The links between membrane actin assembly by mycobacterial phagosomes and phagosome maturation, macrophage activation and pathogen killing

Tese de doutoramento em Farmácia (Biologia e Genética Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2008A infecção pelo Mycobacterium tuberculosis e por outra micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) é eficazmente controlada pelo sistema imunitário do hospedeiro em 90% dos casos. Contudo, embora os mediadores do sistema imunitário envolvidos neste processo estejam devidamente identificados e se saiba que o IFN desempenha um papel central é dificíl prever o desfecho de umainfecção por micobactérias. Por esta razão é premente estudar a interacçãomicobactéria-hospedeiro ao nível molecular de forma a identificar potenciais alvosterapêuticos para o controlo da tuberculose.As micobactérias são microrganismos intracelulares facultativos que sobrevivem nosmacrófagos alveolares ao nível dos fagossomas. Os macrófagos são células fagocíticasprofissionais com capacidade para eliminar invasores através da resposta imune inata.Esta inclui mecanismos como a produção de espécies radicalares de oxigénio e azoto, amaturação do fagossoma em fagolisossoma, produção de quimiocinas e a apresentaçãode antigénios micobacterianos ao sistema imunitário que resulta no desenvolvimento deuma imunidade adaptativa. As micobactérias patogénicas não só forçam a sua entradanos macrófagos como são capazes de persistir intracelularmente resistindo aos váriosmecanismos bactericidas dos macrófagos. A inibição da maturação do fagossoma emfagolisossoma pelas micobactérias patogénicas é apontada, à mais de três décadas,como a principal razão para o sucesso destes patogenes.Uma vez que a capacidade de subverter os mecanismos bactericidas dos macrófagos écaracterística das micobactérias patogénicas iniciamos este estudo com um parentedistante do M. tuberculosis, o M. smegmatis. Nesta parte do trabalho pretendemosidentificar os mecanismos bactericidas do macrófago activados por uma micobactérianão patogénica no decorrer da infecção que resultam na eliminação da mesma.Utilizando macrófagos de ratinho (J774 e BMM) verificamos que o M. smegmatisapresenta um perfil de sobrevivência intermédio entre o de uma micobactérias decrescimento lento como o M. tuberculosis e o apresentado por bactérias de crescimentorápido como a E. coli ou o Streptococcus. Estas últimas são eliminadas pelosmacrófagos em 4 h, enquanto que o M. smegmatis sobrevive intracelularmente até 48 hapresentando mesmo ciclos de multiplicação intracelular.viiPara verificar se este perfil de sobrevivência se deve apenas à micobactéria ou se ohospedeiro também desempenha um papel importante no desfecho da infecção usámosmacrófagos de vários hospedeiros . Em macrófagos de ratinho Raw e em macrófagosisolados do sangue periférico de voluntários saudáveis (HMDM) verificamos que o M.smegmatis era eliminado de uma forma contínua ao longo de 48 h.Assim, tomando partido da capacidade de replicação de M. smegmatis em J774 e dasvantagens técnicas proporcionadas por uma linha celular de rato iniciámos umaabordagem sitemática dos mecanismos envolvidos na eliminação desta micobactérianão patogénica de crescimento rápido pelos macrófagos ao longo de 24 h.O sistema estudado revelou-se extremamente dinâmico envolvendo um período inicialde morte (1-4 h), seguido de um período de replicação (4-8 h) e dois períodos de morte(8-12 h e 12-24 h). A síntese de óxido nítrico (NO) constitui o primeiro mecanismo dedefesa dos macrófagos mas a sua acção está circunscrita à primeira fase de morte. Aorganização de uma rede de actina e a fusão com organelos endocíticos tardioscoincidem com a primeira e última fase de morte. A reciclagem de marcadores de fasefluida e membranar do fagossoma coincidem com a fase de replicação micobacteriana(4-8 h). A acidificação e a aquisição de sub-unidades da bomba protónica (V-ATPase)pelo fagossoma apresentam um perfil diferente e coincidente com as fases tardias demorte. Além do mais, a colocalização da V-ATPase não é coincidente com a dosmarcadores característicos de endossomas tardios e lisosomas. A MAP cinase p38 écrucial para a regulação de todos os processos investigados, excepto a produção de NO,funcionando alternadamente a favor do hospedeiro ou do patogene. Um modelomatemático suporta a hipótese de que períodos alternados de actividade bactericida dacélula são mais eficazes para a elimição total de parasitas intracelulares do que umaactividade contínua.Umas vez definidos os perfis de sobrevivência/ morte intracelular de uma micobactérianão patogénica de crescimento rápido resolvemos estender a mesma abordagem amicobactérias de crescimento lento avirulentas (Mycobacterium bovis BCG) ouvirulentas (M. bovis). Neste estudo foram utilizados macrófagos de ratinho (J774, Raw eBMM) e de dois hospedeiros naturais de M. bovis. Os macrófagos humanos utilizadosforam isolados a partir do sangue periférico ou da linha celular THP-1. Os macrófagosde bovino foram isolados a partir do sangue periférico de animais saudáveis (BMDM).O estudo dos perfis de sobrevivência demonstrou que o BCG é eliminado de uma formaviiicontínua em todos os macrófagos excepto nos HMDM onde após um ciclo de replicaçãoatinge um estádio estacionário ao fim de 3 dias de infecção. Os perfis de sobrevivênciaobservados para o M. bovis são distintos dos do BCG. A micobactéria virulentapermanece num estado de latência ou consegue replicar-se activamente em todos osmacrófagos estudados. Em nenhum dos casos se observou a eliminação destamicobactéria pelos macrófagos.Os macrófagos de ratinho J774 e os HMDM foram escolhidos para a realização deestudos mais detalhados. A nossa escolha recaiu nestas células porque apresentamperfis de sobrevivência distintos para as duas micobactérias utilizadas. O facto de seremde hospedeiros distintos (rato e Homem) permitiu avaliar a importância do hospedeirono desfecho da infecção.A produção de NO pelos macrófagos de ratinho desempenha um papel importante nocontrolo das infecções por estas micobactérias. À semelhança do anteriormenteobservado