Biosynthesis of rare methylglucose lipopolysaccharides in rapidly-growing mycobacteria : characterization of a key hydrolase

Dissertação de mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Mycobacterium tuberculosis is the most infamous member among mycobacteria, although this genus already contains over 160 species, many of which opportunistic pathogens. These nontuberculous mycobacteria (NTM) are ubiquitous inhabitants of soils and waters and the cause of atypical infections frequently acquired in natural and man-made environments namely water distribution systems and hospitals. The emergence of drug- and disinfectant-resistant strains claims for urgent measures to fight these pathogens. The adaptive success and resilience of mycobacteria is intimately associated to a lipid-rich cell wall that includes a thick layer of mycolic acids, which is impermeable to many antimicrobial agents and an effective barrier to host defenses. Mycobacteria produce unique polymers namely the intracellular polysaccharides of methylglucose (MGLP) or methylmannose (MMP), which have indirect but crucial involvement in cell wall biogenesis as they modulate the synthesis of fatty-acids, the precursors of mycolic acids. Although MGLPs and MMPs have been discovered decades ago, only recently have their biosynthetic pathways been investigated at the genetic detail. The primer for MGLP synthesis is glucosylglycerate (GG), which was shown to accumulate during growth in nitrogen-starved M. smegmatis but not in nitrogen-rich medium. The addition of a nitrogen source to nitrogen-restricted cultures led to depletion of GG, implying the existence of an enzyme for its hydrolysis. We selected M. hassiacum to investigate the fate of GG during growth in nitrogen-depleted versus nitrogen-rich media. Since a hydrolase with GG-hydrolytic activity had recently been described in thermophilic bacteria, we probed this organism’s genome and cloned the homologous gene. The purified recombinant GG hydrolase (GgH) specifically hydrolysed GG to glucose and glycerate at 42ºC and pH 5.7 (optimal conditions), with Mg2+ and KCl significantly enhancing activity and GgH stability. The enzyme exhibited Michaelis-Menten kinetics at 37, 42 and 50ºC with comparable catalytic efficiencies. The purified GgH showed a single 51.2 kDa band on denaturing electrophoresis, but behaved as a dimeric protein in solution with a molecular mass of about 108.9 ± 2.6 kDa in size-exclusion chromatography. Since GgH activity likely depletes cellular GG and may represent a regulatory node in MGLP biosynthesis, the understanding of the regulation of its expression by nitrogen fluctuations is crucial. The unique biochemical features of a novel enzymatic function reported here, furthers our knowledge of mycobacterial metabolism, physiology and lifestyle, and may lead to new strategies to fight infections caused by these ominous bacteria.Mycobacterium tuberculosis é a espécie mais ameaçadora do género Mycobacterium, que à data inclui mais de 160 espécies, na sua maioria espécies ambientais designadas não-tuberculosas (MNT), que podem ser patogénios oportunistas. As MNT são habitantes ubíquos de solos e águas de ambientes naturais ou artificiais, incluindo sistemas de distribuição de águas e hospitais. O surgimento de estirpes resistentes a antibióticos e desinfectantes reforça a necessidade urgente de medidas para combater infecções provocadas por estes patógenios. O sucesso adaptativo e resiliência das micobactérias está intimamente associado à sua parede celular rica em lípidos, que inclui uma espessa camada de ácidos micólicos, o que a torna uma estrutura impermeável a agentes antimicrobianos e uma importante barreira contra defesas dos hospedeiros. As micobactérias sintetizam polímeros únicos, incluindo os polissacáridos intracelulares de metilglucose (MGLP) e de metilmanose (MMP), que têm um papel crucial na biogénese da parede, uma vez que modulam a síntese de ácidos gordos, os precursores dos ácidos micólicos. Embora o MGLP e o MMP tenham sido descobertos há décadas, só recentemente as suas vias de biossíntese foram investigadas ao nível genético. O precursor da síntese do MGLP é glucosilglicerato (GG), um metabolito acumulado por M. smegmatis em condições limitantes de azoto. A adição de uma fonte de azoto levou à diminuição dos níveis de GG, implicando a existência de uma enzima dedicada à hidrólise deste composto. Seleccionámos M. hassiacum para investigar a dinâmica de acumulação de GG durante o crescimento em meio com limitação de azoto versus meio rico em azoto. Uma vez que foi recentemente identificada uma enzima capaz de hidrolisar GG, o gene homólogo de M. hassiacum foi detectado no genoma e clonado. A GG hidrolase (GgH) recombinante hidrolisa GG em glucose e glicerato a 42ºC e pH 5.7 (condições óptimas). Os iões Mg2+ e KCl potenciam a actividade e a estabilidade da GgH. A enzima exibe cinética Michaelis-Menten a 37, 42 e 50ºC com eficiência catalítica comparável. A GgH apresenta-se com 51.2 kDa em gel desnaturante, mas comporta-se como um dímero de massa 108.9 ± 2.6 kDa em solução. Sendo a GgH a possível responsável pelo consumo do GG intracelular e pela regulação da biossíntese do MGLP, estudos futuros para melhor compreender a regulação da expressão deste gene durante flutuações de azoto são essenciais. As características bioquímicas desta enzima descritas neste trabalho, contribuem para o conhecimento do metabolismo, da fisiologia e do modo de vida micobacteriano, podendo levar ao desenvolvimento de estratégias para combater as infecções provocadas por micobactérias

