Expression and characterization of calreticulin gene isolated from Rhipicephalus annulatus after Babesia bigemina infection

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina VeterináriaTicks are obligate parasites in a large variety of hosts and are considered to be, after mosquitoes, the second worldwide vector of human and animal diseases. Bovine babesiosis causes substantial economic losses due to animal mortality, abortions and anaemia, among other effects. Calreticulin protein that has been identified in several species including ticks and previous experiments showed that calreticulin gene was up-regulated in R. annulatus ticks infected with B. bigemina and that its knockdown by RNAi technique leads to a reduction of both pathogen transmission and ticks weight. This Master thesis was developed within a project on “Differential expression and functional characterization of tick (Rhipicephalus annulatus) genes in response to pathogen infection (Babesia bigemina)”, financed by the Science and Technology Foundation (FCT), with the project number of PTDC/CVT/112050/2009. The aim of this study was the isolation of calreticulin gene, purification of calreticulin protein and its further use to produce antibodies for the purpose of immunolocalization studies and vaccination tests. In this Master thesis, calreticulin gene was amplified by PCR technique, sequenced and compared with calreticulin from the R. annulatus sequence, showing 98% identity. Afterwards, an Escherichia coli recombinant system was used in order to produce a calreticulin protein. Finally, recombinant proteins were purified using IMAC technique, due to the affinity of expressed calreticulin protein histidine tail to nickel ions. After specific elution and a final sample concentration, a unique protein was achieved in the purified sample, corresponding to recombinant calreticulin. The results of this study were optimistic and represent one more step to improve ticks control, as we showed in this study that CRT can be produced and purified without contaminants, though further vaccination and immunolocalization studies will be the key to understand CRT future use.RESUMO - Expressão e caracterização do gene calreticulina isolado de Rhipicephalus (Boophilus) annulatus após infecção com Babesia bigemina - As carraças são parasitas obrigatórios de uma grande variedade de hospedeiros, sendo consideradas, depois dos mosquitos, os mais importantes vectores de doenças em humanos e animais. A babesiose bovina conduz a elevados prejuízos económicos, devido ao aumento da mortalidade animal, abortos e anemia, entre outros. A calreticulina é uma proteína já identificada em várias espécies, incluindo carraças e estudos anteriores demonstraram que o gene calreticulina estava sobreexpresso em carraças R. annulatus infectadas com B. bigemina e, após o seu silenciamento através da técnica de RNAi, ocorria uma redução tanto na transmissão do agente patogénico, como no peso das carraças. Esta tese de Mestrado foi desenvolvida em paralelo com o projecto “Expressão diferencial e caracterização de genes de carraça (Rhipicephalus annulatus) em resposta à infecção por agente patogénico (Babesia bigemina)”, financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia, sendo o número do projecto PTDC/CVT/112050/2009. A finalidade deste trabalho consistiu no isolamento do gene calreticulina e purificação da correspondente proteína, para posteriormente ser usada na produção de anticorpos destinados a estudos de imunolocalização e de vacinação. Nesta tese de mestrado, amplificou-se o gene da calreticulina pela técnica de PCR, e sequenciou-se esse gene e comparou-se com a sequência da calreticulina da carraça R. annulatus, obtendo-se uma identidade de 98%. Posteriormente, o gene foi expresso em Escherichia coli de modo a produzir-se calreticulina. Finalmente, as proteínas recombinantes foram purificadas através do método IMAC, dado a calreticulina expressa ter uma cauda de histina com afinidade para iões níquel. Após a eluição específica e a concentração das amostras finais, verificou-se que uma única proteína, correspondente à calreticulina recombinante, se encontrava presente na amostra purificada. Os resultados deste estudo foram positivos e representam mais um passo para melhorar o controlo das carraças, uma vez que este estudo demonstrou que a CRT pode ser produzida e purificada sem contaminantes, apesar de estudos posteriores de vacinação e imunolocalização serão essenciais para perceber qual o futuro da CRT