com M. smegmatis, a acção do NO e dos radicais reactivos de azoto (RNI)está limitada aos estádios precoces da infecção (3h-3dias) embora seja possível detectara produção de NO até ao sétimo dia de infecção. Em nenhum momento da infecção foipossível detectar uma associação entre a membrana do fagossoma micobacteriano e asintetase inductível do óxido nítrico (iNOS).Nas células humanas não foi possível detectar a produção de NO ao longo da infecção oque pode, pelo menos parcialmente, explicar a diferença observada nos perfis desobrevivência.As micobactérias patogénicas são conhecidas por bloquearem a fusão do fagossomacom o lisossoma evitando desta forma a exposição a alguns dos agentes bactericidasmais potentes do macrófago. Por esta razão, a acidificação do fagossoma contendoM.bovis spp e a sua fusão com vesículas endocíticas tardias e/ou lisossomas foi seguidaao longo de 7 dias. Os resultados obtidos demonstram que as duas micobactérias sãocapazes de interferir com a maturação do fagossoma. O fagossoma micobacteriano nãoadquire marcadores de maturação de fase tardia como a V-ATPase ou o ácido liso-bisfosfatídico(LBPA), não acidifica o suficiente para acumular o corante acidotrópicolysotracker ou fundir com endossomas tardios e/ou lisossomas. Contudo, o maissurpreendente nestes resultados é o facto de duas micobactérias com perfis desobrevivência distintos apresentarem perfis de aquisição de marcadores de maturaçãosemelhantes. Embora, não nos seja possível apresentar evidências experimentaisdirectas uma diferente sensibilidade das duas estirpes de micobactérias à acção deixefectores como os RNI e o hidrogenião podem explicar estes resultados. In vitro aestirpe virulenta de M. bovis revelou ser mais resistente à acção do pH ácido e do NO doque o BCG. A realização de estudos em culturas de macrófagos com inibidores dabomba protónica e da iNOS confirmaram os resultados obtidos in vitro.A última parte do trabalho consistiu na modulação da resposta inflamatória dosmacrófagos e no estudo do seu impacto nas infeções por micobactérias. A modulação dosistema foi efectuada através da adição de lípidos. A nossa escolha recaiu sobre estassubstâncias porque (i) existem estudos epidemiológicos que suportam a associação entreuma dieta rica em lípidos omega-3 e uma elevada incidência de tuberculose, (ii) estudosanteriores em culturas celulares infectadas com o bacilo da tuberculose demonstraramque o tratamento com estes lípidos provocam efeitos semelhantes, (iii) os lípidos sãoimportantes para a regulação da nucleação da actina e consequentemente para amaturação do fagossoma em fagolisossoma.O tratamento das culturas de macrófagos com ácido eicosopentaenoico (EPA), ácidoaraquidónico (AA) e ceramida (Cer) produziram efeitos distintos. O lípido omega-3(EPA) estimula a sobrevivência do bacilo da tuberculose enquanto que o omega-6 (AA)e a ceramida exercem o efeito contrário. A ceramida foi incluída neste estudo por estarintimamente ligada com as vias biosintéticas do AA.A MAP cinase p38 é importante na sinalização pró-inflamatária durante as infecções bacterianas. Neste contexto resolvemos estudar o efeito dos diferentes lípidos na actividade desta cinase. Uma vez mais o EPA apresentou efeitos distintos do AA e da ceramida. O primeiro lípido não estimula a activação da p38 ao contrário do AA e da ceramida. A infecção das culturas de macrófagos com o bacilo da tuberculose alteraradicalmente a sinalização para a p38. O bacilo é capaz de bloquear a activação destacinase nos estádios precNon pathogenic mycobacteria are cleared from macrophages within 24 - 48 h while pathogenic mycobacteria can persist in the same cells for long periods of time. Using the non-pathogenic fast growing Mycobacterium smegmatis and two slow growing mycobacteria with distinct virulence (M. bovis BCG Pasteur and M. bovis) we start a systematic study to elucidate the role of different killing mechanisms during mycobacteria infection. Although all mycobacteria reside in phagosomes the acquisition of maturation markers were distinct for M. smegmatis and M. bovis spp. Thus different mycobacteria live and are killed in distinct compartments. Nevertheless, macrophage control of mycobacteria infections seems to follow a well established program where different killing mechanisms play a role at different times of infection. NO production is the first killing mechanism involved then phagossome maturation resulting in acidification of phagosome content and acquisition of lysosomal enzymes are also involved. Since inhibition of phagosome maturation plays a central role in mycobacteria pathogenesis we try to identify key regulators of this process. Previous studies shown that actin nucleation plays an important role in this process. In the present study we provide evidence that MAP kinase p38, a central player in the pro-inflamatory response to bacteria infection, regulates actin assembly by non-pathogenic mycobacteria containing phagosomes at early stages of infection. This kinase is a key regulator of all killing mechanisms except NO production. In the last part of the work we studied the modulation of the host defense mechanism by lipid treatment. This approach is supported by (i) the well established link between particular diets and tuberculosis incidence and (ii) recent results by Anes group showing that omega-3 and omega-6 lipids had opposite effects in M. tuberculosis survival in macrophages mediated probably by their ability to regulate actin nucleation and phagosome maturation. At the macrophage level, in general, the effects of Cer and/or AA were opposite to those of EPA, but in many infection stages these pro- and anti-inflammatory lipids were capable of reversing the signalling states between killing and survival. The effects of Cer and EPA were in part regulated by p38 MAP Kinase. These results argue against the idea of considering a simple recommended lipid-based diet against mycobacteria.Fundação para a Ciência e Tecnologia (Projectos: FEDER POCTI/BCI/38983/2001; POCI/BIABCM/55327/2004 e bolsa de doutoramento SFRH / BD / 14284 /2003

