Funktionelle Analyse von CUX1 in tumorassoziierten Makrophagen des Pankreaskarzinoms

Das Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zeigt eine charakteristische Stromareaktion mit einer hohen Anzahl tumorinfiltrierender Makrophagen (TAM). Obwohl bekannt ist, dass eine hohe Anzahl von TAMs mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht, ist die Rolle dieses Zelltyps im Pankreaskarzinom nur teilweise verstanden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Makrophagen aus humanen und murinen Tumoren, u. a. auch PDAC, einen progressionsfördernden M2- oder alternativ aktivierten Phänotyp aufweisen. Der Transkriptionsfaktor CUX1 ist bekannt als wichtiger Mediator der Tumorprogression und ist assoziiert mit einer negativen Prognose. Die tumorfördernden Effekte von CUX1 wurden bisher vor allem seiner promigratorischen, proproliferativen und antiapoptotischen Wirkung in Tumorzellen zugeschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass CUX1 nicht nur von den Tumorzellen, sondern auch von den TAMs des PDAC exprimiert wird. Eine Analyse der CUX1-Expression in humanen Karzinomgeweben und einem genetischen Mausmodell des PDAC zeigten eine gesteigerte CUX1-Expression in Makrophagen aus Tumorgewebe. TGF-β, ein wichtiger Mediator der Tumorprogression, der in PDAC-Geweben stark exprimiert ist, wurde als Stimulator der CUX1-Expression in Makrophagen identifiziert. Mittels Überexpression und siRNA-vermitteltem Knockdown von CUX1 wurden eine Reihe von Zytokinen als durch CUX1 reprimiert identifiziert, welche mit dem im allgemeinen als antitumoral wirksamen M1-Phänotyp von Makrophagen assoziiert sind. Für zwei Zytokine, CCL5 und CXCL10, wurden die dieser Repression zugrunde liegenden Mechanismen durch Reporter-Assays, DNA-Pulldown-Experimente und Immunopräzipitationen weiter untersucht. CUX1 wurde als direkter Interaktionspartner von NF-κBp65 identifiziert, der dessen Bindung an die Zytokinpromotoren inhibiert. Darüber hinaus reduziert CUX1 die Acetylierung von NF-κB p65 an Lysin 310, vermutlich durch Rekrutierung von HDAC1. Passend zu diesen M1-antagonisierenden Effekten, inhibiert CUX1 in Makrophagen funktionell durch eine Veränderung sezernierter Zytokine die Attraktion von zytotoxischen T-Zellen und fördert die Angiogenese in vitro. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit CUX1 als wichtiger Modulator des Makrophagen-Phänotyps und der Makrophagen-Funktion sowie Antagonist der NF-κB-abhängigen Genexpression identifiziert. Dieses Wissen könnte zu einem besseren Verständnis der tumorfördernden Eigenschaften von Makrophagen beitragen und als neuer therapeutischer Ansatzpunkt dienen

Structural Changes of Yellow Cameleon Domains Observed by Quantitative FRET Analysis and Polarized Fluorescence Correlation Spectroscopy

Förster resonance energy transfer (FRET) is a widely used method for monitoring interactions between or within biological macromolecules conjugated with suitable donor-acceptor pairs. Donor fluorescence lifetimes in absence and presence of acceptor molecules are often measured for the observation of FRET. However, these lifetimes may originate from interacting and noninteracting molecules, which hampers quantitative interpretation of FRET data. We describe a methodology for the detection of FRET that monitors the rise time of acceptor fluorescence on donor excitation thereby detecting only those molecules undergoing FRET. The large advantage of this method, as compared to donor fluorescence quenching method used more commonly, is that the transfer rate of FRET can be determined accurately even in cases where the FRET efficiencies approach 100% yielding highly quenched donor fluorescence. Subsequently, the relative orientation between donor and acceptor chromophores is obtained from time-dependent fluorescence anisotropy measurements carried out under identical conditions of donor excitation and acceptor detection. The FRET based calcium sensor Yellow Cameleon 3.60 (YC3.60) was used because it changes its conformation on calcium binding, thereby increasing the FRET efficiency. After mapping distances and orientation angles between the FRET moieties in YC3.60, cartoon models of this FRET sensor with and without calcium could be created. Independent support for these representations came from experiments where the hydrodynamic properties of YC3.60 under ensemble and single-molecule conditions on selective excitation of the acceptor were determined. From rotational diffusion times as found by fluorescence correlation spectroscopy and consistently by fluorescence anisotropy decay analysis it could be concluded that the open structure (without calcium) is flexible as opposed to the rather rigid closed conformation. The combination of two independent methods gives consistent results and presents a rapid and specific methodology to analyze structural and dynamical changes in a protein on ligand bindin

