Tietokoneavusteinen mallinnus luonnollisten ja synteettisten ligandien sitoutumisesta oreksiinireseptoreihin

The orexinergic system is a key regulator of the sleep-wake cycle, and as such, presents a prominent target for drug development against ailments such as insomnia and narcolepsy. The system comprises two G protein-coupled receptors (GPCR), OX₁ and OX₂, and two neuropeptides, orexin-A and orexin-B. In the beginning of the study presented here, several antagonists (blockers) of the receptors were available but drug-like agonists (activators) were not. The search for the latter was hampered by the poor understanding how the endogenous ligands, the orexin peptides, activate their receptors. The main objective for the thesis research was to elucidate the binding mode of orexin peptides at their cognate receptors, along with the activation determinants, using both computational and traditional experimental methods. We produced homology models for the OX₁ receptor based on related GPCRs, and subsequently adopted the orexin receptor structures reported during the study. Peptide binding mode was probed through rigid-body docking, which resulted in two alternative binding modes. These were followed up by extensive molecular dynamics simulations within membrane environment, accompanied with simulations of small-molecule binding. Deriving from the simulations, we proposed a single, well-defined binding mode for the orexin peptide C-terminus within the canonical GPCR binding site. In addition, we observed that the small-molecular antagonist was remarkably stable within the binding site, whereas the recently reported agonist Nag26 was more mobile. The pool of simulations allowed us to observe differences between the agonists and the antagonist, leading to suggestions on determinants of agonist and antagonist binding. To assess the bioactive conformation of orexin peptides, we produced conformationally constrained orexin peptide variants. These showed that the stabilization of the straight α-helical conformation of the orexin-A is detrimental to potency, but not necessary to efficacy, at least with the utilized stapled peptides and α-aminoisobutyric acid insertions at the tested sites. We assume that the modifications were directly incompatible with the binding interactions, or the stabilized conformation was sub-optimal. The literature review focuses on the functions and characteristics of GPCRs and the orexinergic system, and provides insight into computational tools used in the study.Oreksiinijärjestelmä on tärkeä uni–valverytmin säätelijä ja näin ollen kiinnostava lääkekehityskohde muun muassa nukahtamis- ja narkolepsialääkkeille. Järjestelmään kuuluu kaksi G-proteiinikytkentäistä reseptoria (GPCR), OX₁ ja OX₂, sekä kaksi neuropeptidiä, oreksiini-A ja -B. Väitöskirjassa esitetyn tutkimuksen alussa tunnettiin useita reseptoriantagonisteja (salpaajia), mutta lääkkeenkaltaisia agonisteja (aktivaattoreita) ei tunnettu. Endogeenisten agonistien, eli oreksiinipeptidien, sitoutumistapaa reseptoreihin ei tunnettu, mikä haittasi etenkin agonistien etsintää. Väitöstutkimuksen päätavoite oli selvittää oreksiinipeptidien sitoutumistapa oreksiinireseptoreihin ja reseptorin aktivoitumiselle oleelliset vuorovaikutukset. Tähän käytettiin sekä tietokoneavusteisia että perinteisiä kokeellisia menetelmiä. Tuotimme OX₁ reseptorista malleja ensin läheisiin reseptorirakenteisiin pohjautuen, ja kun oreksiinireseptorien rakenteita julkaistiin, hyödynsimme niitä. Peptidien sitoutumista selvitettiin telakoimalla. Tämän pohjalta esitimme kaksi vaihtoehtoista sitoutumistapaa, joille ajoimme kattavia molekyylidynaamisia simulaatioita. Lisäksi simuloimme pienmolekyylien sitoutumista. Simulaatioiden pohjalta esitimme oreksiinipeptidien C-terminaalille yhden tarkasti muotoillun sitoutumistavan reseptorin sitoutumistaskuun. Simulaatiot osoittivat myös, että antagonist suvoreksantin sitoutuminen on hyvin vakaata, mikä puolestaan ei pitänyt paikkaansa hiljattain julkaistun pienmolekyyliagonistin Nag26 kohdalla. Simulaatioiden vertailun pohjalta ehdotimme reseptorin sammuttamisen ja aktivoimisen kannalta oleellisia vuorovaikutuksia. Lisäksi tuotimme konformaatiostabiloituja oreksiinipeptideitä tutkiaksemme peptidien bioaktiivista konformaatiota. Oreksiini-A:n suoran α-heliksirakenteen vakauttaminen, ainakin käyttämillämme menetelmillä, alentaa peptidien voimakkuutta, muttei välttämättä tehokkuutta. Oletamme, että tuottamamme muutokset ovat suoraan yhteensopimattomia oleellisten vuorovaikutusten kanssa tai vaihtoehtoisesti vakautettu konformaatio on epäsopiva. Kirjallisuuskatsaus käsittelee G-proteiinikytkentäisten reseptorien ja oreksiinijärjestelmän ominaisuuksia ja toimintaa sekä esittelee tutkimuksessa käytetyt tietokoneavusteiset menetelmät