Prevalência de ombro doloroso e estado funcional do ombro em indivíduos vítimas de AVC

Os objectivos deste trabalho foram verificar qual a prevalência de Ombro Doloroso e qual o estado funcional e dor em pacientes após AVC . Utilizou-se o Shoulder Pain and Disability Index (SPADI) para avaliação da dor e funcionalidade. A prevalência de Ombro Doloroso foi de 43,4%, relacionando-se uma maior intensidade da dor a piores níveis de funcionalidade do ombro e com a precocidade do tratamento. Concluiu-se quanto mais cedo se iniciou o tratamento de fisioterapia após o AVC menor foi a intensidade da dor e melhores foram os níveis de funcionalidade. The aims of this work were verify prevalence of Shoulder Pain and the functional state of the shoulder in patients after the stroke. For this study was used the Shoulder Pain and Disability Index (SPADI). The prevalence of Shoulder Pain is 43, 4%, bigger intensity of Pain and the worst levels of functionality of the shoulder and the precocity of the treatment. We concluded that as soon as the physiotherapy treatment started after the stroke, the intensity of the pain was lower and the levels of functionality were better

New trends in store atmosphere: an application to the banking sector

In the context of intense competition in the current marketplace, the enhancement of store atmosphere appeared as a strategy that could provide differentiation to retailers and, at the same time, stimulate the interest and satisfaction of consumers. Considering this, the main purpose of this dissertation is to investigate the application of new store atmosphere trends in the Portuguese banking sector as a way to improve the in-store customer experience. The trends under study are the introduction of interactive screens, the digitalisation of customer-employee interaction, the development of co-creation platforms and the implementation of store mood zones inside the banking facility. The research purpose was accomplished through a comprehensive study of relevant literature followed by an empirical research with a qualitative and exploratory methodological approach. Findings provided evidence that most of the suggested store atmosphere trends would improve the pleasantness of the banking spaces, and therefore, should be implemented. However, changes in store atmosphere should not be done abruptly (e.g. implement all the trends in one establishment), to avoid dramatic variations in customers’ perception of these financial spaces. Therefore, the study proposes the development of a sustained balance between a banking atmosphere which is able to transmit rigour and seriousness, and, at the same time, a feeling of relaxation and comfort to customers. Subsequently, in order to thrive, Marketing researchers and banking managers should have this information in mind and act accordingly to it. Ultimately, they should understand the importance of store atmosphere and how it affects the overall customer experience.Dado o contexto atual de intensa competição no mercado, a melhoria do ambiente de loja apareceu como uma estratégia que poderia oferecer diferenciação aos retalhistas e, ao mesmo tempo, estimular o interesse e a satisfação dos consumidores. Neste seguimento, o principal objetivo desta dissertação é investigar a implementação de novas tendências de atmosfera de loja no sector bancário Português de forma a melhorar a experiência do cliente dentro na loja. As tendências estudadas são a introdução de ecrãs interativos, a digitalização da interação entre o cliente e o empregado, o desenvolvimento de plataformas de co-criação e a implementação de “mood zones” dentro do estabelecimento bancário. O objetivo desta pesquisa foi conseguido através de um estudo abrangente da literatura relevante, seguido de uma pesquisa empírica com uma abordagem metodológica qualitativa e exploratória. As descobertas comprovaram que a maioria das tendências sugeridas iriam melhorar a agradabilidade dos espaços bancários, e, portanto, deveriam ser implementadas. No entanto, alterações na atmosfera de loja não deverão ser feitas de forma abrupta (por exemplo, implementar todas as tendências num único estabelecimento), de forma a evitar variações dramáticas na perceção dos clientes sobre os espaços financeiras. Portanto, o estudo propõe o desenvolvimento de um equilíbrio sustentável entre uma atmosfera bancária capaz de transmitir rigor e seriedade, e, ao mesmo tempo, uma sensação de relaxamento e conforto aos clientes. Posteriormente, a fim de prosperar, os profissionais de Marketing e gestores bancários devem ter esta informação em mente e agir em conformidade. Em última análise, deve ser entendida a importância do ambiente da loja e a sua influência na experiência do consumidor

