Particle-based system for keratinocyte growth factor release in skin models

Dissertação de mestrado em Biofísica e BionanossistemasWound re-epithelialization is a dynamic process that comprises the formation of new epithelium through an active signaling network between several growth factors and various cell types. The main players are keratinocytes (KCs) that migrate from the wound edges to reestablish a continuous epithelium to ultimately restore epidermal barrier. One of the most important molecules involved in this process is Keratinocyte Growth Factor (KGF) since it is central on promoting both migration and proliferation of KCs. Stromal cells, like dermal fibroblasts, are the main producers of this factor, acting on KCs through paracrine signaling. Multiple strategies to delivery KGF, envisioning therapeutic application, have been proposed to boost wound healing by targeting re-epithelialization. In this thesis, two different systems were explored: gellan gum (GG) KGF-loaded particles and human adipose stem cells (hASCs) cell sheet constructs as foreseen units for controlled KGF production and consistent release. In the first one, the optimization of the release assays with a model molecule showed that in polydisperse particles less protein was entrapped, and the further lyophilization allowed a significantly higher release of the molecule. Moreover, after entrapment with the optimized conditions, KGF was released in a controlled way exhibiting different release profiles dependent on the pH used. The particles were internalized when in contact with human keratinocytes (hKCs) and lead to their significantly higher proliferation and migration. The neutralization of KGF reduced the migration, confirming the KGF-dependent stimulation effect on cellular migration. In the second strategy, hASCs were able to produce KGF in culture, in opposition hKCs alone. In co-cultures of hKCs with hASCs, in form of cell sheets and cell suspension, KGF was also present and a mitogenic/motogenic effect on hKCs was observed. Additionally, by neutralizing KGF in vitro, a strong inhibition on migration was revealed, confirming that the direct stimulatory effect of KGF on hKCs improved migration. Taking all together, the explored KGF-based systems showed to impact hKCs migration and mitogenic activity, opening the opportunity to treat wounds with impaired re-epithelialization.A re-epitelização de feridas é um processo dinâmico que compreende a formação de um novo epitélio através de uma rede de sinalização ativa entre diversos fatores de crescimento e tipos celulares. Os principais intervenientes são os queratinócitos (KCs) que migram desde as margens das feridas de modo a restabelecer um epitélio continuo para, por fim, restaurar a barreira da epiderme. Uma das moléculas mais importantes deste processo é o Fator de Crescimento de KCs (KGF), uma vez que é fundamental para promover a migração e a proliferação destas células. Células estromais, como os fibroblastos da derme, são os principais produtores deste fator, atuando nos KCs através de sinalização parácrina. Diversas estratégias para a entrega deste fator têm sido propostas para melhorar a cicatrização de feridas através da re-epitelização, tendo como objetivo a sua aplicação terapêutica. Nesta tese foram explorados dois sistemas diferentes: partículas de gellan gum (GG) com KGF e cell sheets de células estaminais humanas do tecido adiposo (hASCs), como unidades produtoras de KGF. Na primeira abordagem, a otimização dos ensaios de libertação com uma molécula modelo mostraram que em partículas polidispersas foi encapsulada menos proteína, e que uma liofilização posterior permitiu que a libertação da molécula fosse significativamente maior. Após o encapsulamento do KGF nas condições previamente otimizadas, os perfis de libertação controlada foram diferentes, consoante o pH. Em contacto com KCs humanos (hKCs), as partículas foram internalizadas e demonstraram um efeito na proliferação e migração significativamente maior destas células. A neutralização do KGF reduziu a migração dos hKCs, confirmando o efeito estimulatório dependente de KGF. Na segunda estratégia, as hASCs mostraram ser produtoras de KGF em cultura, ao contrário dos hKCs sozinhos. Em co-culturas de hKCs com hASCs (cell sheet ou suspensão celular), foi também detetada a presença de KGF, assim como o efeito mitogénico/motogénico nos hKCs. Além disso, ao neutralizar o KGF in vitro, uma forte inibição na migração foi observada, confirmando que o efeito estimulatório direto do KGF na melhoria da migração dos hKCs. Resumindo, os sistemas explorados baseados em KGF mostraram ter impacto na migração e na atividade mitogénica de hKCs, podendo ser explorados no tratamento de feridas em que re-epitelização é insuficiente.Agradeço ao projeto SteamTREAT (PTDC/BTM-ORG/28131/2017) pelo apoio financeiro dado à elaboração da minha tese

Antiretroviral Treatment of HIV-2 Infection: Available Drugs, Resistance Pathways, and Promising New Compounds

