Dynamic chromatin association of RCC1 during the cell cycle

Ein räumlicher Aktivitätsgradient des kleinen G-Proteins Ran ist ein bedeutender Kontrollmechanismus von grundlegenden zellulären Prozessen wie dem Transport zwischen Kern und Cytoplasma, dem Aufbau des mitotischen Spindelapparats und der Bildung der Kernhülle. Die Entstehung dieses Gradienten verlangt eine räumliche Trennung der entgegenwirkenden enzymatischen Aktiviäten des Ran-spezifischen Guaninnukleotid- Austauschfaktors RCC1 und des Ran-spezifischen GTPase aktivierenden Proteins Ran- GAP. Die Interaktion von RCC1 mit Chromatin ist eine Vorraussetzung hierfür, indem sie RCC1 von dem sich im Cytoplasma befindlichen RanGAP trennt. Darüber hinaus beein usst die Chromatininteraktion möglicherweise die enzymatische Aktivität von RCC1 und bewirkt eine räumliche Kopplung der Reaktion zwischen Ran und RCC1 an Chromatin. Die Regulation der Chromatininteraktion von RCC1 ist deswegen ein potentieller Mechanismus, die Aktivierung von Ran in Abhängigkeit des Zellzyklus zu regulieren. Um diese Hypothese zu überprüfen, wird in der vorliegenden Arbeit eine Untersuchung der kinetischen Eigenschaften der Chromatininteraktion von RCC1 durchgeführt. Die Messung der Mobilität von RCC1 auf molekularer Ebene durch Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) erlaubt Rückschlüsse auf den Mechanismus der Chromatininteraktion. Ein Vergleich der Verteilung von RCC1 zwischen Chromatin und Zytoplasma und der durch FCS gemessen Mobilität zeigt, dass an Chromatin gebundenes RCC1 zwei verschiedene Mobilitätszustände einnehmen kann. Es kann unterschieden werden zwischen RCC1, das in einem eindimensionalen Prozess entlang der Chromatinfaser diffundiert, und RCC1, das für einen kurzen Zeitraum an spezifischen Stellen gebunden ist. Die quantitative Analyse der FCS-Messungen ermöglicht eine Bestimmung der Di usionkonstante des mobilen Zustands sowie der Dissoziationsrate des gebundenen Zustands. Durch Messung der Mobilität von Ran wird gezeigt, dass die Interaktionskinetik zwischen Ran und Chromatin mit der Reaktionskinetik zwischen Ran und RCC1 korreliert. Weiterhin stärken Messungen der Interaktion von Ran und RCC1 mittels Fluoreszenzkreuzkorrelationsspektroskopie (FCCS) die Hypothese, dass die Reaktion zwischen beiden Proteinen an Chromatin gekoppelt ist. Insbesondere weisen die hier vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass der binäre Komplex zwischen Ran und RCC1, ein wichtiges enzymatisches Intermediat, an Chromatin gebunden ist. Der Vergleich zwischen Mobilitätsmessungen während der Interphase und während der Zellteilung demonstriert eine zellzyklusabhängige Regulation der Chromatininteraktion von RCC1. Diese äu ert sich in einer verringerten Dissoziationsrate des fest gebundenden Zustands von RCC1. Des Weiteren kann während der Zellteilung eine verringerte Interaktion zwischen RCC1 und Ran gemessen werden. Hieraus wird abschlie end die Hypothese abgeleitet, dass durch eine Regulation der Bindungseigenschaften des fest gebundenen Zustands von RCC1 eine Verringerung der Reaktionsrate zwischen Ran und RCC1 erreicht wird

FIP200 Claw Domain Binding to p62 Promotes Autophagosome Formation at Ubiquitin Condensates

The autophagy cargo receptor p62 facilitates the condensation of misfolded, ubiquitin-positive proteins and their degradation by autophagy, but the molecular mechanism of p62 signaling to the core autophagy machinery is unclear. Here, we show that disordered residues 326–380 of p62 directly interact with the C-terminal region (CTR) of FIP200. Crystal structure determination shows that the FIP200 CTR contains a dimeric globular domain that we designated the “Claw” for its shape. The interaction of p62 with FIP200 is mediated by a positively charged pocket in the Claw, enhanced by p62 phosphorylation, mutually exclusive with the binding of p62 to LC3B, and it promotes degradation of ubiquitinated cargo by autophagy. Furthermore, the recruitment of the FIP200 CTR slows the phase separation of ubiquitinated proteins by p62 in a reconstituted system. Our data provide the molecular basis for a crosstalk between cargo condensation and autophagosome formation

