Beyond Rayleigh's limit : achieving real-time super-resolution fluorescence microscopy

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Morfológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2011The present work aimed to develop new tools and applications in super-resolution fluorescence microscopy to unlock high-resolution structural information on DNA, RNA and proteins. These molecules, central to the dogma in biology, exist as single-molecules at scales of few nanometres beyond the resolving power of classical fluorescence microscopy. In this context we have explored single-molecule localization microscopy (SMLM) techniques that hold to date the record in resolving power for optical microscopy. These have both the capacity to identify and localize individual molecules at scales experimentally demonstrated up to sub-nanometre level. In this family of methods, photo-activated localization microscopy (PALM) and stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) variants hold the potential to fully resolve complete cellular structures at the nanoscale by precisely localizing thousands to millions of individual fluorophores within a labelled cell. Tackling these novel methods is highly challenging due to their still embryonic state. My Ph.D. aimed to improve these novel methods in three different areas. First, the hardware configuration, by creating a simple setup method that converts a standard wide-field fluorescence or total-internal reflection fluorescence (TIRF) microscope into a super-resolution system able to achieve 3D nanoscopy. Second, the super-resolution image acquisition and analysis, by developing “QuickPALM” and tools such as the “Laser control for QuickPALM”, which integrated with other opensource libraries such as ImageJ or μManager provide a complete set of software tools to achieve super-resolution hardware control and real-time analysis of the acquired data. Third, the discovery of new photo-switchable probes for super-resolution, achieved by exploitation of the transient interaction of “classical” fluorophores with high-efficiency quenchers. These developments have been applied on the study of biological processes at the nanometer level througout my Ph.D. To this matter, the results section of the present thesis demonstrates one of the most prominent implementations, in which we have studied the spatial interaction of key proteins of the NF-κB pathway upon receptor stimulation by TNF-α or IL-1. Altogether, the work I developed during my Ph.D. has provided important and original scientific contributions for the advancement of single molecule localization microscopy. Shortly after QuickPALM was published and made available to the scientific community it became one of the most used analytical tools at the core of particle detection and reconstruction for the class of SMLM techniques. Moreover, my results provide a novel view into cellular structure at the molecular level and provide a novel framework to study the interplay of key molecular participants in biology.O presente trabalho teve por objectivo o desenvolvimento de novas ferramentas e aplicações em microscopia de super-resolução por fluorescência, desbloqueando informações estruturais de alta resolução em moléculas como DNA, RNA e proteínas. Estas moléculas, parte do dogma central da biologia, existem como objectos individuais em escalas de poucos nanometros, para além do poder de resolução da microscopia de fluorescência clássica. Neste contexto, explorámos neste trabalho técnicas de single-molecule localization microscopy (SMLM), que mantêm até hoje o recorde em poder de resolução para microscopia óptica. Estas técnicas, têm a capacidade de experimentalmente identificar e localizar moléculas individuais na escala de sub-nanometros. Nesta família de métodos, photo-activated localization microscopy (PALM), stochastic optical reconstruction microscopy (STORM) e suas variantes, têm o potencial para resolver estruturas celulares completas com uma precisão nanométrica através da localização de milhares de milhões de fluoróforos individuais no interior de células marcadas. A implementação e utilização destes novos métodos representam um enorme desafio já que estes ainda se encontram no seu “estádio embrionário”. O meu doutoramento teve como objectivo melhorar estes novos métodos em três áreas diferentes. A primeira área sendo a configuração de hardware, nomeadamente através do desenvolvimento de um método que permite converter um microscópio wide-field de fluorescência ou de total internal reflection fluorescence (TIRF) em um sistema de super-resolução capaz de alcançar nanoscopia 3D. A segunda área focou-se em melhorar os métodos de aquisição e análise de imagem em super-resolução, através do desenvolvimento de “QuickPALM” e ferramentas como o “controle do laser para QuickPALM”. Estes quando integrados com outras bibliotecas de software open-source, como o ImageJ ou μManager, constituem um conjunto completo de ferramentas de software necessário para controlar o microscópio de super-resolução e analisar em tempo real os dados adquiridos. A terceira área relacionada com o desenvolvimento de novas sondas photo-switchable para super-resolução, baseou-se na exploração de interacções transitórias de fluoróforos "clássicos" com supressores de fluorescência de alta eficiência. Estes desenvolvimentos têm sido aplicados para o estudo de processos biológicos ao nível nanométrico ao longo do meu doutoramento. A secção de resultados da presente tese demonstra uma das implementações mais proeminente, em que temos estudado a interacção espacial de proteínas chave na via de sinalização NF-κB activada após estimulação de receptores como TNF-α e IL-1. No global, o trabalho que desenvolvi durante o meu doutoramento constitui uma contribuição científica original e extremamente relevante para o avanço da microscopia de localização molecular. Pouco tempo após a publicação e disponibilização do QuickPALM à comunidade científica, este tornou-se uma das ferramentas mais utilizadas na detecção de partículas e de reconstrução de imagens para a classe de técnicas de SMLM. Adicionalmente, os meus resultados fornecem uma visão nova no estudo de estruturas celulares a nível molecular e das interacções entre os participantes-chave na biologia molecular.Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT,SFRH/BD/63680/2009

