Tese de doutoramento em Farmácia (Biologia e Genética Molecular), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Farmácia, 2008A infecção pelo Mycobacterium tuberculosis e por outra micobactérias pertencentes ao complexo Mycobacterium tuberculosis (MTC) é eficazmente controlada pelo sistema imunitário do hospedeiro em 90% dos casos. Contudo, embora os mediadores do sistema imunitário envolvidos neste processo estejam devidamente identificados e se saiba que o IFN desempenha um papel central é dificíl prever o desfecho de umainfecção por micobactérias. Por esta razão é premente estudar a interacçãomicobactéria-hospedeiro ao nível molecular de forma a identificar potenciais alvosterapêuticos para o controlo da tuberculose.As micobactérias são microrganismos intracelulares facultativos que sobrevivem nosmacrófagos alveolares ao nível dos fagossomas. Os macrófagos são células fagocíticasprofissionais com capacidade para eliminar invasores através da resposta imune inata.Esta inclui mecanismos como a produção de espécies radicalares de oxigénio e azoto, amaturação do fagossoma em fagolisossoma, produção de quimiocinas e a apresentaçãode antigénios micobacterianos ao sistema imunitário que resulta no desenvolvimento deuma imunidade adaptativa. As micobactérias patogénicas não só forçam a sua entradanos macrófagos como são capazes de persistir intracelularmente resistindo aos váriosmecanismos bactericidas dos macrófagos. A inibição da maturação do fagossoma emfagolisossoma pelas micobactérias patogénicas é apontada, à mais de três décadas,como a principal razão para o sucesso destes patogenes.Uma vez que a capacidade de subverter os mecanismos bactericidas dos macrófagos écaracterística das micobactérias patogénicas iniciamos este estudo com um parentedistante do M. tuberculosis, o M. smegmatis. Nesta parte do trabalho pretendemosidentificar os mecanismos bactericidas do macrófago activados por uma micobactérianão patogénica no decorrer da infecção que resultam na eliminação da mesma.Utilizando macrófagos de ratinho (J774 e BMM) verificamos que o M. smegmatisapresenta um perfil de sobrevivência intermédio entre o de uma micobactérias decrescimento lento como o M. tuberculosis e o apresentado por bactérias de crescimentorápido como a E. coli ou o Streptococcus. Estas últimas são eliminadas pelosmacrófagos em 4 h, enquanto que o M. smegmatis sobrevive intracelularmente até 48 hapresentando mesmo ciclos de multiplicação intracelular.viiPara verificar se este perfil de sobrevivência se deve apenas à micobactéria ou se ohospedeiro também desempenha um papel importante no desfecho da infecção usámosmacrófagos de vários hospedeiros . Em macrófagos de ratinho Raw e em macrófagosisolados do sangue periférico de voluntários saudáveis (HMDM) verificamos que o M.smegmatis era eliminado de uma forma contínua ao longo de 48 h.Assim, tomando partido da capacidade de replicação de M. smegmatis em J774 e dasvantagens técnicas proporcionadas por uma linha celular de rato iniciámos umaabordagem sitemática dos mecanismos envolvidos na eliminação desta micobactérianão patogénica de crescimento rápido pelos macrófagos ao longo de 24 h.O sistema estudado revelou-se extremamente dinâmico envolvendo um período inicialde morte (1-4 h), seguido de um período de replicação (4-8 h) e dois períodos de morte(8-12 h e 12-24 h). A síntese de óxido nítrico (NO) constitui o primeiro mecanismo dedefesa dos macrófagos mas a sua acção está circunscrita à primeira fase de morte. Aorganização de uma rede de actina e a fusão com organelos endocíticos tardioscoincidem com a primeira e última fase de morte. A reciclagem de marcadores de fasefluida e membranar do fagossoma coincidem com a fase de replicação micobacteriana(4-8 h). A acidificação e a aquisição de sub-unidades da bomba protónica (V-ATPase)pelo fagossoma apresentam um perfil diferente e coincidente com as fases tardias demorte. Além do mais, a colocalização da V-ATPase não é coincidente com a dosmarcadores característicos de endossomas tardios e