Determinants of Orexin Receptor Binding and Activation—A Molecular Dynamics Study

We assess the stability of two previously suggested binding modes for the neuropeptide orexin-A in the OX2 receptor through extensive molecular dynamics simulations. As the activation determinants of the receptor remain unknown, we simulated an unliganded receptor and two small-molecular ligands, the antagonist suvorexant and the agonist Nag26 for comparison. Each system was simulated in pure POPC membrane as well as in the 25% cholesterol–POPC membrane. In total, we carried out 36 μs of simulations. Through this set of simulations, we report a stable binding mode for the C-terminus of orexin-A. In addition, we suggest interactions that would promote orexin receptor activation, as well as others that would stabilize the inactive state.Peer reviewe

Modeling of the OX1R-orexin-A complex suggests two alternative binding modes

Background: Interactions between the orexin peptides and their cognate OX1 and OX2 receptors remain poorly characterized. Site-directed mutagenesis studies on orexin peptides and receptors have indicated amino acids important for ligand binding and receptor activation. However, a better understanding of specific pairwise interactions would benefit small molecule discovery. Results: We constructed a set of three-dimensional models of the orexin 1 receptor based on the 3D-structures of the orexin 2 receptor (released while this manuscript was under review), neurotensin receptor 1 and chemokine receptor CXCR4, conducted an exhaustive docking of orexin-A(16-33) peptide fragment with ZDOCK and RDOCK, and analyzed a total of 4301 complexes through multidimensional scaling and clustering. The best docking poses reveal two alternative binding modes, where the C-terminus of the peptide lies deep in the binding pocket, on average about 5-6 angstrom above Tyr(6.48) and close to Gln(3.32). The binding modes differ in the about 100 degrees rotation of the peptide; the peptide His26 faces either the receptor's fifth transmembrane helix or the seventh helix. Both binding modes are well in line with previous mutation studies and partake in hydrogen bonding similar to suvorexant. Conclusions: We present two binding modes for orexin-A into orexin 1 receptor, which help rationalize previous results from site-directed mutagenesis studies. The binding modes should serve small molecule discovery, and offer insights into the mechanism of receptor activation.Peer reviewe

Stapled truncated orexin peptides as orexin receptor agonists

The peptides orexin-A and -B, the endogenous agonists of the orexin receptors, have similar 19-amino-acid C-termini which retain full maximum response as truncated peptides with only marginally reduced potency, while further N-terminal truncations successively reduce the activity. The peptides have been suggested to bind in an α‐helical conformation, and truncation beyond a certain critical length is likely to disrupt the overall helical structure. In this study, we set out to stabilize the α‐helical conformation of orexin‐A15–33 via peptide stapling at four different sites. At a suggested hinge region, we varied the length of the cross-linker as well as replaced the staple with two α-aminoisobutyric acid residues. Modifications close to the peptide C‐terminus, which is crucial for activity, were not allowed. However, central and N‐terminal modifications yielded bioactive peptides, albeit with decreased potencies. This provides evidence that the orexin receptors can accommodate and be activated by α-helical peptides. The decrease in potency is likely linked to a stabilization of suboptimal peptide conformation or blocking of peptide backbone–receptor interactions at the hinge region by the helical stabilization or the modified amino acids.Peer reviewe