The role of the miR-200 family in the epithelial-to-mesenchymal transition (EMT)

Over the last decade, microRNAs (miRNAs) have earned a lot of attention due to their critical roles in several biological processes and human diseases. However, progress in this field has been limited by the difficulty of discovering miRNA target genes, as each miRNA can potentially bind to hundreds of different mRNAs.(...

A course-agnostic approach

Santos, R. M. C., & Henriques, R. (2023). Predicting student performance from Moodle logs in higher education: A course-agnostic approach. In M. Carmo (Ed.), Education and New Developments 2023 (Vol. 2, pp. 77-81). Science Press. https://end-educationconference.org/wp-content/uploads/2023/06/Education-and-New-Developments_2023_Vol_II.pdfThe institutional adoption of learning management systems (LMS) aims to improve educational outcomes and reduce churn through student engagement with educational content. Modern LMS record all student interactions and store them as activity logs that encode patterns of learning behaviour. Previous research has shown that insights derived from log data can detect students at risk of failing in a single or a few courses, but comprehensive institution-wide surveys are few and far between. The work presented herein uses machine learning to create predictive models to identify students at risk or excellent students using the Moodle logs generated by a sample of 9296 course enrollments at a Portuguese information management school. 31 candidate features were extracted to create and train different predictive models. Model performance was evaluated through 30 repetitions of Stratified K-Fold Cross-Validation, using the area under the receiver operating characteristic (ROC) curve (AUC) and the F1-score. All experiments were repeated with the addition of the average of the intermediate grades obtained by the student in the course as a 32nd candidate feature. The results suggest that features extracted from Moodle logs are good predictors of students at risk, as indicated by the 0.752 AUC score achieved by Random Forest. The addition of intermediate grades significantly improves the predictive performance, leading to an AUC score of 0.922 and F1-Score of 0.693 for the best classifier, Gradient Boosting. However, the performance for identifying excelling students was comparatively lower, with an AUC score of 0.781 and F1-Score of 0.567 for Gradient Boosting. Future work should focus on exploring the implementation of an early warning system that can assist educators in identifying students in need while there is still time to provide feedback and develop corrective measures.publishersversionpublishe

Resource recovery from used water

Single cell protein (SCP) defines the dried cells of microorganisms that can be used as a protein supplement both in animal feed or human food. SCP could represent an effective alterna-tive to meet the high and growing demand of feed products. This work aimed to develop a simple and economically feasible process to obtain SCP by adding value to an industrial waste stream. Spent sulfite liquor (SSL), pure glycerol and crude glycerol and two different types of wood oils were selected. However, the wood oils were early discharged (after characterization) as possible substrates due to their low chemical oxygen de-mand (COD) content and an unpleasant and undesirable smell. Thus, only SSL and pure and crude glycerol were tested. Crude glycerol proved to be the most viable choice given the high COD content – - g O2/L – and the low price per ton of COD – 200 €/ton COD. In continuous mode it was possible to achieve biomass concentrations of - g CDW/L (- g CDW/g COD) while efficiently removing - % of the COD of the influent stream. When tested in batch mode, biomass concentration reached a maximum of - g CDW/L (- g CDW/g COD) after - days of operation. After - days of operation, CDW per liter started to decrease which could indicate some sort of inhibition by fermentation by-products or other toxic compounds. Considering a batch operation mode, it was possible to produce SCP (- %w/w of protein content) with a commercial price of - €/ton protein. Thus, SCP production was considered feasible since it was possible to obtain a product that can highly compete with other feed products, for example, fishmeal (market price: 1.940 €/ton protein)

