A Novel Reliable and Efficient Procedure for Purification of Mature Osteoclasts Allowing Functional Assays in Mouse Cells

Osteoclasts (OCLs) are multinucleated phagocytes of monocytic origin responsible for physiological and pathological bone resorption including aging processes, chronic inflammation and cancer. Besides bone resorption, they are also involved in the modulation of immune responses and the regulation of hematopoietic niches. Accordingly, OCLs are the subject of an increasing number of studies. Due to their rarity and the difficulty to isolate them directly ex vivo, analyses on OCLs are usually performed on in vitro differentiated cells. In this state, however, OCLs represent a minority of differentiated cells. Since up to date a reliable purification procedure is still lacking for mature OCLs, all cells present in the culture are analyzed collectively to answer OCL-specific questions. With the development of in-depth transcriptomic and proteomic analyses, such global analyses on unsorted cells can induce severe bias effects in further results. In addition, for instance, analysis on OCL immune function requires working on purified OCLs to avoid contamination effects of monocytic precursors that may persist during the culture. This clearly highlights the need for a reliable OCL purification procedure. Here, we describe a novel and reliable method to sort OCLs based on cell multinucleation while preserving cell viability. Using this method, we successfully purified multinucleated murine cells. We showed that they expressed high levels of OCL markers and retained a high capacity of bone resorption, demonstrating that these are mature OCLs. The same approach was equally applied for the purification of human mature OCLs. Comparison of purified OCLs with mononucleated cells or unsorted cells revealed significant differences in the expression of OCL-specific markers at RNA and/or protein level. This exemplifies that substantially better outcomes for OCLs are achieved after the exclusion of mononucleated cells. Our results clearly demonstrate that the in here presented procedure for the analysis and sorting of pure OCLs represents a novel, robust and reliable method for the detailed examination of bona fide mature OCLs in a range that was previously impossible. Noteworthy, this procedure will open new perspectives into the biology of osteoclasts and osteoclast-related diseases

Caractérisation des ostéoclastes inflammatoires : Nouvelles cibles thérapeutiques dans les maladies inflammatoires chroniques

