Методичні вказівки до практичного заняття №2 з дисципліни «Матеріали для зварювання плавленням, наплавлення і напилення» на тему: «Розрахунок і вибір параметрів режиму зварювання і геометричних розмірів шва при зварюванні плавким електродом у вуглекислому газі»

Методичні вказівки розроблено відповідно з навчального плану підготовки фахівців освітньо-кваліфікаційного рівня “ бакалавр”, спеціальності 6.050504 “Зварювання”, а також робочої програми з дисципліни “Матеріали для зварювання плавленням, наплавлення і напилення

Cryo-EM and molecular docking shows myosin-S1 loop 4 contacts actin and tropomyosin on thin filaments

The motor protein, myosin, drives muscle and non-muscle motility by binding to and moving along actin of thin filaments. Myosin-binding to actin also modulates interactions of the regulatory protein, tropomyosin, on thin filaments, and conversely tropomyosin affects myosin-binding to actin. Insight into this reciprocity will facilitate a molecular level elucidation of tropomyosin regulation of myosin interaction with actin in muscle contraction, and in turn, promote better understanding non-muscle cell motility. Indeed, experimental approaches, such as fiber diffraction, cryo-electron microscopy and 3D reconstruction, have long been used to define regulatory interaction of tropomyosin and myosin on actin at a structural level. However, their limited resolution has not proven sufficient to determine tropomyosin and myosin contacts at an atomic-level and thus to fully substantiate possible functional contributions. To overcome this deficiency, we have followed a hybrid approach by performing new cryo-EM reconstruction of myosin-S1‒decorated F-actin-tropomyosin together with atomic-scale protein-protein docking of tropomyosin to the EM models. Here, cryo-EM data were derived from filaments reconstituted with α1-actin, cardiac αα-tropomyosin, and masseter muscle β-myosin complexes; masseter myosin, which shares sequence identity with β-cardiac myosin-heavy chain, was used because of its stability in vitro. The data were used to build an atomic model of the tropomyosin cable that fits onto the actin filament between the tip of the myosin head and a cleft on the innermost edge of actin subunits. The docking and atomic scale fitting showed multiple discrete interactions of myosin loop 4 and acidic residues on successive 39 to 42 residue-long tropomyosin pseudo-repeats. The contacts between S1 and tropomyosin on actin appear to compete with and displace ones normally found between actin and tropomyosin on myosin-free thin filaments in relaxed muscle, thus restructuring the filament during myosin-induced activation

Affimer proteins for F-actin: novel affinity reagents that label F-actin in live and fixed cells

Imaging the actin cytoskeleton in cells uses a wide range of approaches. Typically, a fluorescent derivative of the small cyclic peptide phalloidin is used to image F-actin in fixed cells. Lifeact and F-tractin are popular for imaging the cytoskeleton in live cells. Here we characterised novel affinity reagents called Affimers that specifically bind to F-actin in vitro to determine if they are suitable alternatives as eGFP-fusion proteins, to label actin in live cells, or for labeling F-actin in fixed cells. In vitro experiments showed that 3 out of the 4 Affimers (Affimers 6, 14 and 24) tested bind tightly to purified F-actin, and appear to have overlapping binding sites. As eGFP-fusion proteins, the same 3 Affimers label F-actin in live cells. FRAP experiments suggest that eGFP-Affimer 6 behaves most similarly to F-tractin and Lifeact. However, it does not colocalize with mCherry-actin in dynamic ruffles, and may preferentially bind stable actin filaments. All 4 Affimers label F-actin in methanol fixed cells, while only Affimer 14 labels F-actin after paraformaldehyde fixation. eGFP-Affimer 6 has potential for use in selectively imaging the stable actin cytoskeleton in live cells, while all 4 Affimers are strong alternatives to phalloidin for labelling F-actin in fixed cells