Anoctamin 1-A member of a novel family of ion channels with extended functions and significance in disease

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia de Sistemas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2018Cystic fibrosis (CF), the most common life-shortening autosomal recessive disorder in Caucasians, is caused by >2,000 different mutations in the gene encoding the CF Transmembrane Conductance Regulator (CFTR). CFTR is a Cl- and HCO3- permeant channel expressed in the epithelial apical membrane. Clinically, the majority of CF patients suffer mostly from severe lung disease. A possible approach to treat CF is through the stimulation of alternative channels, such as anoctamins, that could compensate for absence of CFTR mediated Cl- secretion, thus being called “bypass” approach. The prime objective of this PhD project focusses on identifying novel anoctamin regulators as possible drug targets for CF. The first chapter describes the generation of CFBE-3HA-ANO1-eGFP cells and their use in a siRNA traffic screen. As a result, nine hits were selected for functional validation: Extended Synaptotagmin Member 1 (ESYT1) and Casein Kinase 2 (CSNK2) as negative modulators and Peptidoglycan Recognition Protein 3 (PGLYRP3) and Coat Protein Complex I subunit β1 (COPβ1) as positive hits. These screen data also showed a positive regulation of ANO1 by GPCRs, which were further characterized in chapter two. Our data illustrate an overlap between Ca2+- and cAMP- induced currents, which prevent a clear distinction between their respective Cl- currents. Our data in the third chapter describes the relationship between ANO1 and mucus and show that IL4 treatment (an inducer of ANO1 expression) does not affect MUC5AC levels, in contrast to other studies which proposed a causative role for ANO1 in mucus production. In the fourth chapter, the relationship between ANO1, ANO6 and CFTR was further investigated and our data suggest that CFTR activation requires at least one anoctamin member trafficking to the PM, to probably modulate cellular Ca2+ signalling and activate CFTR by SOcAMPs and Ca2+-sensitive adenylyl cyclases.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), SFRH/BD/52489/201

A importância do Data Mining

O trabalho procura abordar a temática do Data Mining, designado genericamente por processo de descoberta de informações relevantes tais como, padrões, associações, mudanças, anomalias e estruturas, existentes em grandes quantidades de dados, armazenados nos bancos de dados, nos depósitos de dados, nas bases de dados ou noutros repositórios de informação. A aproximação ao tema é feita tendo por base uma pesquisa bibliográfica da qual se extraiu diversa matéria de cariz conceptual, que se tentou organizar e estruturar de modo a construir um documento genérico capaz de despertar o interesse daqueles que pouco ou nada sabem sobre o assunto. Embora se traga à colação algumas evidências da importância do Data Mining e da sua aplicação, não foi possível reunir as condições suficientes para enveredar por uma investigação aplicada, nem tampouco pela procura fundamentada de conhecimento novo sobre o tema em causa. O Data Mining enquadra-se num processo mais alargado de aquisição do conhecimento que visa a sua obtenção a partir do sucessivo tratamento de conteúdos básicos de informação que são os dados em bruto. Tendo por base os conceitos relevantes de informação, conhecimento e inteligência, associados ao Data Mining, o trabalho procura também identificar e descrever a aplicabilidade prática desta tecnologia da informação em áreas actuais e relevantes de actividade, entre as quais se contam “a gestão de relações com o cliente”, “a compilação automática de recursos da Web” e ainda “a segurança e o exercício do contra-terrorismo”

ÉTICA, MORAL, CIÊNCIA E DIREITOS HUMANOS

No artigo que ora se apresenta tenciona-se enfocar, “en passant”, quatro temáticas presentes na sociedade de uma maneira geral, tão complexas quanto contraditórias: a ética, a moral, a ciência e os direitos humanos. Outrossim, mesmo que elas sejam abordadas objetivando detectar as especificidades dos campos de conhecimento que as compõem; tenciona-se demonstrar que eles só adquirem sentido quando inseridos no contexto econômico-sócio-político-cultural, no qual foram engendrados e personificados. Vale dizer, não se nega a necessidade da produção de conhecimento em cada área específica que compõe as ditas ciências humanas e naturais. No entanto, é preciso para compreendê-los em dimensão, utilizar como instrumento de análise daquilo que se convencionou denominar interdisciplinaridade; ou seja, horizontalizar a produção de conhecimento verticalizada dada a especificidade de cada área que compõe as ciências