The impact of retailtainment on purchase intentions

Entertainment in retail – retailtainment - has been taking the retail industry by storm in the last twenty years. Professionals in this area have understood that the right use of decoration, lights, sound, scents, unique experiences and entertainment options influences the customer’s mood, which in turn can influence their purchase intentions. The main goal of this dissertation is to understand if retailtainment causes a positive impact on customers’ purchase intentions, specifically in supermarket purchases. The developed hypotheses intend to test the effect of entertainment frequency – permanent and special or temporary – and the level of arousal – low and high – on three variables: customer satisfaction, store image and retailer loyalty. Finally, it is intended to measure the effect of these variables on purchase intentions with low-involvement – the customer quickly chooses the product to buy and there are no costs when he changes the chosen brand or supplier. Thus, an online questionnaire was designed and shared in order to collect data on the experiences of participants in their last visit to the supermarket. The survey aims to understand current views on supermarket entertainment and what improvements can be made in this regard. The collected data was analysed in the SPSS program. The main conclusions allow us to verify the similarities and differences between the effect of entertainment in malls and supermarkets and represent relevant information for food retail professionals.O entretenimento no retalho – retailtainment – tem sido uma revolução na indústria do retalho nos últimos vinte anos. Os profissionais nesta área perceberam que o uso apropriado de decoração, luzes, sons, cheiros, experiências e entretenimento influenciam o humor do cliente, o que pode interferir nas suas intenções de compra. O principal objetivo desta dissertação é compreender se há um impacto positivo do retailtainment nas intenções de compra dos consumidores, nomeadamente nas compras de supermercado. As hipóteses desenvolvidas pretendem testar o efeito da frequência do entretenimento - permanente e especial ou temporário – e o nível de estímulo – baixo e alto – em três variáveis: satisfação do cliente, imagem da loja e lealdade ao retalhista. Por fim, pretende-se aferir o efeito destas variáveis nas intenções de compras com pouco envolvimento – o cliente escolhe rápido o produto que quer comprar e não há custos quando altera a marca ou fornecedor escolhido. Assim foi elaborado e partilhado um questionário online com o intuito de recolher dados sobre as experiências dos participantes no último supermercado visitado. O inquérito pretende perceber a opinião atual sobre o entretenimento no supermercado e que melhorias podem ser feitas neste aspeto. Os dados recolhidos foram analisados no programa SPSS. As principais conclusões permitem verificar as similaridades e diferenças entre o efeito do entretenimento nos centros comerciais e nos supermercados e representam informação relevante para os profissionais do retalho alimentar

