Human pluripotent stem cells in pathological modeling for the identification of new therapeutic targets : application to myotonic dystrophy type 1

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est une des atteintes neuromusculaires parmi les plus fréquentes chez l’adulte et pour laquelle il n’existe de solution thérapeutique autre que symptomatique à l’heure actuelle. La mutation, une expansion instable d’un triplet CTG dans la région 3’ transcrite non traduite du gène codant la DMPK, conduit notamment à la dérégulation de protéines de liaison à l’ARN, ce qui engendre différents défauts d’épissage alternatif qui sont associés aux atteintes multisystémiques observées dans la maladie. La disponibilité d’un diagnostic préimplantatoire a permis la dérivation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à partir d’embryons portant la mutation causale. Ces lignées, et désormais les cellules souches induites à la pluripotence issues de patients, constituent des sources prometteuses de modèles pour l’étude des maladies génétiques. Outre la possibilité d’étudier la pathologie dans un contexte naturel, ces cellules offrent l’accès à tous les phénotypes cellulaires sans limite quantitative. Ceci en fait un outil de choix pour les approches de criblage à grande échelle, et notamment celles de génomique fonctionnelle, qui visent à explorer de manière systématique l’implication de gènes dans une maladie. L’objectif de mes travaux de doctorat a été de démontrer l’intérêt de tels cribles en développant une approche par perte de fonction, via le mécanisme d’interférence par l’ARN (ARNi), pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la DM1 en utilisant une lignée de CSEh exprimant la mutation causale. Après avoir identifié une population de progéniteurs mésenchymateux issus de cette lignée qui exprime deux biomarqueurs de la DM1 - les foci et le défaut d’épissage de l’INSR - et qui est adaptée à une approche de crible par transfection, mes travaux ont consisté à développer, miniaturiser puis automatiser les étapes de transfection et de détection des phénotypes pathologiques. Le crible de collections de siRNAs a permis d’identifier plusieurs gènes candidats, parmi lesquels ELAVL1 qui apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique pour la DM1. En effet, l’extinction de son expression permet d’améliorer plusieurs défauts d’épissages et de normaliser l’anomalie de capture du glucose. Nous avons montré que l’enrichissement de sa fraction nucléaire par l’utilisation d’activateurs de l’AMPK, composés classiquement indiqués pour la prise en charge du diabète de type 2, permettait de reproduire cet effet restaurateur. Mes travaux ont ainsi montré l’intérêt d’associer, et particulièrement dans le cas des maladies rares, les approches de crible par ARNi aux cellules souches pluripotentes modèles de maladies pour l’identification de nouvelles cibles moléculaires afin d’accélérer le développement de thérapeutiques.Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), or Steinert disease, is one of the most common neuromuscular disorders in adults for whom no therapeutic solution other than symptomatic is available at present. The mutation, which consists in an unstable CTG expansion located in the 3' transcribed but untranslated region of the DMPK gene, leads in particular to the deregulation of several RNA-binding proteins. This engenders various splicing defects that are associated to the multisystemic symptoms. The availability of a preimplantation genetic diagnosis enabled the derivation of human embryonic stem cell lines (hESC) from embryos carrying the causative mutation. These cell lines, and now the induced pluripotent stem cells established from patients, constitute promising models for genetic disease’s exploration. Besides the possibility to investigate the pathology in a natural context, these cells open the way to every cell phenotypes without any quantitative restriction and thus appear as a valuable tool for large scale screening, and particularly for functional genomics approaches that systematically explore the involvement of genes in a given phenotype. The aim of my work was to explore the potential of such an approach by developing a loss of function RNA interference screen in order to identify new therapeutic targets by using a hESC line expressing the DM1 mutation. To that purpose we first identified a disease relevant cell population, i.e. hESC derived-mesenchymal progenitors expressing two DM1 biomarkers – foci and INSR splicing defects, suitable for large scale siRNA transfection. Then we developed, miniaturized and automated the transfection’s and phenotype detection’s steps. Finally, once all the conditions determined, we conducted a screening of a siRNA library targeting RNA-binding proteins that led to the identification of several candidate genes, including ELAVL1 which appears as a new DM1 therapeutic target. Indeed, its knockdown resulted in the improvement of several pathological splicing defects and normalized the glucose uptake impairment. We also showed that the enrichment of its nuclear fraction through the use of AMPK activators, some of which being widely prescribed anti-diabetic drug, was able to mimic this corrective effect. My work thus underlies the interest of coupling RNAi screening to pathological pluripotent stem cells for the identification of new therapeutic targets with the view to accelerate drug discovery, and particularly in the case of rare diseases