Celecoxibe e rofecoxibe: Eficácia e segurança dos inibidores selectivos da Cox-2 comparativamente aos AINEs não selectivos

Objectivos: Rever as publicações mais recentes, no âmbito da eficácia e segurança dos inibidores selectivos da COX-2, de modo a elucidar uma possível vantagem terapêutica desta classe relativamente aos AINEs não selectivos. Métodos: Efectuou-se uma pesquisa sistemática das bases de dados electrónicas Medline e IDIS (1999-2003) e avaliaram-se artigos relevantes, que cumprissem os seguintes critérios de inclusão: (1) avaliassem eficácia comparativa do celecoxibe e/ou rofecoxibe relativamente a um ou mais AINEs não selectivos; ou (2) avaliassem efeitos adversos destes fármacos a nível gastrintestinal, renal ou cardiovascular; (3) fossem estudos realizados em seres humanos; (4) fossem de selecção aleatória e duplamente cegos (no caso dos estudos experimentais); (5) estivessem publicados em língua inglesa. Conclusões: As publicações mais recentes indicam que os inibidores selectivos da COX-2 demonstram eficácia analgésica, anti-inflamatória e antipirética, e segurança renal e cardiovascular, comparáveis às dos AINEs não selectivos. A sua única vantagem reside no melhor perfil de segurança gastrintestinal. No entanto, devido ao seu elevado custo, apenas parece haver justificação para substituir os AINEs não selectivos pelos inibidores selectivos da COX-2, em prática clínica, no caso de doentes de alto risco gastrintestinal. No entanto, devido à escassez de dados em doentes de risco GI, renal e cardiovascular, a terapêutica com estes fármacos deverá ser instituída com cautela, até estar disponível informação mais completa. Também será conveniente efectuar estudos de eficácia e segurança comparativa entre celecoxibe e rofecoxibe

Suscetibilidade genética às doenças orais de etiologia microbiana

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas MonizA cavidade oral consiste num ecossistema extremamente diverso e dinâmico, habitado por microrganismos que se encontram numa relação simbiótica. Estes microrganismos organizam-se na placa bacteriana, que está em equilíbrio com a flora comensal e a resposta imunitária do hospedeiro. Quando este equilíbrio é perturbando, ocorre uma transição para uma população rica me agentes patogénicos, ativando a resposta imunitária do hospedeiro. Esta mudança no microbioma, designada disbiose, são as causadoras das doenças orais microbianas, nomeadamente a periodontite, infeções endodônticas, cárie, infeções fúngicas orais e infeções orais de etiologia viral. Nos últimos anos surgiram numerosos métodos que permitiram a análise detalhada do genoma humano e possibilitaram a investigação de associações entre polimorfismos genéticos e doença oral de etiologia microbiana. A tese teve por objetivo rever este tema e baseou-se em artigos publicados entre 2013 e 2016. Na periodontite, diferentes haplótipos para a IL-4 revelaram tornar o hospedeiro mais suscetível a esta doença, mediante a presença de bactérias periodontapogénicas, e o mesmo acontece com polimorfismos na IL1 (α e β). Indivíduos com polimorfismos no recetor Toll-like 4 também parecem estar sujeitos a uma perda óssea alveolar mais acentuada. Várias associações ao genótipo do hospedeiro também foram verificadas nas restantes infeções. Este trabalho de revisão de literatura envolveu a pesquisa de artigos publicados na Pubmed e B-on, tendo sido utilizadas as seguintes palavras-chave: polimorfismos, suscetibilidade genética, infeções da cavidade oral, microrganismos orais, defesas do hospedeiro