© 2023 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland. This article is an open access article distributed under the terms and conditions of the Creative Commons Attribution (CC BY) license (https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).Currently, it is estimated that 1–2 million people worldwide are infected with HIV-2, accounting for 3–5% of the global burden of HIV. The course of HIV-2 infection is longer compared to HIV-1 infection, but without effective antiretroviral therapy (ART), a substantial proportion of infected patients will progress to AIDS and die. Antiretroviral drugs in clinical use were designed for HIV-1 and, unfortunately, some do not work as well, or do not work at all, for HIV-2. This is the case for non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs), the fusion inhibitor enfuvirtide (T-20), most protease inhibitors (PIs), the attachment inhibitor fostemsavir and most broadly neutralizing antibodies. Integrase inhibitors work well against HIV-2 and are included in first-line therapeutic regimens for HIV-2-infected patients. However, rapid emergence of drug resistance and cross-resistance within each drug class dramatically reduces second-line treatment options. New drugs are needed to treat infection with drug-resistant isolates. Here, we review the therapeutic armamentarium available to treat HIV-2-infected patients, as well as promising drugs in development. We also review HIV-2 drug resistance mutations and resistance pathways that develop in HIV-2-infected patients under treatment.This work was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal, Aga Khan Development Network (AKDN)—Portugal Collaborative Research Network in Portuguese speaking countries in Africa (project 332821690). Inês Moranguinho was supported by PhD fellowship from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal (reference SFRH/BD/131062/2017) Inês Bártolo is supported by FCT through Norma Transitória—DL57/2016/CP1376/CT0012.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Valorização agrícola de lamas de ETAR – Estudo da disponibilidade do fósforo

A aplicação de lamas de estações de tratamento de águas residuais (ETAR) ao solo agrícola, quando efetuada adequadamente, permite tirar partido do seu valor fertilizante, ao veicular nutrientes e matéria orgânica, contribuindo assim para uma melhoria da fertilidade dos solos e do estado nutritivo das culturas neles instaladas. Prevê-se que a depleção das reservas de fosforite possa ocorrer dentro de cerca de 100 anos, tornando-se necessário encontrar alternativas à sua utilização.Com o objetivo de contribuir para um melhor conhecimento do fornecimento de fósforo ao solo, veiculado pela lama, realizou-se um ensaio em vasos, com milho, delineado em blocos completos casualizados, considerando treze tratamentos experimentais, e três repetições. Procurou-se comparar os efeitos produzidos da aplicação de fósforo veiculado pela lama com a aplicação de um adubo fosfatado mineral e com a combinação entre ambos. Consideraram-se os seguintes tratamentos experimentais: (i) um tratamento testemunha, sem aplicação de fósforo; (ii) quatro tratamentos com níveis crescentes de fósforo veiculado através da lama; (iii) quatro tratamentos com níveis crescentes de fósforo veiculado pelo fosfato de cálcio e (iv) quatro tratamentos com os mesmos níveis de fósforo mas veiculado pela lama e pelo fosfato de cálcio. Avaliaram-se os efeitos produzidos a nível da produção da planta teste e do seu estado nutritivo, bem como do estado de fertilidade do solo. A produção de biomassa da planta teste mostrou-se altamente dependente da fertilização fosfatada, registando-se a produção mais elevada nos tratamentos em que foram adicionadas as maiores quantidades de fósforo veiculado pelo fosfato de cálcio e pela mistura deste com lama. Foi demonstrado o poder corretivo e fertilizante da lama, contudo confirmou-se a necessidade de estabelecer limites nas quantidades de lama a aplicar ao solo agrícola. Os resultados obtidos permitiram concluir que a aplicação controlada de lamas ao solo pode constituir um destino final adequado, podendo a lama constituir um substituto parcial dos fertilizantes minerais fosfatados

Molecular epidemiology and evolution of HIV-1 in Portugal and portuguese speaking african countries

