Identificação do papel da aducina no citosqueleto axonal

Mestrado em Biologia Molecular e CelularThe neuronal cytoskeleton is an interconnected network of filamentous polymers, having in its constitution three major components: actin, microtubules and intermediate filaments. Up to the discovery of axon actin rings, the neuronal actin cytoskeleton has gained relevance. Still, the molecular details of the regulation of the actin cytoskeleton in neurons are largely unknown. Helping in the actin cytoskeleton regulation and maintenance, there is adducin. Adducin is organized in heterotetamers of heterodimers which comprises α/β and α/γ subunits. In the nervous system, the depletion of α subunit results in an almost complete absence of functional adducin. Given this, α-adducin KO mice arose as relevant models to study the role of this protein in actin cytoskeleton. Results from our group showed that α-adducin KO mice develop progressive axon enlargement and degeneration. As defects in axonal transport have been related to axon enlargement, we determined the importance of adducin in the axonal cytoskeleton and, more specifically, in axonal transport. Although no differences were found in the retrograde transport of CTB in the optic nerve, the lack of adducin resulted in a decreased speed of axonal transport of mitochondria and lysosomes. Several neurodegenerative disorders have been associated with axonal transport deficits and, consequently, with alterations in MT-based transport. Although no differences were found in the levels of acetylated and de-tyrosinated tubulin, the levels of tyrosinated tubulin were significantly decreased in α-adducin KO brains, suggesting a less dynamic status of the MT cytoskeleton in the absence of adducin. Besides differential PTMs of tubulin the decreased axonal transport speed may result from the decreased levels of dynein and kinesin in α-adducin KO mice. Lastly, we hypothesized that adducin might be involved in the organization and/or plasticity of the AIS that requires actin dynamics. In α-adducin KO animals, although the AIS forms normally, neurons do not have the ability to relocate it in response to chronic depolarization. Still, the specific role of actin and its associated proteins, like adducin, in this process remains unclear. In sum, with this Thesis we contributed to understand the relevance of the actin in cytoskeleton, more specifically, of the actin-binding protein adducin in neuron biology.O citoesqueleto neuronal é maioritariamente constituído por três componentes: actina, microtúbulos e filamentos intermédios. Com a descoberta dos anéis de actina presentes no axónio, o citoesqueleto neuronal de actina tem vindo a ganhar bastante relevância. Contudo, os mecanismos moleculares envolvidos na regulação da actina no citoesqueleto continuam por esclarecer. Nesta tese focámo-nos no estudo da importância da aducina, uma proteína de ligação à actina, na regulação do citoesqueleto neuronal. A aducina é uma proteína constituída por heterotetrameros de heterodímeros das subunidades α/β e α/γ, sendo que no sistema nervoso, a depleção da subunidade α resulta numa completa ausência da proteína no seu estado funcional. Assim, murganhos KO para α-aducina demonstraram ser um modelo animal relevante para o estudo do papel desta proteína no citoesqueleto de actina. Resultados do nosso grupo demonstraram que murganhos KO para α-aducina desenvolvem uma degeneração progressiva e um aumento do calibre do axónio. Uma vez que defeitos no transporte axonal têm vindo a ser relacionados com o alargamento axonal, tornou-se importante determinar o papel da aducina no citoesqueleto axonal, mais especificamente no transporte ao longo do axónio. Apesar de não terem sido encontradas diferenças no transporte da toxina da cólera no nervo óptico, a ausência da aducina resultou num decréscimo significativo na velocidade de transporte axonal de mitocôndrias e lisossomas. Diversos distúrbios neurodegenerativos têm sido associados com deficiências no transporte axonal consequentes de alterações na maquinaria de transporte incluindo microtúbulos e proteínas relacionadas. Apesar de não terem sido encontradas diferenças nos níveis de acetilação e de-tirosinação da tubulina em amostras de cérebro α-aducina KO, os níveis de tirosinação da tubulina estão significativamente diminuídos quando comparados com aqueles encontrados em amostras WT, sugerindo uma menor dinâmica dos microtúbulos na ausência de aducina. Além das modificações da tubulina, a diminuição da velocidade de transporte axonal poderá resultar também do decréscimo dos níveis de ambos os motores moleculares dineina e cinesina nos murganhos α-aducina KO. Por fim, sugere-se que a aducina poderá também estar envolvida na organização e/ou plasticidade do segmento inicial do axónio dada a sua ligação ao citoesqueleto de actina, importante para a sua função e organização. Nos murganhos KO para α-aducina, foi verificado que apesar da formação do segmento inicial ser normal, as células não têm a capacidade para o relocalizar após uma depolarização crónica. Porém, o papel específico da actina e das suas proteínas associadas, tal como a aducina, neste processo deverá ser investigado com maior detalhe. Sumariamente, com esta tese, foi possível contribuir para uma melhor compreensão da relevância da actina, mais especificamente, da proteína de ligação à actina aducina, na biologia de um neurónio

