Identification of biomarkers in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Tese de mestrado em Biologia Molecular e Genética, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2015A Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa fatal e de rápida progressão, caracterizada pela degeneração dos neurónios motores do córtex motor, tronco cerebral e medula espinhal. A maioria dos doentes desenvolve ELA entre os 40 e 70 anos de idade e o diagnóstico baseia-se na observação clínica e testes neurofisiológicos. Os principais sintomas são fraqueza e paralisia progressiva de todos os músculos. Entre 90-95% dos casos de ELA são esporádicos (não têm base genética) e os restantes 5-10% dos casos são familiares e de transmissão autossómica dominante. De entre as mutações características de ELA familiar, cerca de 20% ocorrem no gene que codifica para a enzima Cu/Zn superóxido dismutase 1 (SOD1). Uma vez alterada a actividade enzimática da SOD1, ocorre um aumento dos níveis de anião superóxido, o que contribui para o stresse oxidativo celular. De facto, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam mutações na SOD1, às quais acresce desregulação da actividade enzimática do glutatião peroxidase, glutatião reductase e desidrogenase da glucose-6-fosfato. A etiologia da doença é ainda desconhecida mas o stresse oxidativo, disfunções no transporte axonal e nas mitocôndrias, excitotoxicidade induzida por glutamato e neuroinflamação são alguns dos mecanismos apontados para explicar a degeneração dos neurónios motores. Actualmente, falta ainda esclarecer três questões de máxima importância em respeito a esta incapacitante doença: compreender a sua etiologia, identificar biomarcadores moleculares que possam ajudar no diagnóstico e descobrir uma terapêutica efectiva. Os glóbulos vermelhos transportam oxigénio dos pulmões para os tecidos e dióxido carbono destes para os pulmões, contribuindo também para a regulação da viscosidade sanguínea através da captação e libertação de agentes vasoactivos, como o monóxido de azoto (NO), e da modulação das propriedades mecânicas. O NO é uma molécula sinalizadora produzida no sistema nervoso central que modula a actividade neurológica e o fluxo sanguíneo. Uma vez que participa no stresse oxidativo, o NO medeia mecanismos de neuroprotecção e neurotoxicidade. Como factor neurotóxico, promove o stresse oxidativo através da sua reacção com o anião superóxido para formar peroxinitrito e, consequentemente, outros metabolitos reactivos. Estas espécies reactivas de monóxido de azoto (RNOS) podem induzir a quebra de cadeias de DNA, peroxidação lipídica, nitração e nitrosilação de proteínas, disfunção mitocondrial e apoptose, contribuindo para os processos de neuroinflamação, descritos na ELA. Uma vez sintetizado pela enzima endotelial constitutiva, denominada sintase do monóxido de azoto (eNOS), o NO pode difundir para as células musculares lisas adjacentes ou para o lúmen vascular. Uma vez no músculo liso, leva a relaxamento muscular. Quando difundido para o lúmen vascular, o NO é capturado pelos glóbulos vermelhos, que o armazenam e libertam, regulando assim a agregação e deformabilidade eritrocitárias, afectando a capacidade que estas células têm em circular pelos capilares. O influxo de NO para o eritrócito faz-se inicialmente por ligação à proteína de membrana band-3 e depende do grau de fosforilação da mesma. Uma vez dentro do glóbulo vermelho, o NO conjuga-se com a hemoglobina, dependendo do seu grau de desnaturação, e com oxigénio, induzindo a produção de metahemoglobina. É da combinação do NO com as diferentes moléculas e proteínas existentes no eritrócito que resultam o S-nitrosoglutatião (GSNO), nitritos e nitratos, compostos relativamente inertes. O GSNO é produzido pela conjugação do glutatião com o NO dentro do eritrócito e funciona como reservatório, transportador, dador e mediador endógeno de NO, sendo considerado uma molécula antioxidante. Por sua vez, os nitritos e nitratos resultam essencialmente da decomposição dos peroxinitritos, mas também da ligação do NO a oxigénio e hemoglobina. A acetilcolinesterase (AChE) está localizada na membrana externa dos eritrócitos, onde é conhecida como marcador da integridade de membrana dos mesmos, uma vez que ajuda a manter a normal circulação sanguínea e oxigenação dos tecidos. A acetilcolina (ACh) não-neuronal, substracto natural da