Estilos e perfis de líderes intermédios com funções de avaliação de desempenho docente : discussão conceptual

Congresso realizado na Universidade do Porto de 19-22 de Junho de 2012Pretendemos neste texto discutir os conceitos “perfil de liderança” e “estilo de liderança” a partir das lideranças intermédias que têm a função de avaliar o desempenho dos docentes. Esta reflexão é baseada na investigação em curso de um dos autores no âmbito do Programa de Doutoramento em Educação, especialidade em Liderança Educacional, da Universidade Aberta, com o título “Estilos e perfis dos líderes intermédios na escola com funções de avaliação do desempenho docente”. Neste contexto, procuramos distinguir os dois conceitos partindo do entendimento de “perfil” enquanto predominantemente relacionado com as características profissionais/académicas existentes/exigidas e de “estilo” mais ligado às características pessoais moldáveis e relacionadas com os traços de personalidade ou eventualmente com as formas de atuação impostas pelo líder de topo. Os recentes desenvolvimentos das políticas educativas têm vindo a colocar as instituições escolares no centro das preocupações sociais. Concretamente, medidas como a generalização dos programas de avaliação de desempenho docente e a sua relação com a implementação de um novo modelo de gestão da escola têm contribuído para a reconfiguração da organização escolar ao nível das suas dinâmicas internas de funcionamento. Neste sentido, interessa compreender os modos como a organização escolar reage a este tipo de imperativos, de que forma recria as suas dinâmicas através da compreensão das práticas e olhares dos sujeitos nos seus contextos de ação. Debruçar-nos-emos, então, por mobilizar os conceitos referidos tendo por referência a conjuntura atual de acentuados condicionalismos, o quadro de reflexividade social e a complexidade da organização escolar.In this article we intend to discuss the concepts of ”leadership profile” and “leadership styles” of the intermediate leaders, whose function is to evaluate teachers’ performance in schools. This reflection is based upon the investigation being led by one of the authors within his PhD in Education, specialty in Educational Leadership, at Universidade Aberta, entitled “Styles and profiles of the school intermediate leaders with teacher evaluation functions”. In this context, we try to distinguish both concepts by considering “profile” as mainly related to professional/academic characteristics existing/required and “style” as connected to personal, flexible, personality-related traits or, eventually, with courses of action imposed by the top leader. Recent developments on education policies have been putting educational institutions in the centre of social concerns. Specifically, measures such as the generalizations of the teacher evaluation programs and its relation to the implementation of a new model of school management, have contributed to rearrange school organization in its internal functioning dynamics. In this sense, it is important to understand how schools reply to these impositions, how they recreate their dynamics through the understanding of practices and the perspectives of the subjects in action. We then start to summon the referred concepts, regarding the current juncture with marked constraints, the framework of social reflexivity and the complexity of school organization

Supervisão pedagógica: teoria e prática

O artigo resulta de uma investigação no âmbito do doutoramento em Educação, especialidade em Liderança EducacionalPretende-se com esta reflexão contribuir, de algum modo, para a clarificação do conceito supervisão pedagógica procurando retirar-lhe a carga depreciativa que o termo comportava. A importância da sua implementação duma forma aceite pelos agentes envolvidos também será aqui exaltada onde tentaremos destacar as vantagens que tem na construção de uma escola sustentável. Revisitaremos a emergência do conceito bem como as suas características, onde abordaremos as suas principais ações e a sua indissociável relação com a liderança.With this reflection we intend, somehow, to contribute to the clarification of the concept of pedagogical supervision trying to remove the depreciatory weight it may suggest. The importance of its being implemented with the agreement of all the parties involved will also be exalted here and we will try to highlight its advantages in building a sustainable school. We will approach the emergence of the concept and its characteristics, by presenting its main activities as well as its inseparable relationship to leadership

Patellid Limpets: An Overview of the Biology and Conservation of Keystone Species of the Rocky Shores