Moderation of Arabidopsis Root Stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 Receptor Kinase Complexes

SummaryBackgroundThe root system of higher plants originates from the activity of a root meristem, which comprises a group of highly specialized and long-lasting stem cells. Their maintenance and number is controlled by the quiescent center (QC) cells and by feedback signaling from differentiated cells. Root meristems may have evolved from structurally distinct shoot meristems; however, no common player acting in stemness control has been found so far.ResultsWe show that CLAVATA1 (CLV1), a key receptor kinase in shoot stemness maintenance, performs a similar but distinct role in root meristems. We report that CLV1 is signaling, activated by the peptide ligand CLAVATA3/EMBRYO SURROUNDING REGION40 (CLE40), together with the receptor kinase ARABIDOPSIS CRINKLY4 (ACR4) to restrict root stemness. Both CLV1 and ACR4 overlap in their expression domains in the distal root meristem and localize to the plasma membrane (PM) and plasmodesmata (PDs), where ACR4 preferentially accumulates. Using multiparameter fluorescence image spectroscopy (MFIS), we show that CLV1 and ACR4 can form homo- and heteromeric complexes that differ in their composition depending on their subcellular localization.ConclusionsWe hypothesize that these homo- and heteromeric complexes may differentially regulate distal root meristem maintenance. We conclude that essential components of the ancestral shoot stemness regulatory system also act in the root and that the specific interaction of CLV1 with ACR4 serves to moderate and control stemness homeostasis in the root meristem. The structural differences between these two meristem types may have necessitated this recruitment of ACR4 for signaling by CLV1

CCL1 is a major regulatory T cell attracting factor in human breast cancer

BACKGROUND Regulatory T cells (Treg) suppress cytotoxic T cell anti-tumoral immune responses and thereby promote tumor progression. Prevention of intratumoral Treg accumulation by inhibition of their migration to the tumor microenvironment is a promising therapeutic strategy. The aim of this study was to identify the role of the two major Treg-attracting chemokines CCL1 and CCL22 in human breast cancer. METHODS One hundred ninety-nine tissue samples of patients with invasive breast cancer were stained for CCL1 and CCL22 by immunohistochemistry. Chemokine expression and tumor infiltration by regulatory T cells, determined by expression of the transcription factor FoxP3, were quantified and their correlation to clinical features was statistically analyzed. RESULTS Both CCL1 and CCL22 were expressed in most breast cancer tissues. CCL1 was significantly over-expressed in invasive breast cancer as compared to normal breast tissue. CCL1, but surprisingly not CCL22, showed a significant correlation with the number of tumor-infiltrating FoxP3+ Treg (p< 0.001). High numbers of intratumoral CCL1 expressing cells were related to high grade tumors (G4) and a positive estrogen receptor (ER) status whereas high CCL22 expression was generally seen in lower grade tumors. The median survival of 88 patients with high intratumoral CCL1 expression was 37 months compared to 50 months for the 87 patients with low CCL1 levels, this trend was however not statistically significant. CONCLUSIONS We found a high expression of CCL1 in human breast cancer. CCL1 significantly correlated with the infiltration of immunosuppressive FoxP3+ Treg, that are known to negatively affect survival. Thus, CCL1 may serve as prognostic marker and novel therapeutic target in breast cancer

Sulfur trioxide formation/emissions in coal‐fired air‐ and oxy‐fuel combustion processes: a review

In oxy‐fuel combustion, fuel is burned using oxygen together with recycled flue gas, which is needed to control the combustion temperature. This leads to higher concentrations of sulfur dioxide and sulfur trioxide in the recycled gas, which can result in the formation of sulfuric acid and enhanced corrosion. Current experimental data on SO3 formation, reaction mechanisms, and mathematical modelling have indicated significant differences in SO3 formation between air‐ and oxy‐fuel combustion for both the wet and dry flue gas recycle options. This paper provides an extensive review of sulfur trioxide formation in air‐ and oxy‐fuel combustion environments, with an emphasis on coal‐fired systems. The first part summarizes recent findings on oxy‐fuel combustion experiments, as they affect sulfur trioxide formation. In the second part, the review focuses on sulfur trioxide formation mechanisms, and the influence of catalysis on sulfur trioxide formation. Finally, the current methods for measuring sulfur trioxide concentration are also reviewed along with the major difficulties associated with those measurements using data available from both bench‐ and pilot‐scale units

Precision and accuracy of single-molecule FRET measurements - a multi-laboratory benchmark study

Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is increasingly being used to determine distances, structures, and dynamics of biomolecules in vitro and in vivo. However, generalized protocols and FRET standards to ensure the reproducibility and accuracy of measurements of FRET efficiencies are currently lacking. Here we report the results of a comparative blind study in which 20 labs determined the FRET efficiencies (E) of several dye-labeled DNA duplexes. Using a unified, straightforward method, we obtained FRET efficiencies with s.d. between ±0.02 and ±0.05. We suggest experimental and computational procedures for converting FRET efficiencies into accurate distances, and discuss potential uncertainties in the experiment and the modeling. Our quantitative assessment of the reproducibility of intensity-based smFRET measurements and a unified correction procedure represents an important step toward the validation of distance networks, with the ultimate aim of achieving reliable structural models of biomolecular systems by smFRET-based hybrid methods

CUX1 (cut-like homeobox 1)

Review on CUX1 (cut-like homeobox 1), with data on DNA, on the protein encoded, and where the gene is implicated

Funktionelle Analyse von CUX1 in tumorassoziierten Makrophagen des Pankreaskarzinoms

Das Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) zeigt eine charakteristische Stromareaktion mit einer hohen Anzahl tumorinfiltrierender Makrophagen (TAM). Obwohl bekannt ist, dass eine hohe Anzahl von TAMs mit einer Verschlechterung der Prognose einhergeht, ist die Rolle dieses Zelltyps im Pankreaskarzinom nur teilweise verstanden. Mehrere Studien haben gezeigt, dass Makrophagen aus humanen und murinen Tumoren, u. a. auch PDAC, einen progressionsfördernden M2- oder alternativ aktivierten Phänotyp aufweisen. Der Transkriptionsfaktor CUX1 ist bekannt als wichtiger Mediator der Tumorprogression und ist assoziiert mit einer negativen Prognose. Die tumorfördernden Effekte von CUX1 wurden bisher vor allem seiner promigratorischen, proproliferativen und antiapoptotischen Wirkung in Tumorzellen zugeschrieben. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass CUX1 nicht nur von den Tumorzellen, sondern auch von den TAMs des PDAC exprimiert wird. Eine Analyse der CUX1-Expression in humanen Karzinomgeweben und einem genetischen Mausmodell des PDAC zeigten eine gesteigerte CUX1-Expression in Makrophagen aus Tumorgewebe. TGF-β, ein wichtiger Mediator der Tumorprogression, der in PDAC-Geweben stark exprimiert ist, wurde als Stimulator der CUX1-Expression in Makrophagen identifiziert. Mittels Überexpression und siRNA-vermitteltem Knockdown von CUX1 wurden eine Reihe von Zytokinen als durch CUX1 reprimiert identifiziert, welche mit dem im allgemeinen als antitumoral wirksamen M1-Phänotyp von Makrophagen assoziiert sind. Für zwei Zytokine, CCL5 und CXCL10, wurden die dieser Repression zugrunde liegenden Mechanismen durch Reporter-Assays, DNA-Pulldown-Experimente und Immunopräzipitationen weiter untersucht. CUX1 wurde als direkter Interaktionspartner von NF-κBp65 identifiziert, der dessen Bindung an die Zytokinpromotoren inhibiert. Darüber hinaus reduziert CUX1 die Acetylierung von NF-κB p65 an Lysin 310, vermutlich durch Rekrutierung von HDAC1. Passend zu diesen M1-antagonisierenden Effekten, inhibiert CUX1 in Makrophagen funktionell durch eine Veränderung sezernierter Zytokine die Attraktion von zytotoxischen T-Zellen und fördert die Angiogenese in vitro. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit CUX1 als wichtiger Modulator des Makrophagen-Phänotyps und der Makrophagen-Funktion sowie Antagonist der NF-κB-abhängigen Genexpression identifiziert. Dieses Wissen könnte zu einem besseren Verständnis der tumorfördernden Eigenschaften von Makrophagen beitragen und als neuer therapeutischer Ansatzpunkt dienen

Carbon Monoxide Formation in Oxy-Fuel Combustion

Compared to air-fired flames, an increased in-flame CO concentration has been observed in oxy-fuel combustion. This work analyses the possible explanations for this increase in CO formation. A combustion model is used to investigate the impact of critical combustion parameters on the CO formation routes within a gaseous and lignite fired oxy-fuel flame. In gas-fired oxy-fuel flames the CO formation is promoted by a homogenous reaction between hydrogen radicals and CO2. However, in lignite-fired oxy-fuel combustion, the gaseous reaction route is of less importance to inflame CO formation. Instead CO2 gasification is the largest contributor to the increased CO formation compared to air firing. The substitution of CO2 with steam in the oxidizer during wet oxy-fuel combustion has moderate influence on the CO2 gasification whereas the homogenous CO formation is strongly reduced