Atomic insights into muscle contraction by transmission electron cryomicroscopy

Jede Kontraktion eines Muskels basiert auf dem Zusammenspiel von Millionen Myosinmolekülen mit Aktinfilamenten (F-Aktin). Dabei unterscheidet sich interessanterweise der fundamentale Mechanismus der Interaktion nicht von dem, der bei Transportprozessen in der Zelle stattfindet, wenn nur ein Myosindimer eine Fracht entlang des Aktinzytoskeletts bewegt. Sowohl die Muskelkontraktion als auch die Transportprozesse werden dabei von aktinbindenden Proteinen wie zum Beispiel Tropomyosin reguliert. Die Interaktion aller beteiligten Proteine wird seit mehr als einem halben Jahrhundert studiert. Dennoch fehlen bis dato hochauflösende Strukturen dieser Proteine in einem Komplex, um den höchst komplexen Reaktionszyklus während der Interaktion strukturell im Detail zu verstehen, bei dem chemische in mechanische Energie umgewandelt wird. Obwohl Kristallstrukturen von monomerem Aktin und isoliertem Myosin bereits seit vielen Jahren erste Aufschlüsse über die Strukturänderungen während der Interaktion geben konnten, wurde eine Kristallisation eines Aktomyosin-Komplexes nicht erreicht. Im Rahmen meiner Doktorarbeit habe ich die Struktur von F-Aktin in Komplex mit Tropomyosin und die Struktur des F-Aktin-Myosin-Tropomyosin-Komplexes gelöst. Für die Strukturbestimmung habe ich die Methode der Transmissionselektronen-Kryomikroskopie (Kryo-EM) angewendet. Darüber hinaus habe ich die Datenauswertung dahingehend verbessert, dass die vorhandenen Symmetrieinformationen während der Bestimmung der Projektionsparameter für die Erstellung der Rekonstruktion besser genutzt werden konnten. Mit der Struktur des F-Aktin-Tropomyosin-Komplexes wurden nicht nur viele bereits bekannte Wechselwirkungen der Aktinuntereinheiten direkt visualisiert und bestätigt, sondern sie diente auch als Grundlage für ein Modell des Polymerisationsmechanismus von Aktin. Die DNase-bindende Domäne von Aktin nimmt dabei eine Schlüsselrolle ein. Die Position von Tropomyosin auf F-Aktin unterscheidet sich von vorherigen Modellen, sodass diese hinterfragt beziehungsweise erweitert werden müssen. Ein Vergleich der Position von Tropomyosin auf Aktin in An- und Abwesenheit von Myosin hat ergeben, dass Tropomyosin eine signifikante Rotation oder Verschiebung auf dem Aktinfilament vornehmen muss, um die Bindungsstelle für Myosin während der Interaktion freizugeben. Die Struktur des F-Aktin-Myosin-Tropomyosin-Komplexes ist im Rigor-Zustand, bei dem Myosin nukleotidfrei und fest an das Aktinfilament gebunden ist. Die Struktur erlaubte zum ersten Mal die Beschreibung der Schnittstellen der drei Proteine in fast atomarer Auflösung und die Evaluierung von bekannten Mutationsstudien. Ein Vergleich mit Strukturen anderer Zwischenzustände von Myosin ermöglichte das Aufstellen eines Modells, das den Mechanismus der aktininduzierten Verstärkung der ATP Hydrolyseaktivität über die Wechselwirkung der C-terminalen Basis von Loop 2 mit dem „Strut“ von Myosin erklärt, während der N-Terminus von Aktin stabilisierend wirkt. Durch das Lösen der Strukturen beider Komplexe ist es nun möglich mit den erstellten molekularen Modellen krankheitsbedingte Fehlfunktionen, die zum Beispiel bei Herzmuskelerkrankungen (Kardiomyopathien) auftreten, besser zu verstehen und weiter zu analysieren. Darüberhinaus können die etablierten Methoden für weitere Analysen von Aktomyosin-Komplexen genutzt werden, in denen andere Zwischenzustände des Reaktionszyklus von Aktin, Myosin oder Tropomyosin betrachtet werden

Structure of the F-actin–tropomyosin complex

Filamentous actin (F-actin) is the major protein of muscle thin filaments, and actin microfilaments are the main component of the eukaryotic cytoskeleton. Mutations in different actin isoforms lead to early-onset autosomal dominant non-syndromic hearing loss(1), familial thoracic aortic aneurysms and dissections(2), and multiple variations of myopathies(3). In striated muscle fibres, the binding of myosin motors to actin filaments is mainly regulated by tropomyosin and troponin(4,5). Tropomyosin also binds to F-actin in smooth muscle and in non-muscle cells and stabilizes and regulates the filaments there in the absence of troponin(6). Although crystal structures for monomeric actin (G-actin) are available(7), a high-resolution structure of F-actin is still missing, hampering our understanding of how disease-causing mutations affect the function of thin muscle filaments and microfilaments. Here we report the three-dimensional structure of F-actin at a resolution of 3.7 ångstroms in complex with tropomyosin at a resolution of 6.5ångstroms, determined by electron cryomicroscopy. The structure reveals that the D-loop is ordered and acts as a central region for hydrophobic and electrostatic interactions that stabilize the F-actin filament. We clearly identify the density corresponding to ADP and Mg(2+) and explain the possible effect of prominent disease-causing mutants. A comparison of F-actin with G-actin reveals the conformational changes during filament formation and identifies the D-loop as their key mediator. We also confirm that negatively charged tropomyosin interacts with a positively charged groove on F-actin. Comparison of the position of tropomyosin in F-actin–tropomyosin with its position in our previously determined actin–tropomyosin–myosin structure(8) reveals a myosin-induced transition of tropomyosin. Our results allow us to understand the role of individual mutations in the genesis of actin- and tropomyosin-related diseases and will serve as a strong foundation for the targeted development of drugs

Near-atomic structure of jasplakinolide-stabilized malaria parasite F-actin reveals the structural basis of filament instability

Abstract During their life cycle, apicomplexan parasites, such as the malaria parasite Plasmodium falciparum, use actomyosin-driven gliding motility to move and invade host cells. For this process, actin filament length and stability are temporally and spatially controlled. In contrast to canonical actin, P. falciparum actin 1 (PfAct1) does not readily polymerize into long, stable filaments. The structural basis of filament instability, which plays a pivotal role in host cell invasion, and thus infectivity, is poorly understood, largely because high-resolution structures of PfAct1 filaments were missing. Here, we report the near-atomic structure of jasplakinolide (JAS)-stabilized PfAct1 filaments determined by electron cryomicroscopy. The general filament architecture is similar to that of mammalian F-actin. The high resolution of the structure allowed us to identify small but important differences at inter- and intrastrand contact sites, explaining the inherent instability of apicomplexan actin filaments. JAS binds at regular intervals inside the filament to three adjacent actin subunits, reinforcing filament stability by hydrophobic interactions. Our study reveals the high-resolution structure of a small molecule bound to F-actin, highlighting the potential of electron cryomicroscopy for structure-based drug design. Furthermore, our work serves as a strong foundation for understanding the structural design and evolution of actin filaments and their function in motility and host cell invasion of apicomplexan parasites