Die Rolle der 14-3-3-Proteine beim Vorwärtstransport von Kaliumkanälen

Kaliumkanäle, die wie andere Ionenkanäle und Membrantransportproteine ein wichtiges Bindeglied zwischen dem extrazellulären bzw. luminalen Raum und dem Zellinneren darstellen, spielen eine Rolle in diversen zellulären Prozessen wie Aufrechterhaltung des Membranpotentials, Frequenz und Verlauf von Aktionspotentialen, Sekretion und Signaltransduktion. Sie bilden temporär Poren in der Membran, durch die hochselektiv Kaliumionen entlang eines elektrochemischen Gradienten transportiert werden können. Ihre Einbindung in zahlreiche physiologische Prozesse impliziert ihre strikte Regulation auf mehreren Ebenen, angefangen bei der Gewebe-spezifischen Expression über die Kontrolle der Kopienzahl am Ort ihrer Aktivität, bis hin zu den Regulationsmechanismen der Öffnungswahrscheinlichkeit der Pore und der Ionenselektivität. Ein funktioneller Kaliumkanal wird durch die Zusammenlagerung von homomeren oder heteromeren Untereinheiten gebildet, wobei bis zu vier primäre oder !-Untereinheiten den Kanal bilden und mit weiteren akzessorischen bzw. "-Untereinheiten assemblieren können. Für die Funktionalität von pankreatischen ATP-sensitiven Kaliumkanälen ist eine stöchiometrisch korrekte Assemblierung der beiden Untereinheiten Kir6.2 und SUR1 essentiell. Vier Kanal-bildende Untereinheiten Kir6.2 müssen sich mit vier regulatorischen SUR1-Untereinheiten zu einem Oktamer zusammenlagern, damit der am Prozess der Insulinsekretion beteiligte Kaliumkanal zur Plasmamembran transportiert werden kann. Die Regulation auf der Ebene der Assemblierung erfolgt durch die Anwesenheit von ER-Lokalisationssignalen in den zytosolischen Domänen beider Proteinuntereinheiten. Diese Arginin-haltigen Motive (RKR) werden von zwei gegensätzlich wirkenden Interaktionspartnern erkannt: Einzelne bzw. unvollständig oder falsch zusammengelagerte Untereinheiten werden durch die COPI-Maschinerie zum ER zurückgeführt, während zytosolische 14-3-3-Proteine am Vorwärtstranport zur Plasmamembran beteiligt sind. Im Verlauf dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass 14-3-3-Proteine nicht nur spezifisch Kir6.2-Reporterproteine binden können, sondern dass diese Proteine am Transport des vollständigen, heterooktameren KATP-Kanalkomplexes beteiligt sind. Die Interaktion ist dabei eng an den Multimerisierungsstatus gekoppelt und involviert Aminosäurebereiche außerhalb der ER-Lokalisationssequenz in Kir6.2. Dabei ist die Aufgabe der 14-3-3-Proteine letztlich die Inaktivierung der Arginin-Signale in der Untereinheit SUR1, denn die Signale von Kir6.2 werden durch die korrekte Assemblierung mit SUR1 maskiert. Die 14-3-3-Proteine dienen dabei ausschließlich der Qualitätskontrolle und spielen keine Rolle beim Vorwärtstransport per se, denn sie haben keinen Einfluss auf den Transport des Kanals zur Zelloberfläche, wenn alle acht ER-Lokalisationssignale im KATP-Komplex mutiert sind. Die Untersuchung eines Kir6.2-Reporterproteins in Bäckerhefezellen, in denen jeweils nur eine von den insgesamt sieben Säuger-14-3-3-Isoformen exprimiert wird, deuten auf eine 14-3-3-Isoform-Spezifität beim Vorwärtstransport von Membranproteinen hin. So ist denkbar, dass verschiedene 14-3-3-Isoformen den Transport pankreatischer KATP-Kanäle in verschiedene Kompartimente regulieren, da diese offensichtlich hauptsächlich in Insulin-enthaltenden sekretorischen Vesikeln und nur in geringer Kopienzahl an der Plasmamembran präsent sind. Eine vergleichbare Aufgabe in der Qualitätskontrolle nehmen 14-3-3-Proteine bei den Zwei-Poren-Kaliumkanälen TASK1 und TASK3 ein. Hier erkennen 14-3-3-Proteine ein neu entdecktes Arginin-haltiges ER-Lokalisationssignal im C-Terminus der Kanalproteine und sind wie bei KATP-Kanälen für die Inaktivierung dieses Signals verantwortlich, woraufhin die Kanäle an die Plasmamembran transportiert werden können

Novel cargo-binding site in the β and δ subunits of coatomer

Arginine (R)-based ER localization signals are sorting motifs that confer transient ER localization to unassembled subunits of multimeric membrane proteins. The COPI vesicle coat binds R-based signals but the molecular details remain unknown. Here, we use reporter membrane proteins based on the proteolipid Pmp2 fused to GFP and allele swapping of COPI subunits to map the recognition site for R-based signals. We show that two highly conserved stretches—in the β- and δ-COPI subunits—are required to maintain Pmp2GFP reporters exposing R-based signals in the ER. Combining a deletion of 21 residues in δ-COP together with the mutation of three residues in β-COP gave rise to a COPI coat that had lost its ability to recognize R-based signals, whilst the recognition of C-terminal di-lysine signals remained unimpaired. A homology model of the COPI trunk domain illustrates the recognition of R-based signals by COPI

Intracellular traffic of the K+ channels TASK-1 and TASK-3: role of N- and C-terminal sorting signals and interaction with 14-3-3 proteins

The two-pore-domain potassium channels TASK-1 (KCNK3) and TASK-3 (KCNK9) modulate the electrical activity of neurons and many other cell types. We expressed TASK-1, TASK-3 and related reporter constructs in Xenopus oocytes, mammalian cell lines and various yeast strains to study the mechanisms controlling their transport to the surface membrane and the role of 14-3-3 proteins. We measured potassium currents with the voltage-clamp technique and fused N- and C-terminal fragments of the channels to various reporter proteins to study changes in subcellular localisation and surface expression. Mutational analysis showed that binding of 14-3-3 proteins to the extreme C-terminus of TASK-1 and TASK-3 masks a tri-basic motif, KRR, which differs in several important aspects from canonical arginine-based (RxR) or lysine-based (KKxx) retention signals. Pulldown experiments with GST fusion proteins showed that the KRR motif in the C-terminus of TASK-3 channels was able to bind to COPI coatomer. Disabling the binding of 14-3-3, which exposes the KRR motif, caused localisation of the GFP-tagged channel protein mainly to the Golgi complex. TASK-1 and TASK-3 also possess a di-basic N-terminal retention signal, KR, whose function was found to be independent of the binding of 14-3-3. Suppression of channel surface expression with dominant-negative channel mutants revealed that interaction with 14-3-3 has no significant effect on the dimeric assembly of the channels. Our results give a comprehensive description of the mechanisms by which 14-3-3 proteins, together with N- and C-terminal sorting signals, control the intracellular traffic of TASK-1 and TASK-3