lisosomas. A MAP cinase p38 écrucial para a regulação de todos os processos investigados, excepto a produção de NO,funcionando alternadamente a favor do hospedeiro ou do patogene. Um modelomatemático suporta a hipótese de que períodos alternados de actividade bactericida dacélula são mais eficazes para a elimição total de parasitas intracelulares do que umaactividade contínua.Umas vez definidos os perfis de sobrevivência/ morte intracelular de uma micobactérianão patogénica de crescimento rápido resolvemos estender a mesma abordagem amicobactérias de crescimento lento avirulentas (Mycobacterium bovis BCG) ouvirulentas (M. bovis). Neste estudo foram utilizados macrófagos de ratinho (J774, Raw eBMM) e de dois hospedeiros naturais de M. bovis. Os macrófagos humanos utilizadosforam isolados a partir do sangue periférico ou da linha celular THP-1. Os macrófagosde bovino foram isolados a partir do sangue periférico de animais saudáveis (BMDM).O estudo dos perfis de sobrevivência demonstrou que o BCG é eliminado de uma formaviiicontínua em todos os macrófagos excepto nos HMDM onde após um ciclo de replicaçãoatinge um estádio estacionário ao fim de 3 dias de infecção. Os perfis de sobrevivênciaobservados para o M. bovis são distintos dos do BCG. A micobactéria virulentapermanece num estado de latência ou consegue replicar-se activamente em todos osmacrófagos estudados. Em nenhum dos casos se observou a eliminação destamicobactéria pelos macrófagos.Os macrófagos de ratinho J774 e os HMDM foram escolhidos para a realização deestudos mais detalhados. A nossa escolha recaiu nestas células porque apresentamperfis de sobrevivência distintos para as duas micobactérias utilizadas. O facto de seremde hospedeiros distintos (rato e Homem) permitiu avaliar a importância do hospedeirono desfecho da infecção.A produção de NO pelos macrófagos de ratinho desempenha um papel importante nocontrolo das infecções por estas micobactérias. À semelhança do anteriormenteobservado com M. smegmatis, a acção do NO e dos radicais reactivos de azoto (RNI)está limitada aos estádios precoces da infecção (3h-3dias) embora seja possível detectara produção de NO até ao sétimo dia de infecção. Em nenhum momento da infecção foipossível detectar uma associação entre a membrana do fagossoma micobacteriano e asintetase inductível do óxido nítrico (iNOS).Nas células humanas não foi possível detectar a produção de NO ao longo da infecção oque pode, pelo menos parcialmente, explicar a diferença observada nos perfis desobrevivência.As micobactérias patogénicas são conhecidas por bloquearem a fusão do fagossomacom o lisossoma evitando desta forma a exposição a alguns dos agentes bactericidasmais potentes do macrófago. Por esta razão, a acidificação do fagossoma contendoM.bovis spp e a sua fusão com vesículas endocíticas tardias e/ou lisossomas foi seguidaao longo de 7 dias. Os resultados obtidos demonstram que as duas micobactérias sãocapazes de interferir com a maturação do fagossoma. O fagossoma micobacteriano nãoadquire marcadores de maturação de fase tardia como a V-ATPase ou o ácido liso-bisfosfatídico(LBPA), não acidifica o suficiente para acumular o corante acidotrópicolysotracker ou fundir com endossomas tardios e/ou lisossomas. Contudo, o maissurpreendente nestes resultados é o facto de duas micobactérias com perfis desobrevivência distintos apresentarem perfis de aquisição de marcadores de maturaçãosemelhantes. Embora, não nos seja possível apresentar evidências experimentaisdirectas uma diferente sensibilidade das duas estirpes de micobactérias à acção deixefectores como os RNI e o hidrogenião podem explicar estes resultados. In vitro aestirpe virulenta de M. bovis revelou ser mais resistente à acção do pH ácido e do NO doque o BCG. A realização de estudos em culturas de macrófagos com inibidores dabomba protónica e da iNOS confirmaram os resultados obtidos in vitro.A última parte do trabalho consistiu na modulação da resposta inflamatória dosmacrófagos e no estudo do seu impacto nas infeções por micobactérias. A