Probing entry inhibitors' activity on HIV and development of new fusion inhibitors : integrating evolutionary biology with virology

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The general aims of this thesis were: 1) to examine the C2, V3 and C3 envelope regions ofHIV-1 and HIV-2 at the molecular, evolutionary and structural levels; 2) to compare HIV-1and HIV-2 susceptibility to entry inhibitors and assess their potential value in HIV-2therapy; 3) to produce a new fusion inhibitor peptide using evolutionary biology basedstrategies.In the first study (Chapter 2), HIV-1 and HIV-2 were compared at the molecular,evolutionary and structural levels in the C2, V3 and C3 envelope regions. We identifiedsignificant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2,V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. In particular, we found that V3 in HIV-2is less exposed and more conserved than in HIV-1, suggesting fundamental differences inthe biology and infection of these viruses as well as in their susceptibility to entryinhibitors.In the second study (Chapter 3) we measured the baseline susceptibility of HIV-1 and HIV-2primary isolates to different fusion inhibitors and coreceptor antagonists, includingenfuvirtide (T-20) and maraviroc (MVC). MVC inhibited HIV-2 R5 variants at significantlyhigher IC90 concentrations than HIV-1 variants. Moreover, as previously found in HIV-1,susceptibility of HIV-2 R5 variants to MVC was inversely related with CD4+ T cell counts attime of virus isolation. These results suggest that the structure of the envelope complex ofR5 variants changes along the course of infection. More importantly, the results call fornew clinical studies to evaluate the efficacy of MVC in HIV-2 infection and to determine itsbest therapeutic dosage in early and late stage disease. We also provide definitiveevidence demonstrating that T-20 is not useful for HIV-2 therapy.In the final study (Chapter 4), we designed a new HIV fusion inhibitor peptide (P3) basedon the ancestral sequences of the HIV-2 and SIV envelope genes. P3 has an a-helixstructure as demonstrated by circular dichroism. It has broad antiviral activity at thenanomolar range against HIV-1 and HIV-2 primary isolates, including HIV-1 variantsresistant to T-20. Binding ELISA assays and selection of resistant mutants suggest that P3prevents viral fusion by binding to the transmembrane protein in the HR1 region. Thesestudies provide proof of concept that viable antiviral peptides can be constructed usingevolutionary biology strategies. Such strategies should be explored to enhance theproduction of peptide drugs and vaccines.O Vírus da Imunodeficiência Humana do tipo 1 e do tipo 2 (VIH-1 e VIH-2) são os agentes etiológicos do Síndrome de Imunodeficiência Adquirida (SIDA). Embora sejam semelhantes na sua organização estrutural e genómica, estes lentivírus humanos apresentam características antigénicas distintas e partilham uma semelhança genética de apenas 50%. Enquanto o VIH-1 é responsável pela pandemia mundial, a infecção pelo VIH-2 localiza-se sobretudo na África Ocidental, em alguns países europeus como Portugal e França, e na Índia. A infecção pelo VIH-2 tem melhor prognóstico, a progressão para a doença é mais lenta e há melhor controlo imunológico do que na infecção pelo VIH-1. Ao contrário do VIH-1, o arsenal terapêutico actualmente disponível para tratar a infecção por VIH-2 é reduzido. Os fármacos antiretrovirais em uso foram especificamente desenvolvidos para o VIH-1 e, consequentemente, a sua actividade pode ser reduzida ou nula no VIH-2. Este é o caso concreto dos inibidores não nucleosídicos da transcriptase reversa e de alguns inibidores da protease. Neste contexto, os inibidores de entrada poderão ser úteis para tratar a infecção por VIH-2. Contudo, a susceptibilidade dos isolados primários de VIH-2 aos inibidores de entrada é actualmente desconhecida. A susceptibilidade do VIH aos inibidores de entrada é determinada pela qualidade da interacção do vírus com os receptores