Computational Modeling of Orexin Receptor 1 in Complex with Orexin-A

The orexinergic system is a central regulator for sleep-wake rhythm and energy homeostasis. Dysfunction of the system is at least one of the reasons behind narcolepsy, in addition to which insomnia, obesity and certain cancers could be treated by targeting orexin receptors. The orexin system in human comprises two receptor subtypes, orexin receptor 1 and 2 (OX₁R and OX₂R respectively) as well as two cognate ligands, peptides orexin-A and -B. In this study the focus is on OX₁R and orexin-A. The aims of the study are (1) to propose a binding mode for orexin-A to OX₁R and (2) to understand the molecular interactions of OX₁R leading to receptor activation. I order to create 3D molecular models of OX₁R, a sequence alignment of the eight G proteincoupled receptors (GPCRs) that have been crystallized up to date was first generated by ClustalX and adjusted based on the superimposition by SYBYL-X. Structurally conserved regions were deduced from the alignment and used to add the orexin receptors. Five different models built with MODELLER were selected for their large binding cavity among a large pool of models. These models were constructed based on the chemokine receptor 4 (PDB Id:3ODU), as such and a modified version where TM3 was moved by 1 Å further from the center of the binding cavity, from the β₂-adrenoceptor (PDB Id: 2RH1) and from the adenosine receptor A2A (PDB Id: 2YD0), as such and with rotamer changes to few binding site residues. Orexin-A with straight conformation found by NMR (PDB Id:1WSO) was docked to these models using ZDOCK and RDOCK. In addition, an in-house docking protocol was implemented, but could not be validated. Docking poses were scored by purpose built knowledge based scoring function and clustered. High scoring clusters were then used to converge to three different binding modes. As a result, we suggest that the binding site of OX₁R consists of two hydrophobic walls, one from TM3 and TM5, the other from TM6 and TM7. Binding modes include a hydrogen bond network between the ligand and especially binding site residues Gln1263.32, Thr2235.46, Asn3186.55, Lys3216.58 and Tyr3117.43. Based on the binding modes, it is suggested that the OX₁R is activated by similar binding site contraction as β-adrenoceptors and adenosine A2A. The contraction in could result from the hydrogen bonds between ligand, Gln1263.32, Thr2235.46 and Asn3186.55. The hydrogen bonding of Thr2235.46 can also disrupt interactions between TM5 and TM3, an interaction which is identified as an important factor in keeping the receptor in the inactive state. The role of other ligand residues would be to direct ligand binding and keep the ligand in the helical conformation.Oreksiinijärjestelmä