ÉTICA, MORAL, CIÊNCIA E DIREITOS HUMANOS

No artigo que ora se apresenta tenciona-se enfocar, “en passant”, quatro temáticas presentes na sociedade de uma maneira geral, tão complexas quanto contraditórias: a ética, a moral, a ciência e os direitos humanos. Outrossim, mesmo que elas sejam abordadas objetivando detectar as especificidades dos campos de conhecimento que as compõem; tenciona-se demonstrar que eles só adquirem sentido quando inseridos no contexto econômico-sócio-político-cultural, no qual foram engendrados e personificados. Vale dizer, não se nega a necessidade da produção de conhecimento em cada área específica que compõe as ditas ciências humanas e naturais. No entanto, é preciso para compreendê-los em dimensão, utilizar como instrumento de análise daquilo que se convencionou denominar interdisciplinaridade; ou seja, horizontalizar a produção de conhecimento verticalizada dada a especificidade de cada área que compõe as ciências

Consequências do Trabalho por Turnos com Atividade Noturna nos Profissionais de Enfermagem

O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos do trabalho por turnos com trabalho noturno no sono, na fadiga e na vida social e familiar dos profissionais de enfermagem do Centro Hospitalar E.P.E. da região de Setúbal, tendo em conta a idade dos respondentes. Vários autores reportam o efeito negativo do trabalho por turnos no sono e na fadiga bem como na vida familiar e social dos trabalhadores (Silva, 2000; Cruz, 1995; Rosa, 1993). Mestrado em Segurança e Higiene no Trabalho Em termos metodológicos propomo-nos realizar um estudo de caso de natureza quantitativa a partir da aplicação de um inquérito por questionário adaptado do QSTT-Questionário sobre o Trabalho por Turnos, o qual também foi adaptado do Work Ability Index (WAI) e desenvolvido pelo Finnish Institute of Occupational Health, para aferir as consequências do trabalho por turnos com trabalho noturno. Recorremos a uma amostra por conveniência constituída por 37 enfermeiros que trabalham por turnos com trabalho noturno no Serviço de Cardiologia e na Unidade de Cuidados Especiais e Neonatais. Conclui-se, globalmente, que "Entre turnos da noite seguidos", os inquiridos precisam "Dormir mais" e "muito mais", a qualidade do sono está muito próxima do "Muito mau", estes profissionais sentem-se "Não muito repousados", "Algumas vezes" "Acordam mais cedo do que pretendiam" e têm "Dificuldade em adormecer", mas "Nunca" tomam "Medicamentos para dormir". É "Nos turnos da noite" que os profissionais se sentem "Muitas vezes" cansados. Sentem-se "Algumas vezes" e "Raramente" cheios de energia e "Raramente" se sentem cheios de vigor. A maioria dos inquiridos refere que onde o trabalho por turnos lhes causa mais problemas é na vida social/pessoal, vida familiar, descanso e a vida doméstica. "Raramente" se criticam ou culpabilizam pelo que está a acontecer" quando têm problemas na sua vida social/familiar/pessoal causados pelo trabalho por turnos ou quando têm problemas no emprego resultantes do trabalho por turnos. No nosso estudo pensamos que a variável sexo inviabilizou a análise pelo exíguo número de respostas de indivíduos do sexo masculino (5) e não encontrámos correlações significativas para a variável idade. Este trabalho permitiu uma melhor compreensão do impacto do trabalho por turnos com trabalho noturno na saúde e na vida destes profissionais, identificando algumas áreas de intervenção.The present study aims to evaluate the effects of shift work with night work, in the sleep and fatigue, and in the social and family life of nursing professionals at the Hospital Center E.P.E. of the Setúbal region, taking into account the sociodemographic variableage. Several authors reported the negative effects of the shift work, in the sleep and fatigue, as well in the family and social life of the workers (Silva, 2000; Cruz, 1995; Rosa, 1993) In methodological terms, we propose to carry out a quantitative case study, based on the application of a survey, using a questionnaire adapted from the QSTT – Questionário sobre o Trabalho por Turnos, which was also adapted from the Work Ability Index (WAI) and developed by the Finnish Institute of Occupational Health, to assess the consequences of shift work, with night work. We used a sample for convenience, consisting of 37 nurses, who work shifts with night work, at the Serviços de Cardiologia e Unidade de Cuidados Especiais e Neonatais. Globally, we can conclude, that "Between night shifts in a row", the respondents "Need to sleep a lot more", the quality of sleep is very close to "Very bad", these professionals feel "Not too rested", "Sometimes they wake up earlier than intended ", and they have" Difficulty falling asleep ", but" Never "take" Drugs to fall asleep ". It is "In the night shifts" that professionals feel "Often" tired. They feel "Sometimes" and "Rarely" full of energy, "Often" tired most of the time "and" Rarely "feel full of vigor. Most of the respondents say, that where shift work causes them the most problems is in social / personal life, rest and family life. They rarely "criticize or blame themselves for what is happening" when they have problems in their social / family / personal life caused by shift work or when they have problems at work resulting from shift work. In our study, due to the small number of responses from male individuals (5) the gender variable analysis becomes infeasible and we did not find any significant correlations for the age variable. This work allowed a better understanding of the impact of shift work with night work on the health and lives of these professionals, identifying some intervention areas