The impact of adult neurogenesis in mood disorders

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, 2021, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.A neurogénese adulta consiste na síntese de novos neurónios em zonas específicas do cérebro adulto. As células estaminais neuronais, presentes quer no sistema nervoso central em desenvolvimento, quer no adulto, são classificadas como células multipotentes e atuam como ponto de partida para a neurogénese. Os neurónios recém-sintetizados no cérebro adulto parecem atuar em funções importantes, como o olfato, a reparação tecidular, a memória, a aprendizagem e a regulação do humor. Curiosamente, fatores como a idade, o stress, a dieta rica em gorduras, o exercício físico, a restrição calórica, o enriquecimento ambiental e a interação/suporte social influenciam fortemente o processo de neurogénese adulta. As doenças de humor são um grupo de doenças psiquiátricas, das quais se destaca a depressão major. De facto, a depressão major afeta mundialmente um número significativo de indivíduos, sendo que parte deles não responde aos tratamentos atuais. Além disso, esta doença encontra-se associada a uma morbilidade elevada. São várias as hipóteses que pretendem explicar a fisiopatologia da depressão major, nomeadamente a hipótese monoaminérgica, inflamatória e neurotrófica. Nos últimos anos a hipótese neurogénica tem emergido, na qual a depressão pode resultar da redução do processo de neurogénese adulta. Efetivamente, estudos post-mortem revelaram a existência de menor proliferação celular, que constitui uma das etapas da neurogénese adulta, no hipocampo de doentes deprimidos. Adicionalmente, tem-se verificado que os fatores que afetam a neurogénese adulta, como o stress, os hábitos alimentares, o exercício físico, a restrição calórica, o enriquecimento ambiental e a interação social, impactam de forma semelhante a depressão. A descoberta de que terapêutica antidepressiva crónica estimula a neurogénese hipocampal adulta e que esta é requerida para parte das melhorias comportamentais dos antidepressivos fortalece a hipótese neurogénica da depressão, permitindo estabelecer uma ligação entre a neurogénese adulta e a depressão major. No entanto, os mecanismos subjacentes à relação neurogénese adulta-depressão não estão ainda esclarecidos. Nesta monografia irei abordar o papel de vias de sinalização, nomeadamente a via de sinalização Wnt, JNK e CREB na regulação da neurogénese adulta durante a depressão major. O esclarecimento futuro destes mecanismos moleculares será um passo importante nesta área da ciência, permitindo a identificação de alvos terapêuticos inovadores e mais eficazes para o tratamento da depressão major.Adult neurogenesis consists in the synthesis of new neurons in specific areas of the adult brain. Neural stem cells, present in both the developing and adult central nervous system, are classified as multipotent cells and act as a starting point for neurogenesis. Newly synthesized neurons in the adult brain appear to have such important functions as olfaction, tissue repair, memory, learning, and mood regulation. Interestingly, factors as age, stress, high-fat diet, exercise, calorie restriction, environmental enrichment and social interaction/support were shown to deeply influence adult neurogenesis process. Mood disorders are a group of psychiatric illnesses, of which major depressive disorder stands out. In fact, major depressive disorder affects a significant number of individuals worldwide, some of whom do not respond to current antidepressant treatments. Furthermore, it is associated with high morbidity. There are several hypotheses that try to explain the pathophysiology of major depressive disorder, namely the monoaminergic, inflammatory and neurotrophic hypothesis. In recent years, the neurogenic hypothesis has emerged, in which depression may result from a reduction in adult neurogenesis. Indeed, post-mortem studies revealed the existence of reduced cell proliferation, one of the stages of adult neurogenesis, in the hippocampus of depressed patients. Additionally, it has been found that factors that affect adult neurogenesis, i.e., stress, high-fat diet, physical exercise, calorie restriction, environmental enrichment and social interaction, similarly impact major depressive disorder. The discovery that chronic antidepressant treatment stimulates adult hippocampal neurogenesis and that this is required for part of the behavioral improvements of antidepressants strengthens the neurogenic hypothesis of depression, allowing a link to be established between adult neurogenesis and major depressive disorder. However, the mechanisms underlying the adult neurogenesis-depression relationship are not clear. In this monograph, it will be addressed and discussed the role of signaling pathways, namely the Wnt, JNK and CREB signaling pathways in mediating adult neurogenesis in major depressive disorder. The future understanding of these molecular mechanisms will be an important step in this area of science, contributing to the identification of innovative and effective therapeutic targets for the treatment of major depressive disorder