Tese de doutoramento, Farmácia (Microbiologia), Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2011The aims of this thesis were to better characterize HIV-1 diversity in Portugal, Angola, Mozambique and Cape Verde and to investigate the origin and epidemiological history of HIV-1 in these countries. The impact of these issues in diagnosis, disease progression and susceptibility to ARV therapy was also investigated. Finally, the nature, dynamics and prevalence of transmitted drug resistance (TDR) was determined in untreated HIV-1 infected patients. In Angola, practically all HIV-1 genetic forms were found, including almost all subtypes, untypable (U) strains, CRFs and URFs. Recombinants (first and second generation) were present in 47.1% of the patients. HIV/AIDS epidemic in Angola probably started in 1961, the major cause being the independence war, subsequently spreading to Portugal. In Maputo, 81% of the patients were infected with subtype C viruses. Subtype G, U and recombinants such as CRF37_cpx, were also present. The results suggest that HIV-1 epidemic in Mozambique is evolving rapidly in genetic complexity. In Cape Verde, where HIV-1 and HIV-2 co-circulate, subtype G is the prevailed subtype. Subtypes B, C, F1, U, CRF02_AG and other recombinant strains were also found. HIV-2 isolates belonged to group A, some being closely related to the original ROD isolate. In all three countries numerous new polymorphisms were identified in the RT and PR of HIV-1 viruses. Mutations conferring resistance to the NRTIs or NNRTIs were found in isolates from 2 (2%) patients from Angola, 4 (6%) from Mozambique and 3 (12%) from Cape Verde. None of the isolates containing TDR mutations would be fully sensitive to the standard first-line therapeutic regimens used in these countries. Close surveillance in treated and untreated populations will be crucial to prevent further transmission of drug resistant strains and maximize the efficacy of ARV therapy. In Portugal, investigation of a seronegative case infection with rapid progression to AIDS and death revealed that the patient was infected with a CRF14_BG-like R5-tropic strain selectively transmitted by his seropositive sexual partner. The results suggest a massive infection with a highly aggressive CRF14_BG like strain and/or the presence of an unidentified immunological problem that prevented the formation of HIV-1-specific antibodies. Near full-length genomic sequences obtained from three unrelated patients enabled the first molecular and phylogenomic characterization of CRF14_BG from Portugal; all sequences were strongly related with CRF14_BG Spanish isolates. The mean date of origin of CRF14_BG was estimated to be 1992. We propose that CRF14_BG emerged in Portugal in the early 1990s, spread to Spain in late 1990s as a consequence of IDUs migration and then to the rest of Europe. Most CRF14_BG strains were predicted to use CXCR4 and were associated with rapid CD4 depletion and disease progression. Finally, we provide evidence suggesting that the X4 tropism of CRF14_BG may have resulted from convergent evolution of the V3 loop possibly driven by an effective escape from neutralizing antibody response.A infecção VIH/SIDA é um grave problema de saúde pública, particularmente na África subsaariana, onde vivem 67% dos infectados. O diagnóstico, a terapêutica e a prevenção da infecção VIH/SIDA dependem do conhecimento aprofundado da sua epidemiologia bem como dos agentes causadores desta infecção. A diversidade genética de VIH-1 pode ter impacto a vários níveis, nomeadamente, no diagnóstico, transmissão, progressão da doença e emergência de resistências aos fármacos antirretrovirais (revisto no Capítulo 1). Com a recente introdução da terapêutica antirretroviral combinada (TARc) nos países em vias de desenvolvimento, o prognóstico dos doentes que têm acesso a estes fármacos melhorou substancialmente, com uma marcada diminuição das taxas de mortalidade e morbilidade. No entanto, há preocupações relativas à baixa eficácia da TARc nestes países, o que pode levar à rápida e descontrolada emergência de variantes resistentes aos fármacos antirretrovirais e à sua subsequente transmissão. Há vários aspectos que podem levar à baixa eficácia da TARc, nomeadamente a monitorização limitada da carga viral nos doentes em terapêutica, o uso não regulado de fármacos antirretrovirais comprados no mercado negro e a falta de sistemas de vigilância de resistências. Os estudos de epidemiologia molecular e de resistência aos fármacos antirretrovirais na infecção VIH-1 descritos nesta dissertação foram realizados em Angola, Moçambique, Cabo Verde e Portugal. Estes países têm fortes laços históricos, sociais, culturais e económicos. Contudo, a infecção VIH/SIDA afecta estes países de forma muito diferente. Moçambique é um dos países da África subsaariana com maior taxa de prevalência da infecção VIH-1 (11,5%), tendo províncias com prevalências superiores a 25%. Angola tem uma prevalência moderada de 6,5%, sendo Luanda a província que apresenta a prevalência mais elevada do país (13,6%). Cabo Verde apresenta uma taxa de prevalência muito baixa para um país Africano, inferior a 1%. Em Portugal a prevalência da infecção VIH/SIDA sendo baixa (0,6%) é, no entanto, uma das mais elevadas da Europa Ocidental. Em Angola, Moçambique e Cabo Verde, tal como na maioria dos países Africanos, a transmissão da infecção faz-se