High-Resolution 3D Structure Determination of Kaliotoxin by Solid-State NMR Spectroscopy

High-resolution solid-state NMR spectroscopy can provide structural information of proteins that cannot be studied by X-ray crystallography or solution NMR spectroscopy. Here we demonstrate that it is possible to determine a protein structure by solid-state NMR to a resolution comparable to that by solution NMR. Using an iterative assignment and structure calculation protocol, a large number of distance restraints was extracted from 1H/1H mixing experiments recorded on a single uniformly labeled sample under magic angle spinning conditions. The calculated structure has a coordinate precision of 0.6 Å and 1.3 Å for the backbone and side chain heavy atoms, respectively, and deviates from the structure observed in solution. The approach is expected to be applicable to larger systems enabling the determination of high-resolution structures of amyloid or membrane proteins

Structural Polymorphism of 441-Residue Tau at Single Residue Resolution

Alzheimer disease is characterized by abnormal protein deposits in the brain, such as extracellular amyloid plaques and intracellular neurofibrillary tangles. The tangles are made of a protein called tau comprising 441 residues in its longest isoform. Tau belongs to the class of natively unfolded proteins, binds to and stabilizes microtubules, and partially folds into an ordered β-structure during aggregation to Alzheimer paired helical filaments (PHFs). Here we show that it is possible to overcome the size limitations that have traditionally hampered detailed nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy studies of such large nonglobular proteins. This is achieved using optimal NMR pulse sequences and matching of chemical shifts from smaller segments in a divide and conquer strategy. The methodology reveals that 441-residue tau is highly dynamic in solution with a distinct domain character and an intricate network of transient long-range contacts important for pathogenic aggregation. Moreover, the single-residue view provided by the NMR analysis reveals unique insights into the interaction of tau with microtubules. Our results establish that NMR spectroscopy can provide detailed insight into the structural polymorphism of very large nonglobular proteins

Beschleunigung der Bestimmung von hochaufgelösten Lösungs- und Festkörper-NMR Strukturen

NMR-Spektroskopie ermöglicht die Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Biomolekülen unter nahezu physiologischen Bedingungen. In den letzten 20 Jahren wurden erhebliche Fortschritte in der NMR-Spektroskopie erzielt, durch die Vielzahl sequenzierter Genome werden jedoch Hochdurchsatzverfahren zur Bestimmung der Tertiärstruktur von Proteinen immer wichtiger. Die Datenaufnahme kann erheblich beschleunigt werden, wenn moderne NMR-Spektrometer mit Methoden kombiniert werden, welche effizient chemische Verschiebungen in mehrdimensionalen NMR-Experimenten messen. Daher sind die Datenanalyse und insbesondere die Notwendigkeit, chemische Verschiebungen sequenzspezifisch den Atomen der Seitenketten zuzuordnen, die Haupthindernisse für eine schnelle NMR-basierte Proteinstrukturbestimmung. In Kapitel 2 wird die Methode FastNMR (FAst STructure determination by NMR) beschrieben, welche ausgehend von nicht zugeordneten NMR-Daten die automatische Bestimmung hoch-aufgelöster Strukturen von Proteinen - die aus einer Domäne bestehen - ermöglicht. Mittels FastNMR wurde automatisch die de novo Struktur des aus 65 Aminosäuren bestehenden, aus Kegelschnecken stammenden Neurotoxins Conkunitzin-S2 bestimmt. Eine große Zahl von Proteinen, wie z.B. Membranproteine oder unlösliche Aggregate von Peptiden und komplexeren Systemen, läßt sich allerdings nicht mit den zuvor beschrieben Methoden untersuchen, da diese Proteine nicht in Lösung gebracht werden können, um mit Hilfe von Lösungs-NMR untersucht zu werden. Daher besteht ein großes Interesse an der Entwicklung von Methoden zur Proteinstruktur-Aufklärung, die nicht auf Lösungs-NMR beschränkt sind. In Kapitel 3 und 4 dieser Arbeit wird gezeigt, dass mit Hilfe der in Lösung-NMR gewonnen Erkenntnisse eine schnelle Aufklärung von globulären Proteinen, wie z.B. dem Kaliumkanal-Blocker Kalitoxin - in der freien Form als auch in der im Komplex mit KcsA-Kv1.3 gebunden Form - durch Festkörper-NMR möglich ist. Ebenfalls in Kapitel 4 wird ein verfeinertes Model des KTX-KcsA-Kv1.3 Komplexes vorgestellt auf der Grundlage von biochemischen Daten und Festkörper-NMR Ergebnissen. Im fünften und letzten Kapitel wird ein besseres Verständnis des Orientierungsmechanismus von Proteinen erarbeitet und erste Ansätze für eine verbesserte Vorhersage der ladungsinduzierten Orientierung von Proteinen vorgestellt. Ausgehend von einer bekannten dreidimensionalen Struktur des Moleküls wird dazu ein verbessertes elektrostatisches Modell angewendet. Erste Ergebnisse deuten an, daß die Vorhersagekraft durch ein detailliertes elektrostatisches Modell gegenüber der des einfachen und in PALES implementierten Modells sich leicht verbessern könnte