Audit Shopping no contexto da matéria colectável comum consolidada do imposto sobre as sociedades (MCCCIS)

Mestrado em AuditoriaA Comissão Europeia (CE) apresentou em 2011 uma proposta de Directiva relativa a uma matéria colectável comum consolidada do imposto sobre as sociedades (MCCCIS) (doravante designada por Directiva MCCCIS). A Directiva MCCCIS estabelece uma «matéria colectável comum para a tributação de certas sociedades e grupos de sociedades», e que se pretende venha a substituir os 27 sistemas actuais. Pretendemos demonstrar com esta dissertação que a adopção desta Directiva pressupõe novos desafios para as autoridades fiscais dos Estados-Membros (EM), nomeadamente para os seus serviços de auditoria. Mais, que alguns procedimentos inerentes às auditorias poderão ter de ser harmonizados, sob risco de se converterem em factor de planeamento fiscal, por parte dos grupos pan-europeus, quanto à escolha de localização do contribuinte principal (audit shopping). Para tal, iremos apresentar e comentar algumas áreas relacionadas com as auditorias efectuadas no âmbito da MCCCIS que consideramos ser mais susceptíveis de audit shopping. Concluiremos a dissertação com uma aplicação prática, onde se procura apresentar as características dos serviços de auditoria de três EM, relevando as suas diferenças, e como estas podem condicionar um grupo europeu a escolher a localização do seu contribuinte principal

Criminosos popularizados na narrativa de divulgação (De 1838 aos Alvores da República)