This work reviews a broad spectrum of subjects associated to Patellid limpets’ biology such as growth, reproduction, and recruitment, also the consequences of commercial exploitation on the stocks and the effects of marine protected areas (MPAs) in the biology and populational dynamics of these intertidal grazers. Knowledge of limpets’ biological traits plays an important role in providing proper background for their effective management. This chapter focuses on determining the effect of biotic and abiotic factors that influence these biological characteristics and associated geographical patterns. Human exploitation of limpets is one of the main causes of disturbance in the intertidal ecosystem and has occurred since prehistorical times resulting in direct and indirect alterations in the abundance and size structure of the target populations. The implementation of MPAs has been shown to result in greater biomass, abundance, and size of limpets and to counter other negative anthropogenic effects. However, inefficient planning and lack of surveillance hinder the accomplishment of the conservation purpose of MPAs. Inclusive conservation approaches involving all the stakeholders could guarantee future success of conservation strategies and sustainable exploitation. This review also aims to establish how beneficial MPAs are in enhancing recruitment and yield of adjacent exploited populations

Open-source single-particle analysis for super-resolution microscopy with virusmapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm - VirusMapper - packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images

O cuidador informal: avaliação e caracterização das populações com dependentes internados em unidades de cuidados continuados

Introducción: El envejecimiento de las sociedades es un hecho incontestable y Portugal no es una excepción. Aunque es uno de los países más pequeños de la Unión Europea (en 1996, el índice de envejecimiento fue de 86 personas mayores por cada 100 jóvenes, mientras que la Unión Europea en la misma proporción fue de 91 a 100) y se estima que el envejecimiento de la población experimenta un aumento progresivo (Fonseca, 2005). La estructura de edad es cada vez mayor, ya que hay bajos niveles de fecundidad y mortalidad (Fontaine, 2000). Métodos: Este estudio tiene como objetivo identificar las características sociodemográficas de los cuidadores informales y usuarios admitidos en el Junction y UCCI Ourém; evaluar el nivel de dependencia de los clientes admitidos y determinar el nivel de carga subjetiva, la satisfacción del cuidador y el impacto de la atención de los cuidadores informales de usuarios admitidos en el Junction y UCCI Ourém. Se utilizó una metodología correlacional descriptivo, con una muestra de 32 cuidadores informales y respectivos dependientes ingresados ​​en la Unidad de Cuidado Continuo. Se aplicó la Escala de Evaluación del cuidador, para medir los niveles de carga subjetiva, la satisfacción del cuidador y el impacto de la atención de los cuidadores informales, y el Índice de Barthel para determinar la dependencia funcional. Los datos demográficos fueron recolectados a través de un cuestionario. Resultados: Encontramos que existe una relación estadísticamente significativa entre la carga subjetiva y nivel de dependencia, así como entre el impacto de la atención y nivel de dependencia. Conclusiones: Concluimos que la población de cuidadores informales de los clientes de las Unidades de Atención Continuada, es necesario prestar atención a las más incisivas de los técnicas para mejorar su calidad de vida y, por extensión, la mejora de la calidad de vida de las personas a su cargo.Introduction: The aging of societies is an incontestable fact and Portugal is no exception. Although among the youngest countries of the European Union (in 1996, the aging index was 86 elderly for every 100 young people, while the European Union in the same proportion was 91 to 100), it is estimated that the aging population undergoes a progressive increase (Fonseca, 2005). The age structure is growing older, having low levels of fertility and mortality (Fontaine, 2000). Methods: This research aims to identify the sociodemographic characteristics of informal caregivers and users admitted to the Junction and UCCI Ourém; assess the level of dependency of clients admitted and determine the level of subjective burden, caregiver satisfaction and impact of care on informal caregivers of users admitted to the Junction and UCCI Ourém. We used a descriptive correlational methodology, with a sample of 32 informal caregivers and respective dependents admitted to the Continuing Care Unit. Was applied to the Caregiver Assessment Scale, to measure the levels of subjective burden, caregiver satisfaction and impact of care on informal caregivers, and the Barthel Index to determine the functional dependence of the dependent institutionalized. Demographic data were collected using a questionnaire. Results: We found a statistically significant relationship exists between subjective burden and level of dependency as well as between the impact of care and level of dependency. Conclusions: We conclude that the population of informal caregivers of clients of Continuing Care Units, attention is needed to more incisive of the technicians to improve their quality of life and by extension, improving the quality of life of their dependents.Introdução: O envelhecimento das sociedades é um dado incontestável e Portugal não foge à regra. Embora esteja entre os países mais jovens da União Europeia (em 1996, o índice de envelhecimento era de 86 idosos para cada 100 jovens, enquanto na União Europeia a mesma proporção era de 91 para 100), estima-se que o envelhecimento da população portuguesa sofra um aumento progressivo (Fonseca, 2005). A estrutura etária está cada vez mais envelhecida, tendo baixos níveis de fecundidade e de mortalidade (Fontaine, 2000). Metodologia: Esta investigação teve como objetivos conhecer as características sociodemográficas dos cuidadores informais e dos utentes internados nas UCCI do Entroncamento e Ourém; avaliar o nível de dependência dos utentes internados e determinar o nível de sobrecarga subjetiva, satisfação do cuidador e impacto do cuidado nos cuidadores informais dos utentes internados nas UCCI do Entroncamento e Ourém. Recorreu-se a uma metodologia descritiva correlacional, com uma amostra de 32 cuidadores informais e respetivos dependentes internados na Unidade de Cuidados Continuados. Foi aplicado a Escala de Avaliação do Cuidador, para aferir os níveis de sobrecarga subjetiva, satisfação do cuidador e impacto do cuidado no cuidador informal, e o Índice de Barthel para determinar o grau de dependência funcional do dependente internado. Os dados sociodemográficos foram recolhidos com recurso a um questionário. Resultados: Verificamos existir uma relação estatisticamente significativa entre a sobrecarga subjetiva e o nível de dependência assim como entre o impacto do cuidado e o nível de dependência. Conclusão: Concluímos que a população dos cuidadores informais dos utentes das Unidades de Cuidados Continuados, carecem de uma atenção mais incisiva da parte dos técnicos com vista à melhoria da sua qualidade de vida e por inerência, melhoria da qualidade de vida dos seus dependentes.peerReviewe