sobretudo por via heterossexual enquanto em Portugal os toxicodependentes por via endovenosa correspondem a cerca de 40% dos casos de infecção. Em Portugal, os subtipos B e G e a forma recombinante CRF14_BG dominam a epidemia de infecção por VIH-1 mas pouco se sabe sobre a sua origem e história epidemiológica. Relativamente a Angola, Moçambique e Cabo Verde, há pouca ou nenhuma informação sobre os subtipos virais, sobre a sua origem e história epidemiológica e sobre o seu potencial impacto no diagnóstico, progressão da doença e susceptibilidade e resistência aos fármacos antirretrovirais. Pouco se sabe também sobre a natureza e a prevalência das mutações de resistência (primárias e secundárias). Deste modo, os objectivos desta dissertação foram: 1) caracterizar a diversidade genética de VIH-1 em Portugal, Angola, Moçambique e Cabo Verde, e investigar a origem e história epidemiológica deste vírus nestes países; 2) analisar o impacto da diversidade genética no diagnóstico, progressão para a doença e susceptibilidade à terapêutica antirretroviral; e 3) determinar a prevalência das resistências transmitidas em doentes não tratados dos três países Africanos. Foram colhidas amostras de plasma de doentes VIH-1 tratados e não tratados, entre 1993 e 2007, de Angola, Moçambique e Cabo Verde (Capítulos 2-5). Para subtipagem e/ou análise de mutações de resistência, foram obtidas sequências dos genes gag (p17), pol (PR and RT) e/ou env (C2C3) utilizando para amplificação um protocolo de PCR desenvolvido no nosso laboratório. Os genótipos virais foram determinados por análise filogenética. As mutações de resistência foram determinadas recorrendo ao Stanford Genotypic Resistance Interpretation Algorithm. As mutações associadas com resistência transmitida foram seleccionadas de listas publicadas recentemente. Para definir se uma mutação era um polimorfismo natural de um determinado subtipo, as frequências de todos os polimorfismos encontrados nas sequências de doentes tratados e não tratados, foram comparadas com sequências de todo o mundo do mesmo subtipo e/ou de subtipo B. Nos doentes não tratados infectados com vírus resistentes, o perfil mutacional foi analisado para se poder indicar o regime antirretroviral de 1ª linha mais efectivo. Nos doentes tratados, sempre que possível correlacionou-se a presença de mutações de resistência com parâmetros imunológicos e virológicos e com o regime antirretroviral em uso. Usaram-se métodos filogenéticos para determinar a origem dos vírus resistentes e para determinar se os doentes eram epidemiologicamente relacionados. Na investigação de um caso de infecção VIH-1 seronegativa fez-se uma caracterização inicial de vírus recombinantes CRF14_BG com base em sequências clonais parciais dos genes gag e env (Capítulo 6). Para a caracterização completa destes CRF14_BGs Portugueses, obtiveram-se sequências genómicas completas a partir de amostras de três doentes, um jovem adulto com infecção seronegativa infectado por via heterossexual e duas crianças infectadas por via vertical, em 1997 (Capítulo 7). A reconstrução da história evolutiva desta CRF foi realizada através de molecular clock analysis. Métodos genéticos e filogenéticos foram usados para determinar o tropismo de um número significativo de isolados CRF14_BG de doentes Portugueses e investigar a selecção positiva na região V3. Em Angola encontraram-se praticamente todas as formas genéticas de VIH-1 do grupo M excepto o subtipo B (Capítulo 2). Quarenta e sete por cento dos doentes estava infectado com vírus recombinantes, dos quais 36% eram de 2ª geração. Encontraram-se 58 perfis de recombinação diferentes. Encontraram-se ainda numerosos isolados não tipáveis e dois novos grupos de sequências dentro da radiação do subtipo A que podem constituir novos sub-subtipos A. Os dados epidemiológicos disponíveis e a elevada divergência genética intra-subtipo dos isolados Angolanos são consistentes com uma epidemia antiga neste país. Pensamos que a guerra colonial com os Portugueses (1961-1974) terá sido a principal causa da disseminação de VIH-1 em Angola. A epidemia de VIH/SIDA em Portugal (Capítulo 7) e Cabo Verde (Capítulo 5) é causada por uma grande proporção de subtipos não-B e recombinantes, alguns fortemente relacionados com os isolados Angolanos. Deste modo, a grande migração de pessoas durante a guerra colonial com Angola pode também ter promovido a disseminação de subtipos não-B de VIH-1 para Portugal e Cabo Verde, possivelmente em meados dos anos 60, e daí para o resto do mundo. Tendo isto em conta, é provável que Angola tenha sido um dos epicentros da actual epidemia de subtipos não-B em todo o mundo. Em Maputo, Moçambique, a maior parte (81%) dos doentes estava infectada com vírus de subtipo C de origem diversa (Capítulo 4), contudo, também se detectaram quase todos os outros subtipos. De relevância particular neste contexto, foi a identificação de um cluster de isolados CRF37_cpx que terão sido importados recentemente para Moçambique. Em geral, os nossos resultados indicam que a epidemia VIH-1 em Moçambique (Maputo) está a evoluir rapidamente em complexidade genética devido à recente introdução de todos os principais subtipos e formas recombinantes. No futuro será importante determinar de que modo esta alteração da diversidade viral terá impacto na epidemia de VIH/SIDA em Moçambique. Em Cabo Verde caracterizou-se pela primeira vez as formas genéticas de