AChE, poder ser considerada um modulador das propriedades hemoreológicas dos eritrócitos e uma molécula sinalizadora que contribui para a manutenção da homeostasia celular, tendo um papel central na microvasculatura. A ACh existe na circulação sanguínea e actua como efector da vasodilatação, uma vez que estimula a produção de NO pela eNOS, dependendo do grau de integridade da membrana. Desta forma, a ACh também participa na mobilização de NO e seus derivados no eritrócito. Para tal, a ligação da ACh plasmática à AChE da membrana do glóbulo vermelho inicia um mecanismo de transdução de sinal que envolve as proteínas Gi e band-3 de membrana, estimulando o efluxo de NO do eritrócito e a mobilização de nitritos e nitratos. Como mencionado anteriormente, os eritrócitos de doentes com ELA apresentam um excesso de espécies reactivas de oxigénio, o que sugere a implicação das mesmas em funções bioquímicas e hemoreológicas. O objectivo principal deste estudo foi avaliar e comparar os parâmetros hemoreológicos e bioquímicos dos eritrócitos de doentes de ELA com os de dadores saudáveis. Para além disso, o projecto pretendeu identificar um parâmetro que, uma vez aumentado ou diminuído na doença, por comparação à situação fisiológica normal, se pudesse destacar como biomarcador. Para tal, fez-se colheita de amostras sanguíneas de 40 controlos e de 82 doentes de ELA, depois de todos os participantes terem assinado o consentimento informado. Foram feitos testes que estimassem a agregação e deformabilidade eritrocitárias, o efluxo de NO, a actividade enzimática da AChE e as concentrações intraeritrocitárias de nitritos, nitratos e GSNO. Verificou-se que a deformabilidade e actividade da AChE estavam aumentadas nos doentes de ELA por comparação aos controlos. Por outro lado, o efluxo eritrocitário de NO e concentração intraeritrocitária de nitritos foram menores na doença. Não foram observadas diferenças significativas entre o grupo controlo e de doentes quanto à agregação e concentrações intraeritrocitárias de nitratos e GSNO. Porém, considerando exclusivamente os doentes de ELA, foi verificada uma relação entre a concentração de nitritos existente dentro dos eritrócitos e a actividade da AChE, na qual os nitritos, apesar de existirem sempre em baixas concentrações dentro dos glóbulos vermelhos dos doentes, estão aumentados em duas gamas de valores específicos de actividade da AChE. Uma vez que este aumento de nitritos é concordante com o efluxo de NO do eritrócito para os mesmos valores de actividade de AChE, pode ser sugerido um mecanismo compensatório no qual há menos libertação de NO quando os nitritos estão reduzidos no interior do glóbulo vermelho e mais efluxo de NO em valores de AChE para os quais os nitritos existem mais no interior do eritrócito. Foi igualmente demonstrada uma relação entre o efluxo de NO e a Função Respiratória dos participantes, na qual concentrações superiores de NO fora do eritrócito correspondem a uma pior função respiratória. Assim, é legítimo concluir que se o NO fosse mantido no interior do glóbulo vermelho, a Função Respiratória seria mais facilmente assegurada, ou seja, seria benéfico que o eritrócito actuasse como captador e reservatório de NO. Contudo, o estudo mostrou que o NO não é mantido no eritrócito, o que, mais uma vez e considerando o sistema pulmonar, pode ser justificado por um mecanismo compensatório no qual, quando a Função Respiratória está comprometida, o eritrócito liberta mais NO para que este possa ser utilizado pelos tecidos pulmonares. Os resultados do presente estudo indicam que o eritrócito pode contribuir para a biodisponibilidade do NO, apresentando uma deformabilidade favorável num endotélio disfuncional, como o descrito na ELA. Adicionalmente, os resultados sugerem que a AChE do eritrócito possa vir a ser um marcador na ELA. Para tal propõe-se a continuação deste estudo com a introdução de mediadores pró e anti-inflamatórios e a análise da associação com os valores da AChE.Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is a progressive fatal neurodegenerative disease of the motor system. It is characterized by the death of the cortical, brainstem and spinal motor neurons. Most people develop ALS between the ages of 40 and 70 and the diagnosis relies on clinical observation and neurophysiological studies. Major symptoms are weakness, fatigue and progressive paralysis of all muscles. Between 90-95% of ALS cases are sporadic (sALS), without a genetic basis, and the remaining 5-10% cases are familial (fALS) and autosomal dominant inherited. Among these familial ALS mutations, about 20% occur in the gene for copper, zinc-superoxide dismutase (SOD1). When enzymatic activity of SOD1 is affected, the anion superoxide levels increase, generating cellular oxidative stress. In fact, the erythrocytes of patients with ALS present mutant SOD1 and dysregulation of the enzyme activity of glutathione peroxidase, glutathione reductase and glucose-6-phosphate dehydrogenase. At the moment three critical questions are still open: understanding the etiology of the disease, identification of molecular biomarkers and finding effective therapeutic agents. Red Blood Cells (RBCs) transport oxygen to the tissues and carbon dioxide from the tissues. Erythrocytes also contribute to the regulation of vascular tone both by affecting blood viscosity and by capturing and releasing of vasoactive agents, such as nitric oxide (NO). Nitric oxide (NO) is a signalling molecule produced in the central nervous system (CNS) that modulates neurological activity and blood flow. As a participant in oxidative stress, NO can mediate neuroprotection or neurotoxicity. As a neurotoxic factor, NO promotes oxidative stress through its reaction with superoxide anion to form peroxynitrite, and subsequently, other reactive derivatives. As a whole, these Reactive Nitric Oxide Species (RNOS), can induce DNA strand breaks, lipid peroxidation, protein nitration and nitrosylation, mitochondrial damage and cell apoptosis, contributing to neuroinflammation processes, thought to be involved in ALS. Once synthesized in endothelial cells by Endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS), NO can also diffuse to the adjacent smooth muscle cells or to the vascular lumen. When in the muscle, NO leads to muscle relaxation. When diffused to vascular lumen, NO is captured by RBCs that store and release this molecule, regulating erythrocyte aggregation and deformability and affecting their ability to transit across the capillaries. When scavenged by the erythrocyte, NO undergoes various reactions from which GSNO, nitrite and nitrate, relatively inert compounds, are produced. Acetylcholinesterase (AChE) is located on the outer surface of the erythrocyte membrane, where it is known as a marker of membrane integrity, maintaining normal blood rheology and tissue oxygenation. Non-neuronal acetylcholine (ACh) may be regarded as a modulator of erythrocyte hemorheological properties and as an essential cellular signalling molecule that contributes to the maintenance of cellular homeostasis, having a central role in the microvasculature. It exists in blood circulation and acts as an effector of vasodilation, since it stimulates the production of NO from eNOS, depending on the degree of endothelium integrity. ACh may also have an important role in the mobilization of NO and its derivatives in erythrocytes. In this mechanism, binding of circulating ACh with AChE in the erythrocyte membrane initiates a signal transduction mechanism that involves Gi and band 3 proteins, stimulating NO efflux and mobilization of nitrite and nitrate. As mentioned above, the RBCs of ALS patients present an excess of oxygen reactive species, which raises the hypothesis of their implication in erythrocyte biochemical and hemorheological functions. The main objective of this research was to evaluate and compare the biochemical and hemorheological parameters in RBCs of patients with ALS and of healthy donors. Therefore, this project was expected to identify a parameter that once increased or diminished in the disease may serve as a biomarker. To achieve these goals, venous blood samples from 40 healthy donors and 82 ALS patients were collected after formal consent. Tests considering erythrocyte aggregation and deformability, NO efflux, AChE enzymatic activity and intraerythrocytic concentration of nitrite, nitrate and GSNO were performed. Erythrocyte deformability and AChE activity were increased in patients with ALS in comparison to healthy donors. On the other hand, NO efflux and concentration of intraerythrocytic nitrite were lower in the disease. No significant differences were observed on the other parameters studied. However, considering ALS patients, there was a relation between the level of intraerythrocytic nitrite and AChE activity and between the efflux of NO and the Respiratory Function of patients. The results of the present study indicate that erythrocyte may contribute to control the NO bioavailability at microcirculatory level, presenting favourable deformability in the dysfunctional endothelium associated to the disease. Moreover, erythrocyte AChE should be further explored as a potential biomarker for ALS