celulares. O VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes a este nível. Por exemplo, o VIH-2 pode ligar-se ao co-receptor CCR5 independentemente do receptor CD4 e da região V3 do invólucro. Por outro lado, as regiões C2, V3 e C3 do VIH-2 são substancialmente diferentes do VIH-1 a nível antigénico. Colectivamente, estes dados indicam que a estrutura e conformação das glicoproteínas de superfície do VIH-1 e VIH-2 são substancialmente diferentes e sugerem que a susceptibilidade e resistência dos dois tipos de vírus aos inibidores de entrada podem também ser diferentes. Os principais objectivos desta tese foram: 1) analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas das regiões C2, V3 e C3 no VIH-1 e VIH-2; 2) comparar a susceptibilidade do VIH-1 e VIH-2 aos inibidores de entrada e avaliar o seu potencial terapêutico na infecção por VIH-2; 3) produzir um novo inibidor de fusão para o VIH-2. Para melhor compreender as potenciais diferenças destes dois vírus na resposta aos inibidores de entrada começámos por analisar as características moleculares, estruturais e evolutivas da região V3 e as regiões circundantes C2 e C3, num número significativo de vírus VIH-1 e VIH-2 isolados em Portugal e noutras regiões do globo, com recurso a diferentes metodologias de biologia evolutiva e computacional (Capitulo 2). Apesar da menor variabilidade das 3 regiões no VIH-2, verificámos que a região C3 está sob forte selecção positiva e encontra-se exposta à superfície sugerindo que, tal como no VIH-1, esta região poderá constituir um domínio neutralizante. No entanto, ao contrário do VIH-1, a maioria das mutações adaptativas no VIH-2 são prejudiciais e levam à extinção das linhagens virais pelo que o efeito final é um forte constrangimento à variabilidade das regiões analisadas. Ao contrário do VIH-1, verificámos que a ansa V3 do VIH-2 se encontra oclusa no complexo glicoproteico do invólucro, numa conformação que parece ser estabilizada por interacções que mantém com alguns resíduos da regiões C2 e C3. Estes resultados são consistentes com o facto de a V3 não ser imunodominante no VIH-2, ficando assim mais protegida da resposta imunitária e das eventuais mutações que dela resultam. A forte conservação da V3, da C2 e da C3 também é consistente com a sua potencialmente importante actividade imunosupressora. Em conclusão, este primeiro estudo permitiu caracterizar algumas das características estruturais e funcionais que distinguem as glicoproteínas do invólucro do VIH-1 e do VIH-2 e que estão associadas às diferentes características biológicas e fenotípicas destes dois vírus. Estes dados podem ter impacto na resposta dos dois vírus aos inibidores de entrada (analisado no Capítulo 3) e no desenvolvimento de novas vacinas. No segundo estudo (Capítulo 3) comparámos a actividade antiviral dos antagonistas dos coreceptores (AMD3100, TAK-779 e maraviroc) e dos inibidores de fusão (T-20 e T-1249) entre um grupo de 20 isolados de VIH-2 (19 isolados primários + um isolado laboratorial) e nove isolados de VIH-1 (sete isolados primários + dois isolados laboratoriais). Verificámos que a sensibilidade ao AMD3100 e ao TAK-779 é semelhante no VIH-1 e o VIH-2. No entanto, o perfil da curva dose-resposta do maraviroc (MVC) obtido para os isolados R5 foi diferente nos dois tipos de vírus. No VIH-2 os valores de IC90 foram significativamente mais elevados do que no VIH-1; por outro lado, os declives da curva dose-resposta foram mais baixos no VIH-2 do que no VIH-1. Colectivamente, estes resultados sugerem que poderão ser necessárias concentrações mais elevadas de MVC para tratar os doentes infectados pelo VIH-2. Adicionalmente, encontrámos uma correlação forte e de sentido inverso entre as susceptibilidade do VIH-2 ao MVC e o número de células T CD4+ dos doentes quando os vírus foram isolados. Vírus isolados em doentes em fase de SIDA foram menos susceptíveis ao MVC do que os vírus isolados em doentes com uma contagem de células T CD4+ superior a 200 células/ul. Ao contrário do VIH-1 não