Human pluripotent stem cells in pathological modeling for the identification of new therapeutic targets (application to myotonic dystrophy type 1)

La Dystrophie Myotonique de type 1 (DM1) ou maladie de Steinert est une des atteintes neuromusculaires parmi les plus fréquentes chez l adulte et pour laquelle il n existe de solution thérapeutique autre que symptomatique à l heure actuelle. La mutation, une expansion instable d un triplet CTG dans la région 3 transcrite non traduite du gène codant la DMPK, conduit notamment à la dérégulation de protéines de liaison à l ARN, ce qui engendre différents défauts d épissage alternatif qui sont associés aux atteintes multisystémiques observées dans la maladie. La disponibilité d un diagnostic préimplantatoire a permis la dérivation de lignées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à partir d embryons portant la mutation causale. Ces lignées, et désormais les cellules souches induites à la pluripotence issues de patients, constituent des sources prometteuses de modèles pour l étude des maladies génétiques. Outre la possibilité d étudier la pathologie dans un contexte naturel, ces cellules offrent l accès à tous les phénotypes cellulaires sans limite quantitative. Ceci en fait un outil de choix pour les approches de criblage à grande échelle, et notamment celles de génomique fonctionnelle, qui visent à explorer de manière systématique l implication de gènes dans une maladie. L objectif de mes travaux de doctorat a été de démontrer l intérêt de tels cribles en développant une approche par perte de fonction, via le mécanisme d interférence par l ARN (ARNi), pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la DM1 en utilisant une lignée de CSEh exprimant la mutation causale. Après avoir identifié une population de progéniteurs mésenchymateux issus de cette lignée qui exprime deux biomarqueurs de la DM1 - les foci et le défaut d épissage de l INSR - et qui est adaptée à une approche de crible par transfection, mes travaux ont consisté à développer, miniaturiser puis automatiser les étapes de transfection et de détection des phénotypes pathologiques. Le crible de collections de siRNAs a permis d identifier plusieurs gènes candidats, parmi lesquels ELAVL1 qui apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique pour la DM1. En effet, l extinction de son expression permet d améliorer plusieurs défauts d épissages et de normaliser l anomalie de capture du glucose. Nous avons montré que l enrichissement de sa fraction nucléaire par l utilisation d activateurs de l AMPK, composés classiquement indiqués pour la prise en charge du diabète de type 2, permettait de reproduire cet effet restaurateur. Mes travaux ont ainsi montré l intérêt d associer, et particulièrement dans le cas des maladies rares, les approches de crible par ARNi aux cellules souches pluripotentes modèles de maladies pour l identification de nouvelles cibles moléculaires afin d accélérer le développement de thérapeutiques.Myotonic Dystrophy type 1 (DM1), or Steinert disease, is one of the most common neuromuscular disorders in adults for whom no therapeutic solution other than symptomatic is available at present. The mutation, which consists in an unstable CTG expansion located in the 3' transcribed but untranslated region of the DMPK gene, leads in particular to the deregulation of several RNA-binding proteins. This engenders various splicing defects that are associated to the multisystemic symptoms. The availability of a preimplantation genetic diagnosis enabled the derivation of human embryonic stem cell lines (hESC) from embryos carrying the causative mutation. These cell lines, and now the induced pluripotent stem cells established from patients, constitute promising models for genetic disease s exploration. Besides the possibility to investigate the pathology in a natural context, these cells open the way to every cell phenotypes without any quantitative restriction and thus appear as a valuable tool for large scale screening, and particularly for functional genomics approaches that systematically explore the involvement of genes in a given phenotype. The aim of my work was to explore the potential of such an approach by developing a loss of function RNA interference screen in order to identify new therapeutic targets by using a hESC line expressing the DM1 mutation. To that purpose we first identified a disease relevant cell population, i.e. hESC derived-mesenchymal progenitors expressing two DM1 biomarkers foci and INSR splicing defects, suitable for large scale siRNA transfection. Then we developed, miniaturized and automated the transfection s and phenotype detection s steps. Finally, once all the conditions determined, we conducted a screening of a siRNA library targeting RNA-binding proteins that led to the identification of several candidate genes, including ELAVL1 which appears as a new DM1 therapeutic target. Indeed, its knockdown resulted in the improvement of several pathological splicing defects and normalized the glucose uptake impairment. We also showed that the enrichment of its nuclear fraction through the use of AMPK activators, some of which being widely prescribed anti-diabetic drug, was able to mimic this corrective effect. My work thus underlies the interest of coupling RNAi screening to pathological pluripotent stem cells for the identification of new therapeutic targets with the view to accelerate drug discovery, and particularly in the case of rare diseases.EVRY-Bib. électronique (912289901) / SudocSudocFranceF