The Benguela Coastal Low-Level Jet in a Changing Climate

The main focus of this thesis was the study of the Benguela Coastal Low-Level Jet (CLLJ) variability, dynamics and structure, in the present and future climates. A fundamental first step was the development of an improved CLLJ detection algorithm to provide more accurate positive results. The analysis of the Benguela CLLJ was performed initially at a global scale, including the other CLLJ regions, using an ensemble of reanalyses at 0.7o. It was shown that the Benguela CLLJ occurs along the entire year and is characterized by a spatial displacement with two local maxima where the Benguela CLLJ is more frequent (-26oS and -17.5oS). Nonetheless, a more detailed analysis was needed to understand the physical mechanisms behind the occurrence of this coastal jet. The analysis of the present climate and future projections was done through dynamical downscaling at high resolution (25 km) with uncoupled and coupled atmosphere-ocean simulations. At a regional scale the importance of the local forcing in enhancing the frequency of occurrence of the Benguela CLLJ, particularly when the coastal jet is located more north, was shown. Under a warming climate, the frequency of occurrence and intensity of the Benguela CLLJ is projected to increase due to the changes in the St. Helen High, which intensifies the flow offshore the west coast of South Africa, and due to the intensification of the land-sea thermal contrasts. However, during spring, associated to the decrease in near-surface wind speed due to higher SSTs, the frequency and intensity of the Benguela CLLJ is expected to decrease near -17.5oS. The wind resource in the Southwestern African offshore region was analysed and revealed great potential in present and future climates, particularly in the areas where the Benguela CLLJ occurs

Linking brand and competitive advantage: The mediating effect of positioning and market orientation

The purpose of this paper is to analyze the relationship between brand and competitive advantage (through differentiation) and the mediating effect of positioning and market orientation in this relationship. An empirical study was developed using a quantitative methodological approach. The object of the study was Portuguese exporting companies in the footwear industry, to which a questionnaire survey was applied. The results show that (1) brand has a significant direct impact on positioning and market orientation and competitive advantage through differentiation, (2) competitive advantage through differentiation is directly impacted by positioning, (3) market orientation does not have a significant direct impact on competitive advantage through differentiation, and (4) positioning has a mediating effect on the relationship between brand and competitive advantage through differentiation, and market orientation does not have on it.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Genetic screens in C. elegans for new modulators of protein homeostasis, with relevance for conformational diseases

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Protein folding is an essential cellular process, required for proper molecular and cellular function. The cell has evolved as a sophisticated machinery that ensures the quality and stability of the proteome. The network of cellular processes that coordinates protein synthesis, folding, trafficking and clearance, and determines the fate of proteins that do not acquire a native conformation, is responsible for maintaining protein homeostasis (proteostasis) and is referred to as “the proteostasis network” (PN). The key components of the quality control system are molecular chaperones that ensure proper folding under physiological and stress conditions. To restore homeostasis, the PN also relies on stress sensors and inducible pathways, such as the heat shock response (HSR), the unfolded protein response (UPR) and the oxidative stress response. How a protein folds and acquires its native conformation is a matter of high medical relevance since a large number of human diseases are associated with protein misfolding. These conditions are broadly classified as conformational disorders, and they are caused either by genetic mutations that cause protein misfolding and premature degradation (e.g. Cystic Fibrosis and Gaucher’s disease); or by the accumulation of misfolded, aggregated and/or fibrillar protein inclusions that are toxic to the cell. In particular, the phenomenon of protein aggregation is a hallmark of a large number of neurodegenerative diseases (e.g. Alzheimer’s, Parkinson’s and Huntington's diseases and several ataxias), muscular dystrophies, metabolic disorders and certain types of cancer. Considerable efforts have been directed at dissecting of the mechanisms of protein aggregation and toxicity, but the full extent of events leading to cell dysfunction is still unclear (Chapter I). The unifying aspect of conformational disorders is, however, the inability of the PN to respond efficiently to misfolded and aggregation-prone proteins so as to prevent cellular toxicity. Therefore, it is urgent and relevant to multiple diseases to identify genetic modifiers that enhance proteostasis function and consequently prevent protein aggregation and toxicity. Research has benefited from powerful model systems that recapitulate important aspects of the human disease. In particular, the nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a tractable genetic model organism that combines sufficient complexity so as to allow research on both cellular and organismal (including behavioral) phenotypes, with simplicity that facilitates rapid, high‐throughput testing of hypotheses (Chapter I). Genetic screens performed to date have identified the network’s protective components which, when knocked down or deleted, lead to enhanced aggregation and/or toxicity. These include molecular chaperones, proteasome subunits, components of the autophagy machinery, and the stress-induced transcriptional regulators FOXO/DAF-16 and HSF-1. The work described in this thesis is novel as it focuses on the opposite side of the PN, i.e., the pathways that when down-regulated lead to enhanced folding capacity. We established a screening strategy in C. elegans using RNA interference (RNAi) to identify genetic modifiers that suppress protein aggregation and toxicity of multiple disease-related proteins (Chapter II). Our goal was to identify genes that, when downregulated, enhanced the functional properties of the proteostasis network and restored the folding environment. We thus identified 63 genetic modifiers that suppressed both polyglutamine (polyQ) and mutant superoxide dismutase I (SOD1) aggregation, of which only 23 also suppressed the toxicity phenotype associated with aggregation. This was an important finding as it demonstrated that aggregation and toxicity can be genetically uncoupled. From the initial hits, 9 modifiers systematically reduced the misfolding of endogenous metastable mutant proteins, suggesting a general improvement of the folding environment. We postulated that this effect could be a consequence of activation of the heat shock stress response and chaperone expression by the modifiers. Although, we found that 5 improved folding in a HSF-1/chaperone dependent manner, the remaining modifiers improved folding by altering metabolism and RNA processing functions. Overall, this study introduced new genetic modifiers that promote alternate cellular folding environments broadly protective against misfolding events. We then characterized further the genetic modifier gei-11, a negative regulator of the L-type acetylcholine receptor (AChR) at the neuromuscular junction, to determine the mechanism of proteostasis enhancement (Chapter III). Downregulation of gei-11 increased cholinergic signaling and calcium flux into the cytoplasm of muscle cells, via activation of the voltage-gated calcium channel, EGL-19, and the sarcoplasmic reticulum ryanodine receptor, UNC-68. This resulted in selective activation of HSF-1 and upregulation of cytosolic chaperones that restored the post-synaptic folding environment. Earlier work had identified a loss-of-function deletion mutation in unc-30 that regulates GABA expression in C. elegans neurons, and resulting