Osteoclasts (OCLs) are multinucleated cells responsible for physiological bone resorption and pathological bone destruction in osteoporosis and chronic inflammation. Recently, our team demonstrated that besides bone resorption, OCLs are immunocompetent cells that, depending on their origin and inflammatory status, induce different immune responses. In steady state, OCLs derive from bone marrow monocytes (MNs) and initiate regulatory CD4+ T cells (tolerogenic OCLs/t-OCLs), while during inflammation, OCLs originate from blood-derived inflammatory Ly6Chigh MNs or dendritic cells and induce TNF producing CD4+ T cells (inflammatory OCLs/i-OCLs). However, the phenotype and the exact role of i-OCLs in inflammatory bone loss remain unknown. Therefore, this thesis aims to better characterize i-OCLs in order to understand how they contribute to different inflammatory processes and whether they can be specifically targeted to limit inflammatory bone destruction. At the beginning of this work, reliable sorting and analysis strategies for OCLs were missing. Therefore, we developed a novel, robust sorting procedure to exclude impeding mononucleated precursors to investigate pure populations of mature OCLs. This new sorting procedure enabled us for the first time to compare pure populations of t-OCLs and i-OCLs in a transcriptomic approach by RNA sequencing in order to better characterize them and to identify specific markers. Our data show that i-OCLs preferentially use the osteoclastogenic pathway associated with Ig-like receptors and upregulate genes and pathways involved in anti-microbial (in particular anti-fungal) responses. Activation of downstream receptor signaling using receptor-specific agonists or yeast probiotics specifically blocked the differentiation of i-OCLs without interfering with t-OCLs in vitro and in vivo. These findings reveal new regulatory mechanisms in inflammatory bone loss and demonstrate for the first time that it is possible to specifically inhibit a subset of OCLs without affecting the other. Moreover, our data also highlight the protective effect of yeast probiotics in pathological bone destruction.Les ostéoclastes (OCLs) sont des cellules multinucléées responsables de la résorption osseuse physiologique et de la perte osseuse pathologique dans l'ostéoporose et l'inflammation chronique. Récemment, notre équipe a démontré que, les OCLs sont également des cellules immunocompétentes qui, selon leur origine et leur état inflammatoire, induisent différents types de réponse immune. En condition normale, les OCLs dérivent des monocytes (MNs) de la moelle osseuse et activent des lymphocytes T CD4+ régulateurs (OCLs tolérogéniques/t-OCLs). En condition inflammatoire, les OCLs proviennent des MNs inflammatoires ou des cellules dendritiques et activent des lymphocytes T CD4+ producteurs de TNF (OCLs inflammatoires/i-OCLs). Cependant, le phénotype et le rôle exact des i-OCLs dans la perte osseuse inflammatoire restent inconnus. Ce travail de thèse vise donc à mieux caractériser les i-OCL afin de comprendre comment ils contribuent aux différents processus inflammatoires et s'ils peuvent être ciblés spécifiquement pour limiter la destruction osseuse inflammatoire. Au début de ce travail, il n'existait aucune stratégie fiable pour purifier et analyser spécifiquement les OCLs matures. Nous avons donc établi une nouvelle méthode robuste de tri permettant l'étude de populations pures d'OCLs matures. Nous avons ainsi pu pour la première fois comparer les t-OCLs et i-OCLs purifiés dans une approche transcriptomique par séquençage d'ARN afin de mieux les caractériser et d'identifier des marqueurs spécifiques. Nos données montrent que les i-OCLs utilisent de façon plus importante la voie de différenciation ostéoclastique associée aux récepteurs Ig-like et surexpriment les gènes et les voies associées à la réponse immunitaire contre les microorganismes, en particulier les levures. L'activation de la signalisation des récepteurs à l'aide d'agonistes spécifiques des récepteurs ou de probiotiques de levure bloque spécifiquement la différenciation des i-OCLs sans interférer avec les t-OCLs in vitro et in vivo. Ces résultats révèlent de nouveaux mécanismes régulateurs de la perte osseuse inflammatoire et démontrent pour la première fois qu'il est possible d'inhiber certaines population d'OCLs sans affecter les autres. Ils établissent aussi l'effet protecteur des probiotiques de levure dans la destruction osseuse pathologique. Conformément à nos résultats précédentes, l'analyse par séquençage d'ARN a identifié le récepteur fractalkine CX3CR1 surexprimé dans les i-OCLs. Cependant, seule une faible proportion (25%) des i-OCLs expriment CX3CR1 (CX3CR1+). Nous avons déterminé le rôle des i-OCLs CX3CR1+ et CX3CR1neg par profilage transcriptomique et essais fonctionnels et montré que ces deux populations d'i-OCLs diffèrent significativement dans leur fonction de résorption et immunitaire. Nos résultats démontrent que les i-OCLs CX3CR1neg jouent un rôle inflammatoire majeur tandis que les i-OCLs CX3CR1+ sont des cellules immunosuppressives qui contrôlent l'inflammation. Ces résultats soulignent l'hétérogénéité des OCLs qui mérite d'être étudiée plus en détail.Cette thèse contribue à une compréhension approfondie des i-OCLs et des voies moléculaires sous-jacentes impliquées dans l'immunomodulation par les OCLs. Elle ouvre également une vision thérapeutique très nouvelle basée sur l'inhibition sélective de certaines sous-population d'OCLS pour lutter contre les pathologies associées à une destruction osseuse inflammatoire

Characterization of inflammatory osteoclasts : New therapeutic targets in chronic inflammatory diseases