modulação dosistema foi efectuada através da adição de lípidos. A nossa escolha recaiu sobre estassubstâncias porque (i) existem estudos epidemiológicos que suportam a associação entreuma dieta rica em lípidos omega-3 e uma elevada incidência de tuberculose, (ii) estudosanteriores em culturas celulares infectadas com o bacilo da tuberculose demonstraramque o tratamento com estes lípidos provocam efeitos semelhantes, (iii) os lípidos sãoimportantes para a regulação da nucleação da actina e consequentemente para amaturação do fagossoma em fagolisossoma.O tratamento das culturas de macrófagos com ácido eicosopentaenoico (EPA), ácidoaraquidónico (AA) e ceramida (Cer) produziram efeitos distintos. O lípido omega-3(EPA) estimula a sobrevivência do bacilo da tuberculose enquanto que o omega-6 (AA)e a ceramida exercem o efeito contrário. A ceramida foi incluída neste estudo por estarintimamente ligada com as vias biosintéticas do AA.A MAP cinase p38 é importante na sinalização pró-inflamatária durante as infecções bacterianas. Neste contexto resolvemos estudar o efeito dos diferentes lípidos na actividade desta cinase. Uma vez mais o EPA apresentou efeitos distintos do AA e da ceramida. O primeiro lípido não estimula a activação da p38 ao contrário do AA e da ceramida. A infecção das culturas de macrófagos com o bacilo da tuberculose alteraradicalmente a sinalização para a p38. O bacilo é capaz de bloquear a activação destacinase nos estádios precNon pathogenic mycobacteria are cleared from macrophages within 24 - 48 h while pathogenic mycobacteria can persist in the same cells for long periods of time. Using the non-pathogenic fast growing Mycobacterium smegmatis and two slow growing mycobacteria with distinct virulence (M. bovis BCG Pasteur and M. bovis) we start a systematic study to elucidate the role of different killing mechanisms during mycobacteria infection. Although all mycobacteria reside in phagosomes the acquisition of maturation markers were distinct for M. smegmatis and M. bovis spp. Thus different mycobacteria live and are killed in distinct compartments. Nevertheless, macrophage control of mycobacteria infections seems to follow a well established program where different killing mechanisms play a role at different times of infection. NO production is the first killing mechanism involved then phagossome maturation resulting in acidification of phagosome content and acquisition of lysosomal enzymes are also involved. Since inhibition of phagosome maturation plays a central role in mycobacteria pathogenesis we try to identify key regulators of this process. Previous studies shown that actin nucleation plays an important role in this process. In the present study we provide evidence that MAP kinase p38, a central player in the pro-inflamatory response to bacteria infection, regulates actin assembly by non-pathogenic mycobacteria containing phagosomes at early stages of infection. This kinase is a key regulator of all killing mechanisms except NO production. In the last part of the work we studied the modulation of the host defense mechanism by lipid treatment. This approach is supported by (i) the well established link between particular diets and tuberculosis incidence and (ii) recent results by Anes group showing that omega-3 and omega-6 lipids had opposite effects in M. tuberculosis survival in macrophages mediated probably by their ability to regulate actin nucleation and phagosome maturation. At the macrophage level, in general, the effects of Cer and/or AA were opposite to those of EPA, but in many infection stages these pro- and anti-inflammatory lipids were capable of reversing the signalling states between killing and survival. The effects of Cer and EPA were in part regulated by p38 MAP Kinase. These results argue against the idea of considering a simple recommended lipid-based diet against mycobacteria.Fundação para a Ciência e Tecnologia (Projectos: FEDER POCTI/BCI/38983/2001; POCI/BIABCM/55327/2004 e bolsa de doutoramento SFRH / BD / 14284 /2003