VIH-1 e de VIH-2 em circulação (Capítulo 5). O subtipo G de VIH-1 foi o subtipo mais prevalente (48%). Encontraram-se ainda outros subtipos bem como variantes não tipáveis, sozinhos ou em formas recombinantes. Os isolados de subtipo G de Cabo Verde são extremamente divergentes em relação aos isolados de referência e na sua maioria parecem ter origem em Portugal e/ou Angola. Isto não é surpreendente visto Cabo Verde ter fortes relações históricas, sociais e económicas com estes dois países. Encontrou-se um recombinante C(pol)/G(env) ainda não descrito que importa agora sequenciar a nível genómico para determinar se poderá vir a definir uma nova CRF_CG. Todos os isolados VIH-2 pertenciam ao grupo A, um grupo que é também endémico em Portugal e nos países da África Ocidental relacionados com Cabo Verde. Encontraram-se dois isolados VIH-2 que partilhavam um ancestral comum com o histórico VIH-2ROD, o primeiro VIH-2 a ser sequenciado em 1987. Estes resultados sugerem que a origem do VIH-2 ROD é Cabo Verde e que este país poderá ser ter sido um dos epicentros da actual epidemia de VIH-2. Não se encontraram mutações de resistência major aos inibidores da protease (IPs) na PR dos isolados de VIH-1 presentes em Angola, Moçambique e Cabo Verde (Capítulos 3, 4, 5), o que é consistente com o facto dos regimes de primeira linha utilizados nestes países não inclurem esta classe de fármacos. No entanto, na PR dos isolados não-B foram identificados um grande número de polimorfismos naturais em posições que no subtipo B são consideradas mutações minor de resistência aos IPs (exs. L10I/V, V11I e T74P). Adicionalmente, foram encontrados novos polimorfismos ainda não descritos nas bases de dados de sequências de PR referentes a doentes não tratados. Estes resultados confirmam que os vírus que circulam nestes países são extremamente divergentes e sugerem que estes vírus poderão ter uma barreira genética de resistência diminuída para alguns IPs. Na RT dos isolados VIH-1 de Angola, Moçambique e Cabo Verde também se encontraram numerosos polimorfismos que poderão ter impacto na susceptibilidade aos inibidores da RT (Capítulos 3, 4, 5). Adicionalmente, foram encontradas mutações de resistência aos INRTs (M41L, D67N, M184V, L210W, T215F/Y, K219Q) e INNRTs (K103N) nalguns doentes não tratados de Angola (2 doentes, 2%), Moçambique (4, 6%) e Cabo Verde (3, 12%). Nenhum destes isolados com mutações de resistência foi totalmente sensível aos regimes antirretrovirais de primeira linha usados nestes países. A baixa prevalência de resistência transmitida encontrada em Angola é consistente com a baixa disponibilidade de antirretrovirais no período de estudo (1993-2001). Pelo contrário, as taxas de resistência transmitida encontradas em Moçambique e Cabo Verde foram inesperadas dado que os fármacos antirretrovirais só começaram a estar disponíveis nestes países por volta de 2004. Os nossos resultados sugerem que a maior parte dos isolados resistentes terão sido importados de países onde a terapêutica está disponível há mais tempo. No entanto, o uso não monitorizado de antiretrovirais poderá também ser responsável por estas taxas relativamente elevadas de transmissão de vírus resistentes. Em Portugal estudámos um caso raro de infecção seronegativa por VIH-1 com rápida progressão para SIDA e morte (Capítulo 6). O doente estava infectado com um vírus recombinante B(env)/G(gag) semelhante à CRF14_BG encontrada originalmente em Espanha em toxicodependentes. A análise filogenética indicou que o doente tinha sido infectado pela sua parceira sexual, uma toxicodependente, e que havia uma evolução genética muito restrita do vírus. A análise genética do tropismo indicou que o doente foi infectado selectivamente com uma variante CCR5. Estes dados demonstraram que na ausência de pressão selectiva por anticorpos os vírus CCR5 podem provocar SIDA e morte. No global, os resultados sugeriram uma infecção massiva com uma estirpe tipo CRF14_BG extremamente agressiva e/ou a presença de um problema imunológico não identificado no doente que impediu a formação de anticorpos específicos contra VIH-1. Por sequenciação e análise filogenética do genoma completo de três doentes não relacionados, infectados com recombinantes B/G, fizemos a primeira caracterização molecular e evolutiva dos vírus CRF14_BG em circulação em Portugal (Capítulo 7). Os nossos resultados sugerem que a CRF14_BG terá emergido em Portugal em 1992 (1989-1996) após o início da epidemia, tendo-se disseminado para Espanha no fim dos anos 90, provavelmente como consequência da migração de toxicodependentes, e depois para o resto da Europa. Verificámos que a grande maioria dos isolados CRF14_BG usa o co-receptor CXCR4 e estão associados à rápida depleção das células CD4 e progressão para SIDA. Finalmente, verificámos que só um aminoácido na V3 loop dos CRF14_BG está sobre pressão selectiva enquanto que no subtipo B há quatro aminoácidos sobre pressão selectiva. No conjunto, os resultados sugerem que os vírus CRF14_BG são particularmente patogénicos, que esta característica está em geral associada ao uso do co-receptor CXCR4, e que o uso preferencial deste co-receptor pode resultar de uma evolução convergente determinada pela fuga eficiente à resposta humoral neutralizante.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT,(SFRH/BD/30343/2006); Fundação GlaxoSmithKline das Ciências da Saúde; Fundação Calouste Gulbenkia