Les ostéoclastes (OCLs) sont des cellules multinucléées responsables de la résorption osseuse physiologique et de la perte osseuse pathologique dans l'ostéoporose et l'inflammation chronique. Récemment, notre équipe a démontré que, les OCLs sont également des cellules immunocompétentes qui, selon leur origine et leur état inflammatoire, induisent différents types de réponse immune. En condition normale, les OCLs dérivent des monocytes (MNs) de la moelle osseuse et activent des lymphocytes T CD4+ régulateurs (OCLs tolérogéniques/t-OCLs). En condition inflammatoire, les OCLs proviennent des MNs inflammatoires ou des cellules dendritiques et activent des lymphocytes T CD4+ producteurs de TNF (OCLs inflammatoires/i-OCLs). Cependant, le phénotype et le rôle exact des i-OCLs dans la perte osseuse inflammatoire restent inconnus. Ce travail de thèse vise donc à mieux caractériser les i-OCL afin de comprendre comment ils contribuent aux différents processus inflammatoires et s'ils peuvent être ciblés spécifiquement pour limiter la destruction osseuse inflammatoire. Au début de ce travail, il n'existait aucune stratégie fiable pour purifier et analyser spécifiquement les OCLs matures. Nous avons donc établi une nouvelle méthode robuste de tri permettant l'étude de populations pures d'OCLs matures. Nous avons ainsi pu pour la première fois comparer les t-OCLs et i-OCLs purifiés dans une approche transcriptomique par séquençage d'ARN afin de mieux les caractériser et d'identifier des marqueurs spécifiques. Nos données montrent que les i-OCLs utilisent de façon plus importante la voie de différenciation ostéoclastique associée aux récepteurs Ig-like et surexpriment les gènes et les voies associées à la réponse immunitaire contre les microorganismes, en particulier les levures. L'activation de la signalisation des récepteurs à l'aide d'agonistes spécifiques des récepteurs ou de probiotiques de levure bloque spécifiquement la différenciation des i-OCLs sans interférer avec les t-OCLs in vitro et in vivo. Ces résultats révèlent de nouveaux mécanismes régulateurs de la perte osseuse inflammatoire et démontrent pour la première fois qu'il est possible d'inhiber certaines population d'OCLs sans affecter les autres. Ils établissent aussi l'effet protecteur des probiotiques de levure dans la destruction osseuse pathologique. Conformément à nos résultats précédentes, l'analyse par séquençage d'ARN a identifié le récepteur fractalkine CX3CR1 surexprimé dans les i-OCLs. Cependant, seule une faible proportion (25%) des i-OCLs expriment CX3CR1 (CX3CR1+). Nous avons déterminé le rôle des i-OCLs CX3CR1+ et CX3CR1neg par profilage transcriptomique et essais fonctionnels et montré que ces deux populations d'i-OCLs diffèrent significativement dans leur fonction de résorption et immunitaire. Nos résultats démontrent que les i-OCLs CX3CR1neg jouent un rôle inflammatoire majeur tandis que les i-OCLs CX3CR1+ sont des cellules immunosuppressives qui contrôlent l'inflammation. Ces résultats soulignent l'hétérogénéité des OCLs qui mérite d'être étudiée plus en détail.Cette thèse contribue à une compréhension approfondie des i-OCLs et des voies moléculaires sous-jacentes impliquées dans l'immunomodulation par les OCLs. Elle ouvre également une vision thérapeutique très nouvelle basée sur l'inhibition sélective de certaines sous-population d'OCLS pour lutter contre les pathologies associées à une destruction osseuse inflammatoire.Osteoclasts (OCLs) are multinucleated cells responsible for physiological bone resorption and pathological bone destruction in osteoporosis and chronic inflammation. Recently, our team demonstrated that besides bone resorption, OCLs are immunocompetent cells that, depending on their origin and inflammatory status, induce different immune responses. In steady state, OCLs derive from bone marrow monocytes (MNs) and initiate regulatory CD4+ T cells (tolerogenic OCLs/t-OCLs), while during inflammation, OCLs originate from blood-derived inflammatory Ly6Chigh MNs or dendritic cells and induce TNF producing CD4+ T cells (inflammatory OCLs/i-OCLs). However, the phenotype and the exact role of i-OCLs in inflammatory bone loss remain unknown. Therefore, this thesis aims to better characterize i-OCLs in order to understand how they contribute to different inflammatory processes and whether they can be specifically targeted to limit inflammatory bone destruction. At the beginning of this work, reliable sorting and analysis strategies for OCLs were missing. Therefore, we developed a novel, robust sorting procedure to exclude impeding mononucleated precursors to investigate pure populations of mature OCLs. This new sorting procedure enabled us for the first time to compare pure populations of t-OCLs and i-OCLs in a transcriptomic approach by RNA sequencing in order to better characterize them and to identify specific markers. Our data show that i-OCLs preferentially use the osteoclastogenic pathway associated with Ig-like receptors and upregulate genes and pathways involved in anti-microbial (in particular anti-fungal) responses. Activation of downstream receptor signaling using receptor-specific agonists or yeast probiotics specifically blocked the differentiation of i-OCLs without interfering with t-OCLs in vitro and in vivo. These findings reveal new regulatory mechanisms in inflammatory bone loss and demonstrate for the first time that it is possible to specifically inhibit a subset of OCLs without affecting the other. Moreover, our data also highlight the protective effect of yeast probiotics in pathological bone destruction

