dieser Arbeit generierten Komplexe auch im zellulären Kontext eine oligomerisierungsabhängige Aktivität aufweisen. Im letzten Abschnitt wurde die Möglichkeit der spezifischen chemischen Funktionalisierung untersucht. Dabei konnte ein Verfahren aufgebaut werden, das durch Oxidation des durch Spaltung mit TEV‐Protease erhaltenen N‐terminalen Serins zu einer Aldehydfunktion eine spezifische Kopplung von Hydrazid‐ oder Thiosemicarbazidderivaten ermöglicht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kopplung eines Fluorescein‐5‐Thiosemicarbazids spezifisch an die Tim10‐Untereinheit erfolgt und die Integrität des Tim10/Tim9‐Komplexes erhalten bleibt. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass eine rekombinante Oligomeriserung pharmazeutisch relevanter Peptide und Proteine über den mitochondrialen Tim10/Tim9‐Komplex möglich ist und die Oligomeriserung zu einer besseren Affinität konjugierter Peptide führen kann. Das hier vorgestellte System ermöglicht zudem eine gerichtete chemische Funktionalisierung bereits rekombinant funktionalisierter mitochondrialer Tim10/Tim9‐Komplexe

Enhanced stability of a chimeric hepatitis B core antigen virus-like-particle (HBcAg-VLP) by a C-terminal linker-hexahistidine-peptide

Abstract Background Virus-like-particles (VLPs) are attractive nanoparticulate scaffolds for broad applications in material/biological sciences and medicine. Prior their functionalization, specific adaptations have to be carried out. These adjustments frequently lead to disordered particles, but the particle integrity is an essential factor for the VLP suitability. Therefore, major requirements for particle stabilization exist. The objective of this study was to evaluate novel stabilizing elements for functionalized chimeric hepatitis B virus core antigen virus-like particles (HBcAg-VLP), with beneficial characteristics for vaccine development, imaging or delivery. Results The effects of a carboxy-terminal polyhistidine-peptide and an intradimer disulfide-bridge on the stability of preclinically approved chimeric HBcAg-VLPs were assessed. We purified recombinant chimeric HBcAg-VLPs bearing different modified C-termini and compared their physical and chemical particle stability by quantitative protein-biochemical and biophysical techniques. We observed lower chemical resistance of T = 3- compared to T = 4-VLP (triangulation number) capsids and profound impairment of accessibility of hexahistidine-peptides in assembled VLPs. Histidines attached to the C-terminus were associated with superior mechanical and/or chemical particle stability depending on the number of histidine moieties. A molecular modeling approach based on cryo-electron microscopy and biolayer interferometry revealed the underlying structural mechanism for the strengthening of the integrity of VLPs. Interactions triggering capsid stabilization occur on a highly conserved residue on the basis of HBcAg-monomers as well as on hexahistidine-peptides of adjacent monomers. This new stabilization mechanism appears to mimic an evolutionary conserved stabilization concept for hepadnavirus core proteins. Conclusions These findings establish the genetically simply transferable C-terminal polyhistidine-peptide as a general stabilizing element for chimeric HBcAg-VLPs to increase their suitability

Arranged sevenfold: structural insights into the C-terminal oligomerization domain of human C4b-binding protein.

The complement system as a major part of innate immunity is the first line of defense against invading microorganisms. Orchestrated by more than 60 proteins, its major task is to discriminate between host cells and pathogens and to initiate immune response. Additional recognition of necrotic or apoptotic cells demands a fine-tune regulation of this powerful system. C4b-binding protein (C4BP) is the major inhibitor of the classical complement and lectin pathway. The crystal structure of the human C4BP oligomerization domain in its 7α isoform and molecular simulations provide first structural insights of C4BP oligomerization. The heptameric core structure is stabilized by intermolecular disulfide bonds. In addition, thermal shift assays indicate that layers of electrostatic interactions mainly contribute to the extraordinary thermodynamic stability of the complex. These findings make C4BP a promising scaffold for multivalent ligand display with applications in immunology and biological chemistry

Pathogenesis of POLR1C-dependent type 3 treacher collins syndrome revealed by a zebrafish model

[[abstract]]Treacher Collins Syndrome (TCS) is a rare congenital birth disorder (1 in 50,000 live births) characterized by severe craniofacial defects, including the downward slanting palpebral fissures, hypoplasia of the facial bones, and cleft palate (CP). Over 90% of patients with TCS have a mutation in the TCOF1 gene. However, some patients exhibit mutations in two new causative genes, POLR1C and POLR1D, which encode subunits of RNA polymerases I and III, that affect ribosome biogenesis. In this study, we examine the role of POLR1C in TCS using zebrafish as a model system. Our data confirmed that polr1c is highly expressed in the facial region, and dysfunction of this gene by knockdown or knock-out resulted in mis-expression of neural crest cells during early development that leads to TCS phenotype. Next generation sequencing and bioinformatics analysis of the polr1c mutants further demonstrated the up-regulated p53 pathway and predicted skeletal disorders. Lastly, we partially rescued the TCS facial phenotype in the background of p53 mutants, which supported the hypothesis that POLR1C-dependent type 3 TCS is associated with the p53 pathway