in enhanced polyQ aggregation in post-synaptic muscle cells (Garcia et al. 2007). Notably, enhanced aggregation occurs when GABAergic signaling is completely inhibited, resulting in maximum cholinergic overstimulation of muscle cells, whereas suppression of aggregation results from a moderate increase in cholinergic signaling. The effects of increased AChR expression are not the same as complete inhibition of GABA signaling, in part because the signaling response (and degree of stimulation) occurs at an intermediate level through a titrated response and waves of Ca2+ release. Therefore, the effect on post-synaptic protein aggregation is a consequence of the degree of imbalance generated between ACh and GABA, with an apparent range for folding improvement by cholinergic signaling. We propose that altogether these studies underscore the importance of the balance between cholinergic and GABAergic signaling as a mechanism for non-autonomous neuronal regulation of proteostasis in postsynaptic cells, and provide compelling evidence that will lead to a better understanding of the control of stress responses through tissue signaling events, which is very relevant for a number of neuromuscular disorders. We have also initiated the characterization of the hit gene let-607 (Appendix II). This gene is predicted to encode the C. elegans ortholog of CREBh, an ER regulated transmembrane protein (RIP) bZIP transcription factor that maintains sterol homeostasis in the liver and mediates UPR. Downregulation of let-607 in C. elegans led to an improvement of proteostasis function through activation of the HSR, upregulation of molecular chaperones and consequent suppression of protein misfolding, in an HSF-1- and XBP-1-dependent manner. UPR induction was found to be epistatic and required for HSR activation by let-607 RNAi. This is not observed for other UPR inducers, revealing specificity of “crosstalk” between the two stress responses through let-607. Currently, we are further characterizing the role of let-607 on UPR and the mechanism involved in UPR-mediated activation of the cytosolic HSR. The studies presented in this thesis emphasize the value of genetic screens and model organisms for the identification of genes and pathways that maintain protein homeostasis and are compromised in disease. Our screening strategy and triage hypotheses revealed novel genes/pathways that can be modulated to improve the PN capacity and help resolving the issue of protein aggregation-toxicity. Even greater value is offered by complementation of these genetic studies with small molecule screens to ultimately identify the suitable targets for therapeutics. This is highlighted in the work on “Chaperone Therapeutics: Small Molecule Proteostasis Regulators of the Heat Shock Response for Protein Conformational Diseases” (Appendix III). In this work we describe the results of a ~900,000 small molecule screen that identified small molecule proteostasis regulator compounds (PRs) that induce HSF-1- dependent chaperone expression and restore protein folding in multiple conformational disease models. The enhancement of proteome stability by the PRs is mediated by HSF-1, DAF-16/FOXO, SKN-1/Nrf2 and the chaperone machinery, through mechanisms that are distinct from current known small molecule activators of the HSR. Together, genetic and chemical modulation of the PN reveal new candidates and new mechanisms to be targeted by PRs, establishing promising therapeutic approaches for a variety of protein conformational diseases.O folding proteico, processo pelo qual proteínas adquirem a sua conformação correcta, é essencial para o bom funcionamento molecular e celular. Assim, as células possuem um sofisticado mecanismo de controlo de qualidade do proteoma (i.e., a totalidade das proteínas da célula num dado instante). O conjunto de vias celulares que coordena a síntese, o folding, o tráfego e a degradação de proteínas, e que determina o destino de proteínas que não adquirem a conformação correcta, é responsável por promover e manter a homeostase proteica celular ("proteostasis network" ou PN). Os componentes principais deste sistema de controlo de qualidade são os chaperones moleculares, responsáveis pelo folding de proteínas quer em condições fisiológicas quer sob stress. A PN utiliza sensores e vias induzidas por stress para restabelecer a homeostase, como é o caso da