Purification and Activity Testing of the Full-Length YycFGHI Proteins of Staphylococcus aureus

Background: The YycFG two-component regulatory system (TCS) of Staphylococcus aureus represents the only essential TCS that is almost ubiquitously distributed in Gram-positive bacteria with a low G+C-content. YycG (WalK/VicK) is a sensor histidine-kinase and YycF (WalR/VicR) is the cognate response regulator. Both proteins play an important role in the biosynthesis of the cell envelope and mutations in these proteins have been involved in development of vancomycin and daptomycin resistance. Methodology/Principal Findings: Here we present high yield expression and purification of the full-length YycG and YycF proteins as well as of the auxiliary proteins YycH and YycI of Staphylococcus aureus. Activity tests of the YycG kinase and a mutated version, that harbours an Y306N exchange in its cytoplasmic PAS domain, in a detergent-micelle-model and a phosholipid-liposome-model showed kinase activity (autophosphorylation and phosphoryl group transfer to YycF) only in the presence of elevated concentrations of alkali salts. A direct comparison of the activity of the kinases in the liposomemodel indicated a higher activity of the mutated YycG kinase. Further experiments indicated that YycG responds to fluidity changes in its microenvironment. Conclusions/Significance: The combination of high yield expression, purification and activity testing of membrane and membrane-associated proteins provides an excellent experimental basis for further protein-protein interaction studies an

Optics and Quantum Electronics

Contains table of contents for Section 3 and reports on twenty-one research projects.Joint Services Electronics Program Contract DAAL03-89-C-0001Joint Services Electronics Program Contract DAAL03-92-C-0001U.S. Air Force - Office of Scientific Research Contract F49620-91-C-0091Charles S. Draper Laboratories Contract DL-H-441629MIT Lincoln LaboratoryCharles S. Draper Laboratories, Inc. Contract DL-H-418478Fujitsu LaboratoriesNational Science Foundation Grant ECS 90-12787National Center for Integrated PhotonicsNational Science Foundation Grant EET 88-15834National Science Foundation Grant ECS 85-52701U.S. Air Force - Office of Scientific Research Contract F49620-88-C-0089U.S. Navy - Office of Naval Research Contract N00014-91-C-0084U.S. Navy - Office of Naval Research Grant N00014-91-J-1956Johnson and Johnson Research GrantNational Institutes of Health Contract 2-R01-GM35459U.S. Department of Energy Grant DE-FG02-89 ER14012-A00

Optics and Quantum Electronics

Contains table of contents for Section 2 and reports on eleven research projects.Joint Services Electronics Program Contract DAAL03-89-C-0001National Science Foundation Grant EET 87-00474U.S. Air Force - Office of Scientific Research Contract F49620-88-C-0089Charles S. Draper Laboratory Contract DL-H-404179National Center for Integrated PhotonicsNational Science Foundation Grant ECS 87-18417NEC Research InstituteNational Science Foundation Grant ECS 85-52701Medical Free Electron Laser Program Contract N00014-86-K-0117National Institutes of Health Grant 5-RO1-GM35459Lawrence Livermore National Laboratory Contract B048704U.S. Department of Energy Grant DE-FG02-89-ER14012Columbia University Contract P016310

Regulation of Signaling at Regions of Cell-Cell Contact by Endoplasmic Reticulum-Bound Protein-Tyrosine Phosphatase 1B

Protein-tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) is a ubiquitously expressed PTP that is anchored to the endoplasmic reticulum (ER). PTP1B dephosphorylates activated receptor tyrosine kinases after endocytosis, as they transit past the ER. However, PTP1B also can access some plasma membrane (PM)-bound substrates at points of cell-cell contact. To explore how PTP1B interacts with such substrates, we utilized quantitative cellular imaging approaches and mathematical modeling of protein mobility. We find that the ER network comes in close proximity to the PM at apparently specialized regions of cell-cell contact, enabling PTP1B to engage substrate(s) at these sites. Studies using PTP1B mutants show that the ER anchor plays an important role in restricting its interactions with PM substrates mainly to regions of cell-cell contact. In addition, treatment with PTP1B inhibitor leads to increased tyrosine phosphorylation of EphA2, a PTP1B substrate, specifically at regions of cell-cell contact. Collectively, our results identify PM-proximal sub-regions of the ER as important sites of cellular signaling regulation by PTP1B