encontrámos qualquer correlação entre a carga da V3 e a susceptibilidade dos isolados R5 de VIH-2 ao MVC. De um modo geral, os nossos resultados sugerem que são necessários ensaios clínicos para avaliar a efectividade do MVC na infecção pelo VIH-2, determinar a dose terapêutica mais adequada e esclarecer se é necessário fazer um ajuste de dose de acordo com a fase da doença. Adicionalmente, e uma vez que isolados VIH-2 X4 e populações duplas/mistas são totalmente ou parcialmente resistentes ao MVC, é de extrema importância o desenvolvimento de um ensaio de tropismo (genotípico e/ou fenotípico) para o VIH-2 de modo a determinar o tropismo antes do início da terapia com MVC. Sem o conhecimento prévio do tropismo viral, o tratamento com MVC poderá seleccionar espécies X4 minoritárias que estão associadas a maior resistência à neutralização e uma progressão mais rápida da doença. No que diz respeito aos inibidores de fusão, verificámos que o T-20 tem actividade reduzida no VIH-2, confirmando estudos anteriores realizados com dois isolados laboratoriais. Por outro lado, observámos uma elevada susceptibilidade deste vírus ao T- 1249, indicando que os inibidores de fusão são potencialmente eficazes na infecção pelo VIH-2. Assim, o desenvolvimento de um novo inibidor de fusão do VIH-2 foi o objectivo do último estudo desta tese (Capítulo 4). No Capítulo 4, desenvolvemos novos péptidos inibidores de fusão a partir da reconstrução de sequências ancestrais da glicoproteína gp36 do invólucro de VIH-2 e de Vírus de Imunodeficiência dos Símios (VIS). Com esta abordagem inovadora pretendemos incorporar a história evolutiva dos vírus na sequência dos péptidos e desta forma melhorar a tolerância destas moléculas aos polimorfismos naturais da sua região alvo bem como às mutações de resistência seleccionadas na sua presença. Obteve-se um péptido ancestral (P3) constituído por 34 aminoácidos, cuja sequência corresponde às posições homólogas 628 – 661 da proteína Env do isolado VIH-1 HXB2 (ou 623 – 656 do isolado VIH-2 ROD). A sequência do P3 difere em 21 aminoácidos da sequência consenso de VIH-1, 14 aminoácidos da sequência do T-20 e 6 aminoácidos da sequência consenso de VIH-2. Ao contrário da natureza não-estruturada do T-20, o P3 tem uma conformação típica em hélice-a, o que lhe poderá conferir maior a estabilidade contra a degradação proteolítica, bem como maior afinidade para a região alvo. Por outro lado, o P3 foi facilmente solúvel em soluções aquosas o que é uma vantagem num futuro desenvolvimento de uma fórmula farmacêutica. O P3 demonstrou ter uma forte actividade antiviral contra isolados primários e laboratoriais de VIH-1 e VIH-2 (IC50 médio, 11 nM para o HIV-1 e 63.8 nM para o HIV-2), incluindo variantes resistentes ao T-20 (IC50, 0.15 – 11.8 nM). Através da passagem consecutiva de vírus em cultura na presença do péptido, foi seleccionada uma mutação de resistência na região HR1 da gp41 (VIH-1), a qual é responsável pela redução da susceptibilidade do VIH-1 ao P3 em 120x. Nas mesmas condições, e após 60 dias em cultura, não foi possível seleccionar mutações de resistência ao P3 no VIH-2. Estes resultado, em conjugação com a sua forte ligação à glicoproteína transmembranar de um isolado de VIH-2, indicam que, tal como outros péptidos baseados na região HR2 (T-20, T- 1249), o P3 inibe a entrada do VIH pela interacção com a região HR1 da gp41 e sugerem que a barreira genética para a resistência ao P3 é significativamente superior no VIH-2 do que no VIH-1. Neste estudo demonstrámos ainda que o P3 é significativamente menos antigénico do que o T-20 nos doentes infectados pelo VIH-1 o que poderá traduzir-se numa maior duração da eficácia clínica do P3 em comparação com o T-20. Os resultados obtidos com o P3 demonstram pela primeira vez que é possível desenvolver péptidos com actividade antiviral significativa utilizando metodologias de biologia evolutiva, pelo que esta abordagem poderá ser explorada no futuro para a produção de medicamentos peptídicos e, eventualmente, de vacinas