Bacterial biofilms, antibiotic resistance and healthcare-associated infections: a dangerous connection

In 2012, were estimated 6.7 million cases of healthcare-associated infections (HAI) either in long-term care facilities or acute-care hospitals from which result 37,000 deaths configuring a serious public health problem [1]. The etiological agents are diverse and often resistant to antimicrobial agents. One of the mechanisms responsible for the emergence of drug resistance is biofilm assembly. Biofilms are defined as thin layers of microorganisms adhering to the surface of a structure, which may be organic or inorganic, together with the polymers that they secrete [2]. They are dynamic structures which experience different stages of organization with the ageing and are linked to an increase in bacterial resistance to host defense mechanisms, antibiotics, sterilization procedures other than autoclaving, persistence in water distribution systems and other surfaces. The understanding of bacteria organization within the biofilm and the identification of differences between planktonic and sessile forms of bacteria will be a step forward to fight HAIs. Bacterial isolates were grown in adequate medium. Antibiotic susceptibility was evaluated by broth microdilution method and interpreted according to NCCLS guidelines. A similar assay was performed to evaluate biofilm susceptibility to antibiotics. Bacteria ability to assemble biofilms was assayed by the microtiter-plate test [3] being tested in both abiotic (materials present in healthcare units) and biotic (Hella cells) surfaces. The biofilm structure was assessed by scanning electron microscopy (SEM) in either backscattered electron diffraction or secondary electrons mode. The kinetic of biofilm assembly depends on bacteria growth rate, incubation temperature and medium. Furthermore, the SEM analysis of planktonic and sessile forms of the same bacteria allowed the identification of structural differences which may be involved in virulence (Fig. 1). Bacteria ability to assemble biofilms seems to be independent of the abiotic structure (Fig.2). The same is not observed in biotic surfaces. This fact suggests that biofilm assembly in vivo is dependent of bacteria tropism. The minimum inhibitory concentration (MIC) determine for bacteria organized in biofilms is higher than for their planktonic forms. The increase ranges from 2 to 200 folds and is proportional to the ability of bacteria to assemble biofilms. Further studies will be conducted in order to prevent biofilm assembly within healthcare units which will result in a decrease of HAI and emergence of antibiotic resistant bacteria

