p38 regulates the mTOR-mediated innate immune response

Die Mitogen-aktivierte Proteinkinase p38 spielt eine entscheidende Rolle bei der Entstehung einer Entzündungsreaktion. Inhibitoren von p38 wurden aufgrund ihrer entzündungshemmenden Eigenschaften in klinischen Studien eingesetzt, um ihre Wirkung in Krankheiten, wie zum Beispiel Arthritis oder Morbus Crohn, zu untersuchen. Viele dieser klinischen Studien zeigten jedoch keine Wirksamkeit der Inhibitoren und darüber hinaus konnte sogar das Auftreten von Entzündungen beobachtet werden. Der grundlegende Mechanismus, der dazu führt, dass durch die Inhibierung von p38 Entzündungen auftreten können, ist bislang unbekannt. Wir zeigen hier, dass die Hemmung von p38 durch die Inhibitoren BIRB0796 und SB203580 in humanen Monozyten dazu führt, dass nach Stimulierung von Toll-like Rezeptoren (TLR) die Produktion des entzündungsfördernden IL-12 gesteigert wird, während die Expression des entzündungshemmenden IL-10 vermindert wird. Auf der molekularen Ebene kann man durch Hemmung von p38 die Aktivierung der Serin/Threonin Kinase mammalian target of rapamycin (mTOR) verhindern, deren Funktion als wichtiger Regulator der IL-12/IL-10 Produktion in der angeborenen Immunität erst vor kurzem entdeckt wurde. Direkte Inhibierung von mTOR durch Rapamycin steigert ebenfalls die Produktion von IL-12 und senkt die Expression von IL-10. Gleichzeitige Aktivierung von p38 und mTOR in Monozyten durch UV Licht und LPS senkt die Freisetzung von IL-12, während IL-10 vermehrt exprimiert wird. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass die Aktivierung von mTOR durch p38 über TSC2 verläuft, da in Zellen, bei denen TSC2 deletiert ist, die p38 Inhibitoren BIRB0796 und SB203580 ihre inhibierende Wirkung auf mTOR nicht mehr ausüben konnten. Darüber hinaus konnten wir durch die Verwendung von Knockout-Mausmakrophagen feststellen, dass die Untereinheit p38α für die Aktivierung von mTOR verantwortlich ist. Durch die Inhibierung von p38 oder mTOR in humanen Monozyten differenzierten CD4+Helferzellen, die zusammen mit den Monozyten inkubiert wurden, verstärkt zu Th1 Zellen. In vivo Experimente zeigten, dass der Makrophagen-spezifische Knockout von p38 den Gehalt von IL-12 im Serum von Mäusen steigerte, nachdem sie mit LPS infiziert wurden, während der Gehalt an IL-10 zurückging. Zusammenfassend konnten wir nachweisen, dass die Inhibierung von p38 in humanen Monozyten entzündungsfördernde Auswirkungen zur Folge hat und dass es eine bislang unbekannte Verbindung zwischen p38 und mTOR gibt, welche wichtig für die Regulation der angeborenen Immunantwort ist.The mitogen-activated protein kinase p38 plays a crucial role in the onset of inflammation. Due to their potent anti-inflammatory effects, p38-inhibitors have been evaluated in clinical studies for the treatment of inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis or Crohn’s disease. However, most clinical trials failed to show clinical efficacy, and moreover, there was an unexpected appearance of inflammatory events under p38-inhibitor treatment in some patients. However, the underlying mechanism how inhibition of p38 may promote inflammation is largely unknown. I now show that the p38 inhibitors BIRB0796 and SB203580 augment the expression of the proinflammatory cytokine IL-12 in human monocytes or murine macrophages after stimulation with Toll-like receptor (TLR) ligands, while the production of the anti-inflammatory cytokine IL-10 is abrogated. On the molecular level, inhibition of p38 blocked the TLR-induced activation of the serine/threonine kinase mTOR, a recently identified critical regulator of IL-12/IL-10 production in the innate immune system. In agreement, direct inhibition of mTOR increased IL-12 production, while IL-10 was profoundly blocked. Activation of p38 with anisomycin or UV induced mTOR signaling, and accordingly, blocked IL-12 but enhanced IL-10 production of LPS-stimulated monocytes. Moreover, p38-mediated activation of mTOR in monocytes was dependent on TSC2, as deletion of TSC2 abolished the inhibitory effects of BIRB0796 and SB203580 on mTOR. Additionally, I observed that the isoform p38α is responsible for the activation of mTOR, as deletion of p38α in mouse macrophages blocked mTOR activation after TLR stimulation. In vivo, macrophage-specific knockout of p38α blocked mTOR signaling in the spleen of mice challenged with LPS and raised the IL-12 serum levels, while the levels of IL-10 were attenuated. On the functional level, inhibition of p38 or mTOR in monocytes strongly promoted the differentiation of CD4+ Th1 cells. In conclusion, we provide evidence that inhibition of p38 has proinflammatory effects in human monocytes as well as mouse macrophages and identify a novel link from p38 to mTOR that is central for the regulation of the innate immune response

CMV Late Phase-Induced mTOR Activation Is Essential for Efficient Virus Replication in Polarized Human Macrophages : Antiviral Effects of mTOR Inhibitors