Cinema and Educational Values. The Search for an Effective Formation Tool

Se presenta un trabajo sobre el uso del cine como instrumento para educación en valores, predominantemente los educativos y académicos. Se intentó averiguar si el alumnado de 4º de ESO podía percibir, en una muestra de películas seleccionadas ad hoc, los valores pro- puestos como asignatura transversal en su Plan de estudios. El proceso se desarrolló durante el segundo cuatrimestre del curso 2003-2004 en el IES Tierra de Lagunas de Lantejuela (Sevilla). Los resultados fueron alentadores tanto en la implicación y colaboración del alumnado en los valores observados, que se categorizaron por medio de análisis de contenido. Palabras clave: Cine, valores, formación del alumnado, educación en valores, acción docente, aprendizaje en el cine.It s presented a project about the use of the cinema like an instrument for education in values, both in educationals and academics. We tried to find out if the students of fourth year at Secundary School could apreciate, in a a sample of selections films «ad hoc», the moral suggested values like a transverse subject in the moral suggeted values like a transverse subject in their curriculum. The process was developed during the second and third term of the 2003 - 2004 curse in the Secundary School «Tierra de Lagunas» (Lantejuela - Sevilla). The results were succesful as for both implication and students collaboration in the observated values that were categoried by the analysis of contents

An updated overview on the relationship between human gut microbiome dysbiosis and psychiatric and psychological disorders

Existe mucha evidencia que establece que el desarrollo del sistema nervioso está relacionado con la composición y funciones del microbioma intestinal. Además, el sistema nervioso central (SNC) controla el desequilibrio de la microbiota intestinal, constituyendo un sistema de comunicación bidireccional. En la actualidad, se han descrito varias rutas de comunicación entre el intestino y el cerebro, incluidos circuitos inmunológicos, endocrinos y neuronales a través de la vía vagal. Varios datos empíricos han asociado alteraciones de la microbiota intestinal (disbiosis) con enfermedades neuropsiquiátricas, como Enfermedad de Alzheimer, autismo y enfermedad de Parkinson, y con otros trastornos psicológicos, como ansiedad y depresión. La terapia de trasplante de microbiota fecal (FMT) ha demostrado que la microbiota intestinal puede transferir características de comportamiento a los animales receptores, lo que proporciona pruebas sólidas para establecer una relación causal-efecto. Las intervenciones, basadas en prebióticos, probióticos o simbióticos, han demostrado una importante influencia de la microbiota en los trastornos neurológicos mediante la síntesis de compuestos neuroactivos que interactúan con el sistema nervioso y por la regulación de procesos inflamatorios y endocrinos. Se necesitan más investigaciones para demostrar la influencia de la disbiosis de la microbiota intestinal en los trastornos psiquiátricos y psicológicos, y cómo las intervenciones basadas en la microbiota pueden usarse como posibles herramientas terapéuticas.Funding for open access charge: Universidad de Málaga / CBU

Christine Angot : una hetero-homosexual incestuosa

El proyecto literario de Christine Angot en L'inceste (1999) es el de desvelar no su historia incestuosa -ella misma afirma que su libro no es una autobiografía- sino el hacer visible lo más reprimido, lo más oculto y a la vez lo más originario de nuestra Cultura: el incesto con la madre. Un incesto que puede ser real o imaginario, y que el trabajo de escritura desvela y configura sus territorios que van desde la fusión con la madre, característica de toda situación preedípica, hasta una relación homosexual real con su doble narcisista, pasando por el deseo incestuoso por su hija. Mundo sin castración en donde todo puede ser posible, en ese juego de "ser" y "no-ser", y en donde la temática del incesto está representada en el texto por una espacialidad vertical, de arriba abajo, generacional, madre/hija-Christine-Léonore, y horizontal, Christine-Marie Christine

Evaluating Labor Market Reforms: A General Equilibrium Approach

Job security provisions are commonly invoked to explain the high and persistent European unemployment rates. This belief has led several countries to reform their labor markets and liberalize the use of fixed-term contracts. Despite how common such contracts have become after deregulation, there is a lack of quantitative analysis of their impact on the economy. To fill this gap, we build a general equilibrium model with heterogeneous agents and firing costs in the tradition of Hopenhayn and Rogerson (1993). We calibrate our model to Spanish data, choosing in part parameters estimated with firm-level longitudinal data. Spain is particularly interesting, since its labor regulations are among the most protective in the OECD, and both its unemployment and its share of fixed-term employment are the highest. We find that fixed term contracts increase unemployment, reduce output, and raise productivity. The welfare effects are ambiguous.Fixed-term contracts, Firing costs, General equilibrium, Heterogeneous agents