Entre a Perturbação Obsessivo-Compulsiva e a Psicose

Introduction: Obsessive-compulsive disorder is an heterogeneous condition in which periods of altered perception or delusions may arise. Similarly, individuals with psychotic disorders may have obsessive-compulsive symptoms. Case report: A male adolescent presented to the Emergency Department (ED) with obsessive symptomatology with three months of evolution. Three weeks later, he returned to the ED showing symptom worsening and reporting delusions, being admitted to the inpatient unit to clarify the diagnosis. No positive symptoms were reported during hospitalization. During follow-up, the patient reported an episode of apparent delusional perception that he associated with the beginning of symptoms, again raising the question of whether a psychotic episode was present. Discussion/Conclusions: The distinction between obsessive-compulsive disorder and psychosis is not always clear, with obsessive-compulsive disorder being a significant comorbidity in patients with a first psychotic episode. Close patient assessment is required for early diagnosis and appropriate intervention.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Internationalization strategy of labirinto Shoes to Tokyo, Japan

Field lab: SME competitivenes

Engaging sports fans in social media : a case study : SC Braga

The importance of the role of communication in society is unquestionably large. It has been evolving over many years. Nowadays, systems of communication include the telephone, the cellphone, radio, television and social media. Social media is an undeniably growing phenomenon. It is so, whether it be for individuals or companies/institutions alike. Social media platforms are those that gather individuals in online mediums where unregulated information can be shared by all with access to said platforms. This dissertation explores both the dangers and the advantages of such media use, especially how important it can be in a context as large as sports, more specifically soccer. A convenience sampling questionnaire corroborated already existing studies on the use of social media by sports fans, that proved that social media is a very efficient tool for maintain fan loyalty and most team sympathizers do actively use the platforms both to gather information and for personal entertainment. Data collected over a course of about ten months (soccer season 2018/2019) from the SC Braga’s Instagram account also came to some interesting conclusions about content with which people engaged the most and the least over the season. Topics that called out matters of compassion for other individuals proved to have a bigger impact on SC Braga’s Instagram followers and matters related to sponsorships/publicity were the least engaged with topics. Two interesting conclusions are the relative independence of fan reactions to sports results, and the fast reactions to posts significant to club successA importância do papel da comunicação na sociedade é inquestionavelmente grande. Tem evoluído ao longo de muitos anos. Atualmente, os sistemas de comunicação incluem o telefone, o telemóvel, a rádio, a televisão e as redes sociais. As redes sociais são um fenômeno inegavelmente crescente. Assim o é, tanto para indivíduos como para empresas/instituições. As plataformas sociais são aquelas que reúnem indivíduos em meios on-line, onde informações não regulamentadas podem ser compartilhadas por todos com acesso às referidas plataformas. Esta dissertação explora os perigos e as vantagens do uso das redes sociais, especialmente a importância que ela pode ter num contexto tão grande como o desporto, mais especificamente o futebol. Um questionário de amostragem por conveniência corroborou estudos já existentes sobre o uso das redes sociais por fãs de desporto, que provaram que as redes sociais são uma ferramenta muito eficiente para manter a lealdade dos fãs e a maioria dos simpatizantes de uma equipa usa ativamente as plataformas para obter informações e para entretenimento pessoal. Os dados recolhidos ao longo de um período de cerca de dez meses (temporada de futebol 2018/2019) na conta do Instagram do SC Braga também chegaram a algumas conclusões interessantes sobre o conteúdo com o qual as pessoas se envolveram mais e menos durante a temporada. Os tópicos que destacaram questões de compaixão por outras pessoas provaram ter um impacto maior nos seguidores do SC Braga no Instagram e os assuntos relacionados a patrocínios/publicidade foram os que menos interação tiveram. Duas conclusões interessantes referem-se à independência das reações dos adeptos dos resultados desportivos e a forma como os adeptos reagem a publicações pontuais relativas a factos com elevado potencial de sucesso