on keskeinen uni-valverytmin ja energiatasapainon säätelijä. Järjestelmän toimintahäiriöt ovat yksi narkolepsian syistä, minkä lisäksi unettomuutta, liikalihavuutta ja tiettyja syöpiä voitaisiin hoitaa oreksiinijärjestelmän kautta. Ihmisen oreksiinijärjestelmä koostuu kahdesta reseptorialatyypista, oreksiini 1 ja 2 reseptorit (OX₁R ja OX₂R), ja kahdesta peptidiligandista, oreksiini-A ja -B. Tässä tutkimuksessa on keskitytty OX₁R:in ja oreksiini-A:han. Tutkimuksen tavoitteet ovat (1) ehdottaa oreksiini-A:n sitoutumistapoja OX₁R:in ja (2) ymmärtää molekyylitason vuorovaikutuksia, jotka johtavat OX₁R:n aktivoitumiseen. Luodaksemme kolmiulotteisia molekyylimalleja OX₁R:sta, kahdeksan tähän mennessä kiteytetyn G proteiinikytkentäisen reseptorin sekvenssit linjattiin ClustalX-ohjelmalla, minkä jälkeen sekvenssilinjaus tarkistettiin SYBYL-X-ohjelmistolla tehdyllä kiderakenteiden päällekkäin asettelulla. Rakenteellisesti säilyneet alueet pääteltiin linjauksesta, ja niiden perusteella lisättiin oreksiinireseptorit sekvenssilinjaukseen. Viisi erilaista MODELLER-ohjelmalla rakennettua reseptorimallia valittiin suuresta joukosta malleja ison sitoutumiskohtansa vuoksi. Nämä reseptorimallit rakennettiin käyttäen mallirakenteina kemokiinireseptori 4:a (PDB Id:3ODU) sellaisenaan ja muokattuna niin, että kolmatta solukalvon läpäisevää heliksiä (TM3) siirrettiin 1 Å poispäin sitoutumiskohdasta, β₂-adrenoseptoria (PDB Id: 2RH1) ja adenosiinireseptori A2A:ta (PDB Id: 2YD0) sekä sellaisenaan että tiettyjen sivuketjujen asentoa muuttamalla. Oreksiini-A:n NMR-tutkimuksilla löydetty suora muoto (PDB Id:1WSO) telakoitiin näihin malleihin ZDOCK ja RDOCK -ohjelmilla. Lisäksi kehitettiin oma telakointiprotokolla, mutta sen validointi ei onnistunut. Telakointiasennot pisteytettiin tarkoitusta varten rakennetulla tietoon perustuvalla pisteytysfunktiolla ja ryhmiteltiin. Korkeimmin pisteytetyistä ryhmistä johdettiin kolme sitoutumistapaa. Tuloksena esitän, että OX₁R:n sitoutumiskohta koostuu kahdesta hydrofobisesta seinästä, toinen TM3:n ja TM5:n puolella, toinen TM6:n ja TM7:n puolella. Sitoutumistapoihin kuuluu myös vetysidosverkko ligandin ja erityisesti sitoutumiskohdan aminohappotähteiden Gln1263.32, Thr2235.46, Asn3186.55, Lys3216.58 ja Tyr3117.43 välillä. Sitoutumistapojen perusteella ehdotan, että OX₁R aktivoituu samantapaisella sitoutumispaikan supistumisella kuin β-adrenoseptorit ja adenosiini A2A. Supistus johtunee vetysidoksista ligandin ja aminohappotähteiden Gln1263.32, Thr2235.46 ja Asn3186.55 välillä. Vetysidos Thr2235.46:in voi myös häiritä reseptorin epäaktiivisena pitämisellä tärkeitä vuorovaikutuksia TM5:n ja TM3:n välillä. Muiden ligandin aminohappotähteiden rooli voi olla ohjata ligandin sitoutumista sekä pitää ligandi heliksirakenteisena