Modulation of the oxidative stress in malaria infection by clotrimazole

Antimycotic clotrimazole (CTZ) has demonstrated remarkable activity against Plasmodium falciparum in vitro and in vivo. Hemoglobin degradation by Plasmodium parasites makes amino acids available for protein synthesis, inducing oxidative stress in infected cells and producing free heme. These events represent biochemical targets for potential antimalarials. In this study, we have tested the ability of CTZ to modify the oxidative status in Plasmodium berghei-infected erythrocytes. After hemolysis, activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione cycle and NADPH+H+-producing dehydrogenases were investigated using UV-visible spectrophotometry. Thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) were evaluated as a marker of lipid damage. Results showed that CTZ significantly decreased the overall activity of 6-phosphagluconate dehydrogenase (6PGD) compared to infected and non-treated cells; consequently, the glutathione cycle was inhibited, leaving the parasite vulnerable to the oxidative stress originating from hemoglobin degradation. As a compensatory response, CTZ prevented some loss of SOD and CAT activities in infected cells. The infection triggered lipid peroxidation in erythrocytes, which was decreased by CTZ. These results suggest the presence of a redox unbalance in cells treated with CTZ, discussing a possible effect of this compound disturbing the oxidative status in a Plasmodium berghei-infection.O antifúngico clotrimazol (CTZ) tem demonstrado notável atividade contra Plasmodium falciparum. A degradação da hemoglobina por Plasmodium para a obtenção dos aminoácidos necessários à síntese protéica induz estresse oxidativo em eritrócitos devido à liberação de hemos oxidantes. Estes eventos representam alvos bioquímicos para a produção de antimaláricos potenciais. Neste estudo, testamos a capacidade do CTZ para modificar o estado oxidativo em eritrócitos infectados com Plasmodium berghei. Depois da hemólise, as atividades da superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), desidrogenases produtoras de NADPH+H+ e do ciclo de glutationa (GSH) foram investigados. A produção das espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foi avaliada como marcador de dano lipídico. Os resultados mostraram que o CTZ diminuiu a atividade da 6-fosfogliconato desidrogenase (6PGD), em comparação com eritrócitos infectados e não tratados. Consequentemente, o ciclo da GSH foi inibido, tornando os parasitas vulneráveis ao estresse oxidativo resultante da degradação da hemoglobina. Como resposta compensatória, CTZ impediu a perda de atividade da SOD e CAT nas células infectadas. A infecção induz peroxidação lipídica nos eritrócitos, sendo esta diminuída pelo CTZ. Estes resultados sugerem a existência de desequilíbrio redox nas células tratadas com CTZ, interferindo, assim, com o estado oxidativo verificado durante a infecção malárica