O presente estudo incide sobre obras impressas que tomaram como motivo central as «façanhas» de criminosos com referência histórica celebrizados em Portugal na segunda metade do século XIX e inícios de XX e mostra que, enquanto narrativas elaboradas para o grande público, os textos foram não só um reflexo da popularidade prévia dos famigerados transgressores, como também um fator incontornável da sua «lendarização» ao longo de décadas. São as seguintes as figuras dos infratores que protagonizaram as ficções em apreço: José Joaquim de Sousa Reis, ou «o Remexido» (1797-1838), Diogo Alves, ou «o Pancada» (1810-1841), Francisco de Matos Lobo (1814-1842), José Teixeira da Silva, ou «o José do Telhado» (1816-1875), João Victor da Silva Brandão, ou «o João Brandão de Midões» (1825-1880), e Vicente Urbino de Freitas (1859-1913). A tese agora apresentada aborda um corpus textual de características singulares, nunca antes coligido nem estudado. Comprova que os textos sobre as figuras criminosas tiveram uma função iminentemente noticiosa, pedagógico-edificante e política, apropriando-se de relatos orais, adotando procedimentos de atestação da veracidade (transcrição de documentos na primeira pessoa, referenciação cronológica, espacial, geográfica dos eventos, alusão às fontes) e incorporando diversas fontes do conhecimento dos crimes, quer de origem popular (geralmente designadas de «musa popular», «tradição»), quer de caráter erudito e teórico-científico («estudo», «estudo social»). Assim, foram analisadas as condições históricas excecionais nas quais as ficções emergiram: as características específicas do seu universo editorial, a apropriação a um público amplo (o formato de coleção, uso de sinopses e de outros elementos gráficos), as regularidades discursivas das obras (ocorrência de determinados dispositivos de organização textual), os procedimentos narrativos (recurso abundante a paratextos com intuito explicativo e aproximação a modalidades ficcionais conhecidas do público da época) e, ainda, as configurações imagéticas inspiradas nos discursos oficiais (influência de ciências e doutrinas epocais emergentes, como a criminologia, a antropologia criminal, a frenologia, a psiquiatria, a sociologia). Em suma, estas edições produzidas em diversos contextos e por um elenco autoral heterogéneo não só viveram da relação com as edições predecessoras, ao longo de gerações, como recriaram e ampliaram as «façanhas» dos transgressores em função de diversos propósitos e fontes: ampla divulgação dos casos criminais, condenação pública dos infratores, análise médico-científica dos sujeitos culpados, especulação política, pressão sobre o foro judiciário, edificação moral do público leitor. Trata-se, sem dúvida, de produções únicas, que erigiram a comemoração dos facínoras e sucessivamente reinscreveram as suas histórias reais na problemática do homem criminal e na consciência ética do seu tempo.This study focuses on printed works, which took as central motif the «exploits» of criminals with historical reference who were made famous in Portugal during the second half of the XIXth and the beginning of the XXth century. It shows that, while narratives prepared for the public in general, the texts were not only a reflection of the previous popularity of notorious offenders, but also an essential factor of their popularization for decades. The central figures of these fictions under consideration are as follows: José Joaquim de Sousa Reis, «o Remexido» (1797-1838), Diogo Alves, «o Pancada» (1810-1841), Francisco de Matos Lobo (1814-1842), José Teixeira da Silva, «o José do Telhado» (1816-1875), João Victor da Silva Brandão, «o João Brandão de Midões» (1825-1880), and Vicente Urbino de Freitas (1859-1913). The presented thesis deals with a unique textual corpus never before collected or studied. It prooves the narratives had an imminently pedagogical and political function, by appropriating oral accounts, truth attestation procedures (transcription of documents in the first person, use of chronological, spatial, geographic referencing sources). They also incorporated knowledge of different kind about the crimes, whether of popular origin (generally called «popular muse» or «tradition»), or of scholar and theoretical-scientific one (assuming themselves as «social study» or simply «study»). Therefore, these fictions emerged from historical and literary exceptional conditions. They presented publishing features appropriated to a wide audience (collection, synopsis and other graphic devices). Also presented discursive regularities (occurrence of textual organization devices), special narrative procedures (abundant use of paratexts with explanatory purpose and approach to fiction modes well known of the contemporary public) and imagery settings inspired in official knowledge (influences of emerging epochal sciences and doctrines such as criminology, criminal anthropology, phrenology, psychiatry, sociology). In short, these narratives, produced in different contexts and by a motley cast of authors, not only survived in their relation to the predecessor editions, over generations, as also had recreated and amplified the «exploits» of offenders depending on various purposes and sources. Amongst them, there are wide dissemination of criminal cases, public condemnation of the offenders, medical and scientific analysis of the guilty subjects, political speculation, making pressure over legal authorities, moral edification of the reading public. They are undoubtedly unique productions that have made the celebration of thugs and successively inscribed their real stories in the criminal's issue and in the ethical conscience of their time