Rare HIV-1 subtype J genomes and a new H/U/CRF02_AG recombinant genome suggests an ancient origin of HIV-1 in Angola

This is the author’s version of a work that was accepted for publication in AIDS Research and Human Retroviruses .Final publication is available from Mary Ann Liebert, Inc., publishers http://dx.doi.org/10.1089/aid.2016.0084"Angola has an extremely diverse HIV-1 epidemic fueled in part by the frequent interchange of people with the Democratic Republic of Congo (DRC) and Republic of Congo (RC). Characterization of HIV-1 strains circulating in Angola should help to better understand the origin of HIV-1 subtypes and recombinant forms and their transmission dynamics. In this study we characterize the first near full-length HIV-1 genomic sequences from HIV-1 infected individuals from Angola. Samples were obtained in 1993 from three HIV-1 infected patients living in Cabinda, Angola. Near full-length genomic sequences were obtained from virus isolates. Maximum likelihood phylogenetic tree inference and analyses of potential recombination patterns were performed to evaluate the sequence classifications and origins. Phylogenetic and recombination analyses revealed that one virus was a pure subtype J, another mostly subtype J with a small uncertain region, and the final virus was classified as a H/U/CRF02_AG recombinant. Consistent with their epidemiological data, the subtype J sequences were more closely related to each other than to other J sequences previously published. Based on the env gene, taxa from Angola occur throughout the global subtype J phylogeny. HIV-1 subtypes J and H are present in Angola at low levels since at least 1993. Low transmission efficiency and/or high recombination potential may explain their limited epidemic success in Angola and worldwide. The high diversity of rare subtypes in Angola suggests that Angola was part of the early establishment of the HIV-1 pandemic.