Exploring dangerous connections between Klebsiella pneumoniae biofilms and healthcare-associated infections

Healthcare-associated infections (HAI) are a huge public health concern,particularly when the etiological agents are multidrug resistant. The ability of bacteria to develop biofilm is a helpful skill, both to persist within hospital units and to increase antibiotic resistance. Although the links between antibiotic resistance, biofilms assembly and HAI are consensual, little is known about biofilms. Here, electron microscopy was adopted as a tool to investigate biofilm structures associated with increased antibiotic resistance. The K. pneumoniae strains investigated are able to assemble biofilms, albeit with different kinetics. The biofilm structure and the relative area fractions of bacteria and extracellular matrix depend on the particular strain, as well as the minimal inhibitory concentration (MIC) for the antibiotics. Increased values were found for bacteria organized in biofilms when compared to the respective planktonic forms, except for isolates Kp45 and Kp2948, the MIC values for which remained unchanged for fosfomycin. Altogether, these results showed that the emergence of antimicrobial resistance among bacteria responsible for HAI is a multifactorial phenomenon dependent on antibiotics and on bacteria/biofilm features

Biofilms, nontuberculous mycobacteria and infection

As micobactérias não tuberculosas (MNTs) são agentes infeciosos emergentes responsáveis por infeções diversas, nomeadamente infeções associadas aos cuidados de saúde. Neste trabalho foi avaliada a capacidade de formação de biofilmes por duas MNTs (M. smegmatis e M. chelonae). Os biofilmes foram caracterizados utilizando microscopia eletrónica e a eficácia de diversos desinfetantes foi avaliada contra MNTs recuperadas de biofilmes. Os resultados obtidos demonstram que as MNTs são capazes de formar biofilmes em materiais presentes em ambiente hospitalar e de resistir à ação de diversos desinfetantes.Non-tuberculous mycobacteria (NTMs) are emerging infectious agents responsible for various infections, namely, health-care-associated infections. In this work, biofilms assembly by two NTMs (M. smegmatis and M. chelonae) was assessed. Biofilms were characterized using electron microscopy and the ef ficacy of several disinfectants was determined against NTMs recovered from biofilms. The results obtained demonstrate that NTMs are able to assemble biofilms on materials present in a hospital environment and to resist the action of various disinfectants.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Pathogens in ornamental waters: a pilot study

In parks, ornamental waters of easy access and populated with animals are quite attractive to children and yet might hide threats to human health. The present work focuses on the microbiota of the ornamental waters of a Lisboa park, characterized during 2015. The results show a dynamic microbiota integrating human pathogens such as Klebsiella pneumoniae, Aeromonas spp. and Enterobacter spp., and also antibiotic resistant bacteria. K. pneumoniae and Aeromonas spp. were present as planktonic and biofilm organized bacteria. In vitro K. pneumoniae and Aeromonas spp. showed an enhanced ability to assemble biofilm at 25 C than at 37 C. Bacteria recovered from biofilm samples showed an increased antibiotic resistance compared to the respective planktonic counterparts.Fundação para a Ciência e Tecnologia for the grant PEst-OE/CTM/UI0084/2011

Espécies exóticas em lagos ornamentais: adorno ou fonte de desequilíbrio?