EVALUATING LABOR MARKET REFORMS: A GENERAL EQUILIBRIUM APPROACH

Job security provisions are commonly invoked to explain the high and persistent European unemployment rates. This belief has led several countries to reform their labor markets and liberalize the use of fixed-term contracts. Despite how common such contracts have become after deregulation, there is a lack of quantitative analysis of their impact on the economy. To fill this gap, we build a general equilibrium model with heterogeneous agents and firing costs in the tradition of Hopenhayn and Rogerson (1983). We calibrate our model to Spanish data, choosing in part parameters estimated with firm-level longitudinal data. Spain is particularly interesting, since its labor regulations are among the most protective in the OECD, and both its unemployment and its share of fixed-term employment are the highest. We find that fixedterm contracts increase unemployment, reduce output, and raise productivity. The welfare effects are ambiguous.

Algunos ejemplos de influencia de los procesos antrópicos en el medio sedimentario : la ría de Huelva

En la confluencia de las de sembocaduras de los ríos Odiel y Tinto, litoral suroeste de la Península Ibérica, se conforma un medio sedimentario de características mareales acusadas,\ud siendo el litoral de rango mesomareal.\ud Se describen los efectos derivados de tres construcciones antrópicas en la ría de Huelva. Las salinas de isla Bacuta han propiciado la hipersalinización del entorno. El dique\ud de contención de arenas del puerto de Huelva ha aumentado la velocidad de los ciclos mareales\ud y la contención de los ganchos arenosos, favoreciendo también la instalación de un medio\ud de playa en la cara expuesta. Y las balsas de yeso, construidas para albergar residuos industriales,\ud han destruido totalmente las zonas de marismas.At the Odiel and Tinto river mouths, Southwetern Iberian Peninsula, a tidal sedimentary environment is constituted, being the tidal range mesotidal. Three antropic builds up and its derived influences are desctibed. So that, the\ud Bacuta island salinas has produced the salt increasing of the geographic context. The bank\ud of Huelva port has modified the time/velocity relation in the tidal cycles, as well the stopping\ud of bar sands and the generation of a beach environment at the external face of this\ud bank. And the presence of gypsum, safts, to storing industrial residues, has completely destroyed\ud the marsh environments

New Perspectives in Monitoring Drinking Water Microbial Quality

The safety of drinking water is evaluated by the results obtained from faecal indicators during the stipulated controls fixed by the legislation. However, drinking-water related illness outbreaks are still occurring worldwide. The failures that lead to these outbreaks are relatively common and typically involve preceding heavy rain and inadequate disinfection processes. The role that classical faecal indicators have played in the protection of public health is reviewed and the turning points expected for the future explored. The legislation for protecting the quality of drinking water in Europe is under revision, and the planned modifications include an update of current indicators and methods as well as the introduction of Water Safety Plans (WSPs), in line with WHO recommendations. The principles of the WSP approach and the advances signified by the introduction of these preventive measures in the future improvement of dinking water quality are presented. The expected impact that climate change will have in the quality of drinking water is also critically evaluated

Semantics for incident identification and resolution reports

In order to achieve a safe and systematic treatment of security protocols, organizations release a number of technical briefings describing how to detect and manage security incidents. A critical issue is that this document set may suffer from semantic deficiencies, mainly due to ambiguity or different granularity levels of description and analysis. An approach to face this problem is the use of semantic methodologies in order to provide better Knowledge Externalization from incident protocols management. In this article, we propose a method based on semantic techniques for both, analyzing and specifying (meta)security requirements on protocols used for solving security incidents. This would allow specialist getting better documentation on their intangible knowledge about them.Ministerio de Economía y Competitividad TIN2013-41086-

Apuntes sobre la Real Academia de Declamacion y Buenas Letras de Malaga

Copia digital : Diputación de Málaga. Biblioteca Canovas del Castillo, 201