An HIV-1/HIV-2 Chimeric Envelope Glycoprotein Generates Binding and Neutralising Antibodies against HIV-1 and HIV-2 Isolates

Funding Information: This work was funded by national funds through the FCT-Foundation for Science and Technology, I.P., under the project UIDB/04585/2020, by FCT and Aga Khan Development Network (AKDN)—Portugal Collaborative Research Network in Portuguese speaking countries in Africa, project 332821690 and by Ministry of Health, Portugal, project HIV/SAU/0008.11. Publisher Copyright: © 2023 by the authors.The development of immunogens that elicit broadly reactive neutralising antibodies (bNAbs) is the highest priority for an HIV vaccine. We have shown that a prime-boost vaccination strategy with vaccinia virus expressing the envelope glycoprotein gp120 of HIV-2 and a polypeptide comprising the envelope regions C2, V3 and C3 elicits bNAbs against HIV-2. We hypothesised that a chimeric envelope gp120 containing the C2, V3 and C3 regions of HIV-2 and the remaining parts of HIV-1 would elicit a neutralising response against HIV-1 and HIV-2. This chimeric envelope was synthesised and expressed in vaccinia virus. Balb/c mice primed with the recombinant vaccinia virus and boosted with an HIV-2 C2V3C3 polypeptide or monomeric gp120 from a CRF01_AG HIV-1 isolate produced antibodies that neutralised >60% (serum dilution 1:40) of a primary HIV-2 isolate. Four out of nine mice also produced antibodies that neutralised at least one HIV-1 isolate. Neutralising epitope specificity was assessed using a panel of HIV-1 TRO.11 pseudoviruses with key neutralising epitopes disrupted by alanine substitution (N160A in V2; N278A in the CD4 binding site region; N332A in the high mannose patch). The neutralisation of the mutant pseudoviruses was reduced or abolished in one mouse, suggesting that neutralising antibodies target the three major neutralising epitopes in the HIV-1 envelope gp120. These results provide proof of concept for chimeric HIV-1/HIV-2 envelope glycoproteins as vaccine immunogens that can direct the antibody response against neutralising epitopes in the HIV-1 and HIV-2 surface glycoproteins.publishersversionpublishe

Evolutionary and Structural Features of the C2, V3 and C3 Envelope Regions Underlying the Differences in HIV-1 and HIV-2 Biology and Infection

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited. Users must also make clear the license terms under which the work was published.Background: Unlike in HIV-1 infection, the majority of HIV-2 patients produce broadly reactive neutralizing antibodies, control viral replication and survive as elite controllers. The identification of the molecular, structural and evolutionary footprints underlying these very distinct immunological and clinical outcomes may lead to the development of new strategies for the prevention and treatment of HIV infection.Methodology/Principal Findings: We performed a side-by-side molecular, evolutionary and structural comparison of the C2, V3 and C3 envelope regions from HIV-1 and HIV-2. These regions contain major antigenic targets and are important for receptor binding. In HIV-2, these regions also have immune modulatory properties. We found that these regions are significantly more variable in HIV-1 than in HIV-2. Within each virus, C3 is the most entropic region followed by either C2 (HIV-2) or V3 (HIV-1). The C3 region is well exposed in the HIV-2 envelope and is under strong diversifying selection suggesting that, like in HIV-1, it may harbour neutralizing epitopes. Notably, however, extreme diversification of C2 and C3 seems to be deleterious for HIV-2 and prevent its transmission. Computer modelling simulations showed that in HIV-2 the V3 loop is much less exposed than C2 and C3 and has a retractile conformation due to a physical interaction with both C2 and C3. The concealed and conserved nature of V3 in the HIV-2 is consistent with its lack of immunodominancy in vivo and with its role in preventing immune activation. In contrast, HIV-1 had an extended and accessible V3 loop that is consistent with its immunodominant and neutralizing nature.Conclusions/Significance: We identify significant structural and functional constrains to the diversification and evolution of C2, V3 and C3 in the HIV-2 envelope but not in HIV-1. These studies highlight fundamental differences in the biology and infection of HIV-1 and HIV-2 and in their mode of interaction with the human immune system and may inform new vaccine and therapeutic interventions against these viruses.Fundo para a Ciência e Tecnologia, Portugal. Collaborative HIV and Anti-HIV Drug Resistance Network, European Union. PB and IB supported by PhD grants from Fundo para a Ciência e Tecnologia