Este trabalho teve como objetivo analisar a evolução sazonal da população de microrganismos dum lago ornamental da região de Lisboa

The preyssler-type polyoxotungstate exhibits anti-quorum sensing, antibiofilm, and antiviral activities

The increase in bacterial resistance to antibiotics has led researchers to find new compounds or find combinations between different compounds with potential antibacterial action and with the ability to prevent the development of antibiotic resistance. Polyoxotungstates (POTs) are inorganic clusters that may fulfill that need, either individually or in combination with antibiotics. Herein, we report the ability of the polyoxotungstates (POTs) with Wells-Dawson P2W18, P2W17, P2W15, and Preyssler P5W30 type structures to differently affect Gram-negative and Gram-positive microorganisms, either susceptible or resistant to antibiotics. The compound P5W30 showed the highest activity against the majority of the tested bacterial strains in comparison with the other tested POTs (P2W15, P2W17 and P2W18) that did not show inhibition zones for the Gram-negative bacteria, A. baumanii I73775, E. coli DSM 1077, E. coli I73194, K. pneumoniae I7092374, and P. aeruginosa C46281). Generally, the results evidenced that Gram-positive bacteria are more susceptible to the POTs tested. The compound P5W30 was the one most active against S. aureus ATCC 6538 and MRSA16, reaching <0.83 mg·mL−1 (100 µM) and 4.96 mg·mL−1 (600 µM), respectively. Moreover, it was verified by NMR spectroscopy that the most promising POT, P5W30, remains intact under all the experimental conditions, after 24 h at 37 ◦C. This prompted us to further evaluate the anti-quorum sensing activity of P5W30 using the biosensor Chromobacterium violaceum CV026, as well as its antibiofilm activity both individually and in combination with the antibiotic cefoxitin against the methicillin-resistant Staphylococcus aureus 16 (MRSA16). P5W30 showed a synergistic antibacterial effect with the antibiotic cefoxitin and chloramphenicol against MRSA16. Moreover, the antibiofilm activity of P5W30 was more pronounced when used individually, in comparison with the combination with the antibioticcefoxitin. Finally, the antiviral activity of P5W30 was tested using the coliphage Qβ, showing a dosedependent response. The maximum inactivation was observed at 750 µM (6.23 mg·mL−1 ). In sum, P5W30 shows anti-quorum sensing and antibiofilm activities besides being a potent antibacterial agent against S. aureus and to exhibit antiviral activities against enteric viruses.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Characterization of the bacterial population in water dams of the Sado watershed

As barragens são fundamentais para a gestão dos recursos hídricos. Estas infraestruturas permitem regular os caudais e aproveitar a água para diversas atividades como a agricultura, pecuária, captação para consumo humano e turismo (p.e. praias fluviais e despor tos aquáticos). Neste estudo, foi avaliada a flora bacteriana (planctónica e organizada em biofilmes) presente em 4 barragens da bacia hidrográfica do rio Sado. A caracterização da flora bacteriana presente para além de permitir a caracterização do ecossistema permite inferir sobre potenciais riscos para a saúde humana decorrentes dos diversos usos da água.Water dams are crucial for water management. These inf rastructures al low the control of water f lows and usage of water for acti vi ties such as agr iculture, li vestock, for human consumption and tour ism (e.g. beaches and aquatic spor ts). In this study, the bacter ial f lora present in four dams located at the hydrographic basin of Sado r i ver was evaluated (plank tonic and organized in biof ilms). The character ization of the bacter ial f lora al lows the character ization of the ecosystem and speculate about the potential r isks for human heal th caused by water usage for di f ferent applications.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Religious experience and aesthetic experience in plastic artists : perspectives from the psychology of religion

Pode a experiência religiosa ser substituída pela experiência estética? Os estudiosos se dividem na resposta. Situando a pergunta no quadro de referência conceitual e epistemológico que distingue entre religião substantiva e religião funcional, levantamos a hipótese de que não há substituição substantiva, mas pode haver substituição funcional entre essas experiências. Levantamos a hipótese ulterior de que a experiência estética pode ser uma experiência do sagrado. As hipóteses foram examinadas com os dados obtidos em entrevistas com oito renomados artistas plásticos, por ocasião da 23ª Bienal de São Paulo, em 1996. Os dados revelaram diferenças, continuidades e analogias entre arte e religião assim como entre arte e sagrado, que permitiram reconhecer em alguns casos substituição funcional da religião pela arte, principalmente se dotada da densidade do sagrado.ABSTRACT Can aesthetic experience replace religious experience? Researchers are quite divided about this issue. From a conceptual and epistemological framework that distinguishes between substantive and functional religion, we formulated the hypothesis that there is not a substantive replacement, but there can be a functional replacement of religious experience by an aesthetic experience. We also considered the additional hypothesis that aesthetic experience can be an experience of the sacred. The hypotheses were examined with the help of interviews with eight well known Brazilian artists, by the time of the 23rd Biennial International Exhibition of Arts of São Paulo, 1996. The data revealed differences, continuities, and analogies between art and religion and between art and the sacred, that allowed to identify in some cases a functional replacement of religion by art, especially if art was endowed with the density of the sacred