A Novel Reliable and Efficient Procedure for Purification of Mature Osteoclasts Allowing Functional Assays in Mouse Cells

International audienc

Immune Function and Diversity of Osteoclasts in Normal and Pathological Conditions

International audienc

Dissecting the phenotypic and functional heterogeneity of mouse inflammatory osteoclasts by the expression of Cx3cr1

International audienceBone destruction relies on interactions between bone and immune cells. Boneresorbing osteoclasts (OCLs) were recently identified as innate immune cells activating T cells toward tolerance or inflammation. Thus, pathological bone destruction not only relies on increased osteoclast differentiation, but also on the presence of inflammatory OCLs (i-OCLs), part of which express Cx3cr1. Here, we investigated the contribution of mouse Cx3cr1 + and Cx3cr1 neg i-OCLs to bone loss. We showed that Cx3cr1 + and Cx3cr1 neg i-OCLs differ considerably in transcriptional and functional aspects. Cx3cr1 neg i-OCLs have a high ability to resorb bone and activate inflammatory CD4 + T cells. Although Cx3cr1 + i-OCLs are associated with inflammation, they resorb less and have in vitro an immune-suppressive effect on Cx3cr1 neg i-OCLs, mediated by PD-L1. Our results provide new insights into i-OCL heterogeneity. They also reveal that different i-OCL subsets may interact to regulate inflammation. This contributes to a better understanding and prevention of inflammatory bone destruction

Osteoclasts contribute to early development of chronic inflammation by promoting dysregulated hematopoiesis and myeloid skewing

Increased myelopoiesis is a hallmark of many chronic inflammatory diseases. However, the mechanisms involved in the myeloid skewing of hematopoiesis upon inflammation are still incompletely understood. Here, we identify an unexpected role of bone-resorbing osteoclasts in promoting hematopoietic stem cell (HSC) proliferation and differentiation towards myeloipoiesis in the early phases of chronic colitis. RNAseq analysis revealed that osteoclasts in colitis differ from control ones and overexpress genes involved in the remodeling of HSC niches. We showed that colitic osteoclasts modulate the interaction of HSCs with their niche and promote myeloid differentiation. Increased osteoclast activity was correlated with an augmentation of myelopoiesis in patients with chronic colitis. Therapeutic blockade of osteoclasts reduced HSC proliferation and myeloid skewing and resulted in a decreased inflammation and severity of colitis. Together, these data identify osteoclasts as potent regulators of HSCs and promising target in chronic colitis

Specific targeting of inflammatory osteoclastogenesis by the probiotic yeast S. boulardii CNCM I-745 reduces bone loss in osteoporosis.

Bone destruction is a hallmark of chronic inflammation, and bone-resorbing osteoclasts arising under such a condition differ from steady-state ones. However, osteoclast diversity remains poorly explored. Here, we combined transcriptomic profiling, differentiation assays and in vivo analysis in mouse to decipher specific traits for inflammatory and steady-state osteoclasts. We identified and validated the pattern-recognition receptors (PRR) Tlr2, Dectin-1, and Mincle, all involved in yeast recognition as major regulators of inflammatory osteoclasts. We showed that administration of the yeast probiotic Saccharomyces boulardii CNCM I-745 (Sb) in vivo reduced bone loss in ovariectomized but not sham mice by reducing inflammatory osteoclastogenesis. This beneficial impact of Sb is mediated by the regulation of the inflammatory environment required for the generation of inflammatory osteoclasts. We also showed that Sb derivatives as well as agonists of Tlr2, Dectin-1, and Mincle specifically inhibited directly the differentiation of inflammatory but not steady-state osteoclasts in vitro. These findings demonstrate a preferential use of the PRR-associated costimulatory differentiation pathway by inflammatory osteoclasts, thus enabling their specific inhibition, which opens new therapeutic perspectives for inflammatory bone loss.Agence Nationale de la Recherche ANR-16-CE14-0030 Henri-Jean Garchon Henri-Jean GarchonFondation pour la Recherche Medicale ECO20160736019 Maria-Bernadette MadelAgence Nationale de la Recherche ANR-15-IDEX-01 Maria-Bernadette MadelThe funders had no role in study design, data collection and interpretation, or the decision to submit the work for publication.S