Kaipiaisten rautatieyhteisön rakennukset : Kartoitus asema-alueen 1800-luvun lopun rakennuskannasta

Eurooppa alkoi verkottua rautateitse 1800-luvulla teollisen vallankumouksen puhjettua. Venäjästä riippuvaiselle Suomelle se oli tärkeä askelkivi kehityksessä. Rautatieyhteys Helsingin ja Pietarin välille valmistui 1870. Sen ollessa ensimmäinen tuottoisa ratayhteys, syntyi radan varrelle monia rautatieyhteisöjä. Yksi näistä yhteisöistä sijaitsi puolivälissä matkaa Pietariin. Opinnäytetyö tutkii kyseisen alueen rakennuksia. Jotkut rakennuksista ovat säilyneet nykypäivään asti käyttötarkoituksessaan, kun taas suuri osa niistä on purettu, kenties uudistumisen toivossa. Opinnäytetyö pyrkii selvittämään rakennusten määrää, sijaintia ja huomionarvoisia ominaisuuksia kuten kulttuurihistoriaa ja arkkitehtuuria. Opinnäytetyön päämääränä on selvittää Kaipiaisten rautatieyhteisön koko 1800-luvun viimeisillä vuosikymmenillä eli kukoistuksen aikana. Historiallisen tiedon kerääminen ja tutkiminen suoritettiin alueen kulttuurihistoriallisen merkityksen selvittämiseksi. Kulttuuriarvojen tunnistaminen edesauttaa tulevien restaurointi- ja konservointitöiden suunnittelua. Kaipiaisten rautatiehistoriaan liittyen on tekeillä kirja, jonka on tarkoitus kuvailla alueen historiaa tarinoiden ja kuvien kautta. Tiedonhakumenetelmiä olivat muun muassa valokuvatutkimus, uutisarkistotutkimus ja rautatieaiheisten kirjallisten teosten tutkiminen ja vertailu. Erkki Alatalon kanssa käydyillä keskusteluilla oli tärkeä rooli tietojen käsittelyssä, sillä moni ristiriitainen kirjatieto sai selvennystä ihmiseltä joka on joskus asunut yhteisössä. Opinnäytetyössä uutta rakennuksia koskevaa tietoa on löydetty ja saatettu samojen kansien väliin. Vaikka tutkimuksesta saattavat hyötyä enemmän ammattialan ihmiset, se on tarkoitettu myös laajalle yleisölle, varsinkin heille jotka nykyään asuvat yhteisön ympärille kehittyneessä kylässä.Following the outbreak of the industrial revolution Europe started to network itself with the help of railways during the 19th century. It was an important issue for Finland being closely dependant on Russia at the time. A connection between Helsinki and St. Petersburg was completed in 1870. Being the first successful railway connection it resulted in the birth of several railway communities. One of these communities was exactly at the mid-point between those two cities. This thesis concentrates on the buildings that rose up within that area. Some of them survive to this day while others have disappeared over the years. This thesis will describe the locations and share essential information concerning these buildings. The goal of this survey was to estimate the size of Kaipiainen railway community during its prosperous years which were approximately from 1870 to 1890. Historical information was gathered in order to help to estimate the value of this area and thus possibly contribute to any future restoration or conservation decisions. There is a book in development which will describe Kaipiainen community history with help of personal stories and photographs. This thesis will eventually work as support material in the book writing process. The main methods for discovering information were photographic research, news archive research and the study of written works about other communities or railway connections. Indepth discussions with the commissioner Erkki Alatalo also played a key role in processing the material and evaluating its validity. In this thesis new information about the buildings has been unearthed and collated. While professionals may benefit from this work, it is primarily intended for people who live in Kaipiainen now: the descendants of those diligent men and women who built the community

Pharmacophore Model To Discover OX₁ and OX₂ Orexin Receptor Ligands

Small molecule agonists and antagonists of the orexinergic system have key implications for research and therapeutic purposes. We report a pharmacophore model trained on ∼200 antagonists and prospectively validated by screening a collection of ∼137,000 compounds. The resulting hit list, 395 compounds, was tested for OX₁ and OX₂ receptor activity using calcium mobilization assay in recombinant cell lines. Validation was conducted using both calcium mobilization and [¹²⁵I]-orexin‑A competition binding. Compounds <b>4</b>–<b>7</b> have weak agonist activity and K_i’s in the 1–30 μM range; compounds <b>8</b>–<b>14</b> are antagonists with K_i’s in the 0.1–10 μM range for OX₂ and 1–50 μM for the OX₁ receptor. Docking simulations were used to devise a working hypothesis where two subpockets are important for activation, one between TM5 and TM6 lined by Phe5.42, Tyr5.47, and Tyr6.48 and another above the orthosteric pocket lined by Asp2.65 and Tyr7.32