heat shock response (HSR), da unfolded protein response (UPR) e a resposta ao stress oxidativo. O processo de folding, e o modo como cada proteína adquire a sua conformação nativa funcional tem uma enorme relevância clínica uma vez que existe um elevado número de doenças provocadas por misfolding proteico. Estas patologias são genericamente designadas por ‘doenças de conformação proteica’, e podem ser causadas por mutações que impedem uma dada proteína de adquirir a conformação correcta, o que leva à sua degradação prematura (ex: Fibrose Quística e doença de Gaucher); ou então podem ser a consequência da acumulação e agregação de proteínas na forma de inclusões ou fibras amilóides que são altamente tóxicas para a célula. O fenómeno de agregação proteica é característico de doenças neuro-degenerativas (ex: doenças de Alzheimer, Parkinson e Huntington e várias ataxias), distrofias musculares, doenças metabólicas e certos tipos de cancro. Têm sido desenvolvidos esforços consideráveis na investigação dos mecanismos responsáveis pela agregação, toxicidade e sintomas clínicos destas doenças, no entanto ainda existem muitas questões em aberto (Capítulo I). O aspecto comum entre as doenças de conformação proteica é, no entanto, a incapacidade das células ou da PN de resposta eficiente face à presença de proteínas com tendência para agregar, de modo a evitar a respectiva toxicidade. Assim, uma alternativa para fins terapêuticos à identificação da causa de toxicidade em cada doença em particular, poderá ser a identificação de moduladores genéticos que alteram e principalmente que melhoram a capacidade funcional da PN, consequentemente prevenindo agregação e toxicidade. Este tipo de trabalho tem tido imenso sucesso através da utilização de organismos modelo que apresentam fenótipos relevantes para estas patologias. Particularmente, o nemátode Caenorhabditis elegans (C. elegans) oferece inúmeras vantagens em termos de facilidade de manipulação genética, estudo de fenótipos celulares e organismais (incluindo comportamentais), e possibilidade de ser usado em high-throughput screens genéticos (Capítulo I). Os screens genéticos executados até a data identificaram já os principais componentes da PN com função protectora os quais, aquando se reduz a sua expressão, levam ao aumento de misfolding e agregação proteícos e/ou toxicidade. Tais componentes da PN incluem chaperones, componentes das vias de degradação, como o proteasoma e autofagia, e os factores de transcrição FOXO/DAF-16 e HSF-1 que participam na resposta a stress celular. O trabalho descrito nesta tese é inovador pois foca numa outra vertente da PN, ou seja, os componentes cuja redução da expressão leva a uma melhoria do folding global. Assim, foi estabelecida uma estratégia de screening em C. elegans, utilizando RNA de interferência (RNAi) para identificar moduladores genéticos que reduzem a formação de agregados e a toxicidade de múltiplas proteínas (Capítulo II). O objectivo deste trabalho foi identificar novos factores que, quando negativamente regulados por RNAi, melhoram a função da PN e consequentemente aumentam o folding. Foram inicialmente identificados 63 moduladores/RNAi que reduziram o fenótipo de agregação no modelo de expressão de poliglutaminas (polyQ) e da superóxido dismutase 1 mutante (SOD1). Destes, apenas 23 moduladores genéticos reduziram o fenótipo de toxicidade. Este resultado demonstra que os processos de agregação e toxicidade não têm de estar necessariamente acoplados. Por último, pusemos em evidência que 9 destes moduladores corrigiram dum modo consistente o folding de várias proteínas mutantes endógenas, extremamente susceptíveis a misfolding, sugerindo que os genes identificados são moduladores gerais do folding proteíco. Propusémos entāo que este efeito seja uma consequência da expressão de chaperones e outros componentes do controlo de qualidade celular que promovem folding. De facto, o efeito de 5 destes genes parece ser dependente do factor de transcrição HSF-1 e do aumento da expressão de chaperones. Os restantes parecem afectar o folding através de alterações metabólicas e de processamento de RNA. Em conclusão, este trabalho identificou novos moduladores de homeostase proteica, os quais actuam de forma a promover um novo “ambiente celular” que propicia uma maior capacidade de folding. De seguida, caracterizou-se o mecanismo pelo qual o modulador