DETERMINATION OF DOXORUBICIN HYDROCHLORIDE IN PHARMACEUTICA DOSAGE FORMS BY A SIMPLE STABILITY-INDICATING MICELLAR ELECTROKINETIC CAPILLARY CHROMATOGRAPHY METHOD

A stability-indicating micellar electrokinetic capillary chromatography (MEKC) method was developed and validated for the analysis of doxorubicin hydrochloride in injectable pharmaceutical dosage forms, using methotrexate as internal standard. A fused-silica capillary (50 µm i.d.; effective length, 40 cm) and a running electrolyte solution consisting of 10 mM borate buffer and 20 mM anionic surfactant SDS, at pH 9.3, were set as the best experimental conditions. Moreover, the capillary temperature was maintained at 26 ºC, while the applied voltage was +26 kV. Hydrodynamic sample injection (6 s at 50 mbar) was used, and the detection was set at 260 nm using a photodiode array detector. The method was validated for the requirements specificity, linearity, precision, accuracy, and robustness, following the International Conference on Harmonisation (ICH) guidelines. The method linearity was proven in the range of 25-125 µg/mL (r = 0.9995). Forced degradation studies were successfully conducted, evidencing the specificity and stability-indicating capability of the method. In addition, no interference of the excipients from the formulation was detected. The values of accuracy and precision were within the acceptable limits, and robustness studies were performed by a two-level full factorial design. The proposed method fulfilled all validation parameters and was shown to be suitable for quantitative analyses of doxorubicin, contributing, thus, to the establishment of new alternatives with advantages for the quality control of pharmaceutical formulations

Variabilidade geográfica da razão mortalidade/incidência por cancro da mama no sul da Europa

O cancro da mama é o segundo carcinoma mais frequente constituindo a principal causa de mortalidade por carcinoma em mulheres (Ferlay et al., 2013). Detecção e intervenção precoce e qualidade do tratamento influenciam a mortalidade por esta patologia (Bastos, Peleteiro, Gouveia, Coleman, & Lunet, 2010). A percentagem da razão de Mortalidade/Incidência (%RMI) avalia o acesso a rastreios e a qualidade das terapeuticas, apresentando valores baixos se a mortalidade é baixa para os casos incidentes reportados. (Sunkara & Hebert, 2015). Objetivo: Avaliar a variabilidade na %RMI por cancro da mama (número de óbitos por cada 100 casos incidentes de cancro da mama) em quatro países do sul da Europa culturalmente próximos: Espanha, Portugal, Grécia e Itália. Metodologia: Através da International Agency for Research on Cancer (IARC), obtiveram-se casos observados em 2012 (incidentes e óbitos) para cada país em estudo em mulheres com 15-39, 40-49, 50-64, 65-74 e 75 ou mais anos (WHO, 2016). Obtiveram-se valores de %RMI por país e faixa etária dividindo o número de óbitos pelo número de casos incidentes e multiplicando por 100. Os respetivos intervalos de confiança a 95% (IC95%) foram obtidos pelo teste exato de Fisher. Resultados: Considerando os quatro países como um todo, verifica-se que a %RMI para cancro da mama (número de óbitos por cada 100 casos incidentes) é de 8%, 12%, 17%, 24% e 55%, respectivamente em mulheres com 15-39, 40-49, 50-64, 65-74 e 75 ou mais anos. Verifica-se variabilidade entre países para este indicador, mas não em todas as faixas etárias. Para mulheres mais jovens, Portugal apresenta %RMI de 8,7% (IC95%:6,5-11,3) muito semelhante aos outros três países. Em mulheres com idades entre 40-49 anos e 50-64 anos a %RMI observada em Portugal é, respectivamente, 13,6% (IC95%:11,6-15,8) e 19,7% (IC95%:18,0-21,5), notoriamente inferior à observada na Grécia mas mais elevada em relação a Espanha e Itália. Em mulheres com 65-74 e 75 ou mais anos, as %RMI observadas em Portugal foram, respectivamente, 27,4% (IC95%:24,9-30,1) e 52,5% (IC95%:49,7-55,3), muito semelhantes ao que se observa em Espanha e Itália. Conclusões: Embora em mulheres mais jovens o número de óbitos por cada 100 casos incidentes de cancro da mama seja inferior a 10, este valor é superior a 50 nas mulheres mais velhas. De acordo com os resultados há variabilidade geográfica na %RMI mas esta variabilidade não é transversal a todas as faixas etárias. Os resultados sugerem que o acesso a diagnóstico precoce e a efectividade de tratamento diferem entre países, mas que esta relação é modificada pela idade. Os resultados sugerem equacionar as estratégias preventivas adaptando-as às diferentes faixas etárias.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Doentes com diagnóstico prévio de diabetes perdem menos peso após banda gástrica

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