Human cytomegalovirus (CMV) remains one of the most important pathogens following solid-organ transplantation. Mounting evidence indicates that mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitors may decrease the incidence of CMV infection in solid- organ recipients. Here we aimed at elucidating the molecular mechanisms of this effect by employing a human CMV (HCMV) infection model in human macrophages, since myeloid cells are the principal in vivo targets of HCMV. We demonstrate a highly di- vergent host cell permissiveness for HCMV with opti- mal infection susceptibility in M2 but not M1 polarized macrophages. Employing an ultrahigh purified HCMV stock we observed rapamycin-independent viral entry and induction of IFN-b transcripts, but no proinflam- matory cytokines or mitogen-activated protein kinases and mTOR activation early after infection. However, in the late infection phase, sustained mTOR activa- tion was observed in HCMV-infected cells and was required for efficient viral protein synthesis including the viral late phase proteins pUL-44 and pp65. Accord- ingly, rapamycin strongly suppressed CMV replication 3 and 5 days postinfection in macrophages. In conclu- sion, these data indicate that mTOR is essential for virus replication during late phases of the viral cycle in myeloid cells and might explain the potent anti-CMV effects of mTOR inhibitors after organ transplantatio

Assessing market requirements for new nonwoven materials by importance-performance analysis : a feasibility study

Angesichts von Nachhaltigkeitskonzepten und der staatlichen Betonung neuer Umweltrichtlinien wurden in letzter Zeit weltweit zahlreiche Forschungsarbeiten zur Verwendung von Naturfasern durchgeführt. Um die optimale Nutzung natürlicher Ressourcen zu verbessern, besteht ein zunehmender Trend, Biofasern als attraktive Alternative zu synthetischen Fasern zu verwenden. Wie jedes Material sind Biofasern jedoch dem ständigen Druck der globalen Märkte ausgesetzt. Im Rahmen des österreichischen Forschungsprojekts Flippr2 (Future Lignin and Pulp Processing Research) sollten neue Nischen im Bereich der Vliesstoffe mit Anwendbarkeit für ihr neu entwickeltes Fasermaterial identifiziert und für eine spätere Nutzung optimiert werden. Unter Berücksichtigung dieses Ziels soll die vorliegende Masterarbeit den Entwicklungsprozess des Vliesstoffs durch die Identifizierung aktueller Marktanforderungen unterstützen. In der Masterarbeit wird untersucht, ob eine Importance-Performance-Analyse (IPA) ein praktikables Instrument für diesen Zweck ist. Um grundlegende Informationen für das IPA zu generieren, wurden als Vorstudien semi-strukturierte Interviews und ein Online-Fragebogen verwendet. Ihre Ergebnisse zeigen, dass das Vliesmaterial für vier Anwendungen in der Filtrationsindustrie geeignet ist. Darüber hinaus wurde eine Liste von fünfzehn wichtigen Merkmalen erstellt, die sich aus Rohstoffeigenschaften, Merkmalen, die mit verschiedenen Bauprozessen erzielt werden können, sowie Gesamtlebensdauer und Leistungseigenschaften zusammensetzen. Die Auswertung der IPA ergab, dass die Teilnehmer im Allgemeinen mit ihren derzeit verwendeten Materialien und Produkten zufrieden sind. Es wurde jedoch der Bedarf an stabileren Materialien und einer besseren Leistung während der gesamten Lebensdauer festgestellt.In the light of sustainability concepts and governmental emphasis on new environmental guidelines, all over the world a lot of research work has lately been done on the usage of natural fibers. To enhance the optimal utilization of natural resources, there is a growing trend to use biofibers as attractive alternative to synthetic fibers. However, like any material biofibers experience the constant pressure of global markets. Within the scope of the Austrian research project called Flippr2 (Future Lignin and Pulp Processing Research) it was aimed to identify new niches in the area of nonwovens with applicability for their newly developed fibrous material and to optimize it towards its later utilization. Incorporating this objective, this master thesis aims to support the development process of the nonwoven material by identifying current market requirements. The master thesis examines whether an Importance-Performance Analysis (IPA) is a feasible tool for this purpose. To generate basic information for the IPA, semi-structured interviews and an online questionnaire were employed as preliminary studies. Their results show that the nonwoven material fits four applications in the industry of filtration. Moreover, a list of fifteen important characteristics was established, composed of raw material properties, features that can be gained with various construction processes and overall lifetime and performance qualities. The evaluation of the IPA showed attendees general satisfaction with their currently used materials and products. Yet, the need for more stable materials and better performance along lifetime was identified.Zusammenfassungen in Deutsch und EnglischKarl-Franzens-Universität Graz, Masterarbeit, 2019(VLID)443159

Conjugation of Native-Like HIV-1 Envelope Trimers onto Liposomes Using EDC/Sulfo-NHS Chemistry: Requirements and Limitations

The display of native-like human immunodeficiency virus type 1 envelope (HIV-1 Env) trimers on liposomes has gained wide attention over the last few years. Currently, available methods have enabled the preparation of Env-liposome conjugates of unprecedented quality. However, these protocols require the Env trimer to be tagged and/or to carry a specific functional group. For this reason, we have investigated N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide/N-Hydroxysulfosuccinimide (EDC/Sulfo-NHS) chemistry for its potential to covalently conjugate tag-free, non-functionalized native-like Env trimers onto the surface of carboxyl-functionalized liposomes. The preservation of the liposome’s physical integrity and the immunogen’s conformation required a fine-tuned two-step approach based on the controlled use of β-mercaptoethanol. The display of Env trimers was strictly limited to activated liposomes of positive charge, i.e., liposomes with a positive zeta potential that carry amine-reactive Sulfo-NHS esters on their surface. In agreement with that, conjugation was found to be highly ionic strength- and pH-dependent. Overall, we have identified electrostatic pre-concentration (i.e., close proximity between negatively charged Env trimers and positively charged liposomes established through electrostatic attraction) to be crucial for conjugation reactions to proceed. The present study highlights the requirements and limitations of potentially scalable EDC/Sulfo-NHS-based approaches and represents a solid basis for further research into the controlled conjugation of tag-free, non-functionalized native-like Env trimers on the surface of liposomes, and other nanoparticles