Elucidar o papel dos proteomas estatísticos no cancro em humanos

Doutoramento em BiomedicinaDeregulation of various components of the protein synthesis machinery, including tRNAs, aminoacyl-tRNA synthetases and tRNA modifying enzymes, are common in tumors, raising the hypothesis that protein synthesis accuracy is compromised in cancer. To clarify this hypothesis, we determined the relative error rate of protein synthesis and observed that tumors mistranslate at higher levels than normal tissue. To understand the role of mistranslation in tumor biology, we expressed mutant Ser-tRNAs that misincorporate Ser-at-Ala (frequent error) and Ser-at-Leu (infrequent error) sites in NIH3T3 cells. The tRNA that misincorporated Ser-at-Ala codon sites induced tumor growth with similar kinetics of K-rasV12 expressing tumors. Upregulation of the AKT pathway and differential activation of the UPR, depending on the tRNA being expressed, were also observed. However, these studies did not clarify the role of tRNA deregulation or tRNA misreading in tumor initiation or progression. For this, a WT-Ser tRNA and a tRNA that misincorporates Ser-at-Ala codon sites were expressed in cells derived from normal bronchial epithelium (BEAS-2B) and in cells derived from a Large cell lung carcinoma (H460). The BEAS-2B cell lines studies showed that increased cell proliferation in vitro, increased protein synthesis rate and activation of UPR biomarkers, which were dependent on the recombinant tRNA being expressed. Both tRNA constructs increased colony formation capacity in vitro. Interestingly, the data suggest that upregulation of the WT Ser-tRNA is sufficient to trigger tumor formation, albeit with very slow growth kinetics. When the same tRNAs were expressed in H460 cells, tumor growth kinetics and local invasion potential of the cells increased. Finally, upregulation of the WT-Ser tRNA decreases tumor cell sensitivity to cisplatin treatment. The overall study highlights new features of tRNA function in tumor biology and open new avenues to explore the role of protein synthesis in cancer.A desregulação dos componentes da maquinaria de síntese proteica, tais como tRNAs, aminoacil-tRNA sintetases, e enzimas modificadoras dos tRNAs, é comum em tumores, levantando a hipótese de que a fidelidade da síntese proteica pode estar comprometida em tumores. Para clarificar esta hipótese, determinámos a taxa de erro da síntese proteica e observámos que os tumores produzem mais erros na síntese de proteínas que os tecidos normais. De modo a compreender o papel dos erros de tradução na biologia tumoral, expressámos tRNAs de Serina mutantes que incorporam Ser em locais de Ala (erro frequente) e Ser em locais de Leu (erro raro) na linha celular NIH3T3. O tRNA que incorpora Ser em locais de Ala, promoveu o crescimento tumoral com uma cinética semelhante à induzida pela mutação K-rasV12. A activação da via AKT e a activação diferencial da UPR, dependendo do tRNA expresso, também foram observadas. No entanto, a expressão dos tRNAs mutantes nas linha celulares derivadas das NIH3T3 não permitiu clarificar o papel dos tRNAs recombinantes na iniciação ou na progressão tumoral. Para tal, expressámos um tRNA de Serina WT e o tRNA mutante insere Ser em locais de Ala em células derivadas de epitélio bronquial normal, BEAS-2B, e em células derivadas de Carcinoma de células grandes do pulmão, H460. A expressão destes tRNAs na linha celular normal, aumentou a proliferação celular, a taxa de síntese proteica e a activação de biomarcadores da via da UPR, a qual é dependente do tRNA expresso. Ambos os tRNAs favoreceram a formação de colónias in vitro. O aumento da expressão do tRNA de Serina WT foi suficiente para iniciar a formação de tumores de crescimento lento. Quando expressámos os mesmos tRNAs nas células tumorais H460, observámos um aumento na cinética de crescimento tumoral e no potencial de invasão local das células, embora os resultados obtidos não permitam tirar uma conclusão definitiva acerca do envolvimento dos tRNAs na progressão tumoral. O aumento da expressão do tRNA de Serina WT torna células tumorais mais resistentes ao tratamento com cisplatina. De um modo geral, os nossos resultados sugerem que a desregulação de tRNAs e o aumento dos erros da síntese proteica são importantes para a biologia dos tumores

Implementating sustainability initiatives in the supply chain: the case of Lisbon urban hotels

The issue of sustainability is increasingly more relevant for businesses, including in the Hospitality—Lodging industry, owing to its negative environmental impact. This industry is also economically important for Portugal, particularly in Lisbon. The present study investigates the degree of implementation of sustainability initiatives throughout the supply chain of 4-and 5-star urban hotels in Lisbon. A survey was sent to 54hotels, yielding 25 responses. The results show most surveyed hotels are at a low level of implementation, though with interest to move towards a medium level. Future research could explore other regions and lodging categories