HIV-1 Diversity, Transmission Dynamics and Primary Drug Resistance in Angola

This is an openaccess article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited."Objectives: To assess HIV-1 diversity, transmission dynamics and prevalence of transmitted drug resistance (TDR) in Angola, five years after ART scale-up. Methods: Population sequencing of the pol gene was performed on 139 plasma samples collected in 2009 from drug-naive HIV-1 infected individuals living in Luanda. HIV-1 subtypes were determined using phylogenetic analysis. Drug resistance mutations were identified using the Calibrated Population Resistance Tool (CPR). Transmission networks were determined using phylogenetic analysis of all Angolan sequences present in the databases. Evolutionary trends were determined by comparison with a similar survey performed in 2001. Results: 47.1% of the viruses were pure subtypes (all except B), 47.1% were recombinants and 5.8% were untypable. The prevalence of subtype A decreased significantly from 2001 to 2009 (40.0% to 10.8%, P50.0019) while the prevalence of unique recombinant forms (URFs) increased.2-fold (40.0% to 83.1%, P,0.0001). The most frequent URFs comprised untypable sequences with subtypes H (U/H, n57, 10.8%), A (U/A, n56, 9.2%) and G (G/U, n54, 6.2%). Newly identified U/H recombinants formed a highly supported monophyletic cluster suggesting a local and common origin. TDR mutation K103N was found in one (0.7%) patient (1.6% in 2001). Out of the 364 sequences sampled for transmission network analysis, 130 (35.7%) were part of a transmission network. Forty eight transmission clusters were identified; the majority (56.3%) comprised sequences sampled in 2008–2010 in Luanda which is consistent with a locally fuelled epidemic. Very low genetic distance was found in 27 transmission pairs sampled in the same year, suggesting recent transmission events. Conclusions: Transmission of drug resistant strains was still negligible in Luanda in 2009, five years after the scale-up of ART. The dominance of small and recent transmission clusters and the emergence of new URFs are consistent with a rising HIV-1 epidemics mainly driven by heterosexual transmission."This work was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) http://www.fct. pt), Portugal, (grants ‘‘PTDC/SAU-FAR/115290/ 2009’’ and ‘‘PTDC/SAU-EPI/122400/2010’’), and by Collaborative HIV and Anti-HIV Drug Resistance Network (CHAIN), from the European Union. Inês Bártolo was supported by a post-doc fellowship (SFRH/BPD/76225/2011) from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal. Suzana Zakovic was supported by a European Union studentship from the Erasmus Mundus Masters in Forensic Sciences (http://forensicerasmusmundus. blogs.lincoln.ac.uk/). Francisco Martin was supported by a PhD fellowship (SFRH/BD/87488/2012) from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal. Claudia Palladino was supported by a post-doc fellowship (SFRH/BPD/77448/2011) from Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript

High Instantaneous Inhibitory Potential of Bictegravir and the New Spiro-β-Lactam BSS-730A for HIV-2 Isolates from RAL-Naïve and RAL-Failing Patients

Funding Information: This work was supported by Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT), Portugal, Aga Khan Development Network (AKDN)–Portugal Collaborative Research Network in Portuguese-speaking countries in Africa (project 332821690). CQC is supported by FCT through projects UIDB/00313/2020 and UIDP/QUI/00313/2020, co-funded by COMPETE2020-UE. iMed.ULisboa, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, Portugal, is supported by FCT through projects UIDB/04138/2020 and UIDP/04138/2020. Inês Bártolo is supported by FCT through Norma Transitória–DL57/2016/CP1376/CT0012. Ana Rita Diniz (SFRH/BD/89140/2012), Francisco Martin (SFRH/BD/87488/2012), Inês Moranguinho (SFRH/BD/131062/2017), and Américo Alves (SFRH/BD/128910/2017) were supported by Ph.D. grants from FCT, Portugal. Publisher Copyright: © 2022 by the authors.Integrase inhibitors (INIs) are an important class of drugs for treating HIV-2 infection, given the limited number of drugs active against this virus. While the clinical efficacy of raltegravir and dolutegravir is well established, the clinical efficacy of bictegravir for treating HIV-2 infected patients has not been determined. Little information is available regarding the activity of bictegravir against HIV-2 isolates from patients failing raltegravir-based therapy. In this study, we examined the phenotypic and matched genotypic susceptibility of HIV-2 primary isolates from raltegravir-naïve and raltegravir-failing patients to raltegravir, dolutegravir, and bictegravir, and to the new spiro-β-lactam BSS-730A. The instantaneous inhibitory potential (IIP) was calculated to help predict the clinical activity of bictegravir and BSS-730A. Isolates from raltegravir-naïve patients were highly sensitive to all INIs and BSS-730A. Combined integrase mutations E92A and Q148K conferred high-level resistance to raltegravir, and E92Q and T97A conferred resistance to raltegravir and dolutegravir. The antiviral activity of bictegravir and BSS-730A was not affected by these mutations. BSS-730A displayed strong antiviral synergism with raltegravir. Mean IIP values at Cmax were similar for all INIs and were not significantly affected by resistance mutations. IIP values were significantly higher for BSS-730A than for INIs. The high IIP values of bictegravir and BSS-730A for raltegravir-naïve and raltegravir-resistant HIV-2 isolates highlight their potential value for treating HIV-2 infection. Overall, the results are consistent with the high clinical efficacy of raltegravir and dolutegravir for HIV-2 infection and suggest a promising clinical profile for bictegravir and BSS-730A.publishersversionpublishe