Lescellules souches embryonnaires humaines comme outil dans le développement du médicament (perspectives)

STRASBOURG ILLKIRCH-Pharmacie (672182101) / SudocSudocFranceF

Les cellules souches embryonnaires et la pharmacologie

Les cellules souches embryonnaires sont communément associées à la thérapie cellulaire. Elles présentent toutefois en parallèle un tout autre intérêt pour la santé, comme outil à usage multiple de la recherche pharmacologique. Les cellules souches embryonnaires possèdent en effet, pour des études in vitro, l’avantage d’être une ressource biologique inépuisable du fait de leur immortalité, ce qui permet de s’appuyer sur le même fond génétique dans des études successives. Elles sont également la seule source connue à ce jour de cellules cultivables présentant le phénotype de n’importe quel lignage à n’importe quel stade de différenciation. Même si l’exploitation industrielle de ces deux propriétés dépend encore en partie d’innovations technologiques qui restent à venir, les travaux utilisant ce nouvel outil plein de promesses en recherche pharmacologique sont bel et bien en marche

Cytostatic effect of repeated exposure to simvastatin, a mechanism for chronic myotoxicity revealed by the use of mesodermal progenitors derived from human pluripotent stem cells.

International audienceStatin treatment of hypercholesterolemia can lead to chronic myotoxicity which is, in most cases, alleviated by drug withdrawal. Cellular and molecular mechanisms of this adverse effect have been elusive, in particular because of the lack of in vitro models suitable for long-term exposures. We have taken advantage of the properties of human pluripotent stem cell-derived mesodermal precursors, that can be maintained unaltered in vitro for a long period of time, to develop a model of repeated exposures to simvastatin during more than two weeks. This approach unveiled major differences, both in functional and molecular terms, in response to single versus repeated-dose exposures to simvastatin. The main functional effect of the in vitro simvastatin-induced long-term toxicity was a loss of proliferative capacity in the absence of concomitant cell death, revealing that cytostatic effect could be a major contributor to statin-induced myotoxicity. Comparative analysis of molecular modifications induced by simvastatin short-term versus prolonged exposures demonstrated powerful adaptive cell responses, as illustrated by the dramatic decrease in the number of differentially expressed genes, distinct biological pathway enrichments, and distinct patterns of nutrient transporters expressed at the cell surface. This study underlines the potential of derivatives of human pluripotent stem cells for developing new approaches in toxicology, in particular for chronic toxicity testing

Knockin mice expressing fluorescent δ-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo

The combination of fluorescent genetically encoded proteins with mouse engineering provides a fascinating means to study dynamic biological processes in mammals. At present, green fluorescent protein (GFP) mice were mainly developed to study gene expression patterns or cell morphology and migration. Here we used enhanced GFP (EGFP) to achieve functional imaging of a G protein-coupled receptor (GPCR) in vivo. We created mice where the δ-opioid receptor (DOR) is replaced by an active DOR-EGFP fusion. Confocal imaging revealed detailed receptor neuroanatomy throughout the nervous system of knockin mice. Real-time imaging in primary neurons allowed dynamic visualization of drug-induced receptor trafficking. In DOR-EGFP animals, drug treatment triggered receptor endocytosis that correlated with the behavioral response. Mice with internalized receptors were insensitive to subsequent agonist administration, providing evidence that receptor sequestration limits drug efficacy in vivo. Direct receptor visualization in mice is a unique approach to receptor biology and drug design