genético gei-11 melhora a capacidade de folding (Capítulo III). Mostrámos que a redução da expressão do gene gei-11, descrito como sendo um regulador negativo do receptor de acetilcolina tipo-L (L-AChR) na junção neuro-muscular de C. elegans, aumenta o sinal colinérgico nas células musculares, activando os canais de cálcio na membrana (EGL-19) e o influxo do cálcio para o citoplasma através do retículo sarcoplásmico. Subsequentemente, verificou-se que ocorria a activação da HSF-1 e a expressão de chaperones que, por sua vez, assistem o folding de proteínas e minimizam agregação. Por ouro lado, tinha já sido descrito que a deleção do gene unc-30, que regula a via de síntese e secreção de GABA em células neuronais de C. elegans, intensifica a agregação de poliQ nas células musculares (Apêndice II). De notar, é o facto do aumento da agregação ocorrer apenas quando o sinal GABAergico é completamente eliminado, o que resulta em estimulação colinérgica máxima das células musculares. Por outro lado, a redução no número de agregados resulta dum “aumento intermédio” de actividade colinérgica. O aumento de expressão de AChR através do gei-11/RNAi não é assim equivalente à total inibição do sinal GABAérgico, uma vez que no primeiro caso o efeito é de nível intermédio e com oscilação nos níveis de cálcio. Assim, a alteração dos níveis de agregação e uma consequência do grau de desequilíbrio entre ACh e GABA, com um aparente limite para efeito positivo no folding proporcionado por ACh. Deste modo, s duas componentes deste trabalho revelam que o equilíbrio entre o input neuronal GABAérgico e colinérgico é essencial para regulação da proteostase no músculo, e aparentemente revelam um limiar para a melhoria do folding por parte da sinalização colinérgica. Estes resultados também revelam assim duma forma clara as vias de comunicação entre o sistema nervoso e muscular, que se reveste de extrema relevância para um conjunto de doenças neuromusculares. No Apêndice III são também brevemente descritos os resultados da caracterização do modulador genético let-607. Prevê-se que este gene codifique o ortólogo do gene humano CREBh, um factor de transcrição associado à membrana do retículo endoplasmático (RE) e responsável pela regulação dos níveis de esteróis no fígado, bem como pela regulação da UPR. Observou-se que a redução da expressão de let-607 conduz à activação da UPR e da HSR, à expressão de chaperones dependentes de HSF-1 e XBP-1, e consequentemente uma melhoria do folding proteico. De notar que a UPR ocorre de forma epistatica relativamente à HSR, sob a acção do RNAi contra o gene let-607. Os resultados sugerem uma especificidade de comunicação (“crosstalk”) entre as duas vias de stress UPR e HSR, que é regulada pelos níveis de let-607. Presentemente, a função do let-607 na UPR e o mecanismo de activação da HSR pela UPR estão a ser caracterizados. O trabalho apresentado nesta tese sublinha o valor dos screens genéticos em organismos modelo para a identificação de novos factores e vias que contribuem para a homeostase celular. A estratégia de screening e o método de triagem aqui aplicados revelaram componentes específicos da PN que podem ser modificados com o objectivo de reduzir o fenótipo de agregação e toxicidade proteíca. Estes estudos genéticos podem ser complementados por screens de pequenas moléculas (“small molecules”) para identificação de compostos que sirvam de base para o desenvolvimento de novas terapêuticas. Este é o foco do trabalho publicado no artigo “Chaperone Therapeutics: Small Molecule Proteostasis Regulators of the Heat Shock Response for Protein Conformational Diseases” (Appendix IV). Nele é descrito o resultado dum screen de ~900.000 moléculas, a partir do qual foram identificados novos reguladores de proteostase (PRs) que activam a HSF-1 e a expressão de chaperones. A exposição de modelos celulares e animais de doenças de conformação proteica a estes PRs reduziu o misfolding de múltiplas proteínas e as respectivas consequências fenotípicas. Verificou-se que o melhoramento da capacidade de folding é regulado por HSF-1, DAF-16/FOXO, SKN-1/Nrf-2 e chaperones. No seu conjunto, este estudo revelou novos moduladores genéticos e químicos das vias de proteostase, os quais apresentam potencial terapêutico (por exemplo, os PRs) para várias doenças causadas por proteínas com conformações prejudiciais à célula/organismo