MicroRNA-based bioluminescent screening of a natural plant extracts library for cutaneous remodeling applications

Les microARNs jouent un rôle essentiel dans la morphogénèse et l’homéostasie cutanée. Cette classe d’ARN non codant contrôle plusieurs voies de signalisation en régulant l’expression de réseaux entiers de gènes cibles. Ils sont donc considérés comme des cibles biologiques de choix pour les stratégies de criblage de composés bioactifs. Au laboratoire, nous avons conçu une sonde d’imagerie bioluminescente inductible par les microARNs, dénommée RILES pour « RNAi-Inducible Luciferase Expression System » qui se prête particulièrement bien au criblage cellulaire de librairies de composés synthétiques. Au cours de ce doctorat, nous avons placé le système RILES sous contrôle de l’axe de régulation TGF-β1/microARN-21 choisi pour son rôle central dans la ré-épithélialisation cutanée. Le criblage d’une extractothèque de 37 extraits bruts de plantes nous a permis d’identifier trois extraits bruts de plantes, dont celui du Chardon Marie (Silybum marianum (L.) Gaertn) qui a fait l’objet d’études mécanistiques et fonctionnelles poussées.Nous avons montré que l’effet de l’extrait de Chardon-Marie sur le microARN-21 est dépendant d'un complexe contenant six flavonolignanes, appelé silymarine (SM). Des études d’immunoprécipitation de la protéine Argonaute 2 couplée à laRT-qPCR ont permis de révéler un mécanisme de régulation original du microARN-21 par cet extrait. Le séquençage àhaut débit du transcriptome (RNA-seq) des kératinocytes en réponse au traitement par le TGF-β1 et la SM a permis demettre en évidence trois signatures d’expression génique majeures associées à la différenciation kératinocytaire, aucycle cellulaire et de façon inattendue au métabolisme des lipides. Nous avons montré que la SM bloque le cycle cellulaire en phase G0/G1, inhibe la différenciation des kératinocytes via l’inhibition de l’expression de Notch3 et active la synthèse des lipides en inhibant la phosphorylation d’AMPK et en augmentant l’activité transcriptionnelle de PPARγ. Parailleurs, la SM ralentit la migration cellulaire en perturbant la transition épithélio-mésenchymateuse et inhibe les réponses inflammatoires en bloquant l’activité transcriptionnelle de NF-ƙB. Du fait de ces propriétés biologiques, pour certaines nouvelles, nous avons évalué l’effet thérapeutique de la SM contre le développement du psoriasis en plaques induit par l’imiquimod chez la souris. Nos résultats indiquent que la SM pourrait représenter une alternative prometteuse « naturelle » aux traitements pharmacologiques actuels pour la prise en charge de cette pathologie.MicroRNAs play essential roles in skin morphogenesis and homeostasis. This class of non coding RNA mediates cross-talk between various signaling pathways through repression of multiple targeted genes. Therefore microRNAs areconsidered as relevant biological targets for screening of bioactive compounds. We previously developed a microRNAmonitoring system called RILES, standing for “RNAi-Inducible Luciferase Expression System” that was found particularlywell suited for cell-based screening of synthetic compound libraries. During this Ph.D project, we placed the RILESsystem under the control of the TGF-β1/microRNA-21 axis of regulation because of its pivotal role in the re-epithelialization process. Screening of 37 plant crude extracts enabled us to identify three plant extracts, for which themilk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn) extract was selected for further in-depth functional and mechanisticinvestigation. We showed that the activity of milk thistle extract on microRNA-21 expression is dependent on a mixture ofsix flavonolignans, called silymarin (SM). Argonaute 2 immunoprecipitation (RIP) coupled with RT-qPCR analysisunveiled an original mechanism of action of SM on microRNA-21 regulation. RNA next generation sequencing (RNA-seq)analysis of keratinocytes treated with TGF-β1 plus SM revealed three main transcriptomic signatures associated withkeratinocytes differentiation, cell cycle and surprisingly lipid metabolism. We showed that SM blocks cell cycleprogression in G0/G1 phase, inhibits keratinocytes differentiation through repression of Notch3 and stimulates lipidsynthesis via inhibition of AMPK phosphorylation and activation of PPARγ transcriptional activity. Besides, SM reduceskeratinocytes migration by interfering with epithelial-to-mesenchymal transition and inhibits inflammatory responses bysuppressing NF-ƙB transcriptional activity. Because of these novel biological properties, we evaluated the therapeuticefficacy of SM in IMQ-induced-psoriasis-like mouse model. Our results indicate that SM may represent a naturalalternative treatment for psoriasis management

Criblage bioluminescent microARN spécifique d’une librairie d’extraits naturels de plantes pour des applications dans le remodelage cutané

MicroRNAs play essential roles in skin morphogenesis and homeostasis. This class of non coding RNA mediates cross-talk between various signaling pathways through repression of multiple targeted genes. Therefore microRNAs areconsidered as relevant biological targets for screening of bioactive compounds. We previously developed a microRNAmonitoring system called RILES, standing for “RNAi-Inducible Luciferase Expression System” that was found particularlywell suited for cell-based screening of synthetic compound libraries. During this Ph.D project, we placed the RILESsystem under the control of the TGF-β1/microRNA-21 axis of regulation because of its pivotal role in the re-epithelialization process. Screening of 37 plant crude extracts enabled us to identify three plant extracts, for which themilk thistle (Silybum marianum (L.) Gaertn) extract was selected for further in-depth functional and mechanisticinvestigation. We showed that the activity of milk thistle extract on microRNA-21 expression is dependent on a mixture ofsix flavonolignans, called silymarin (SM). Argonaute 2 immunoprecipitation (RIP) coupled with RT-qPCR analysisunveiled an original mechanism of action of SM on microRNA-21 regulation. RNA next generation sequencing (RNA-seq)analysis of keratinocytes treated with TGF-β1 plus SM revealed three main transcriptomic signatures associated withkeratinocytes differentiation, cell cycle and surprisingly lipid metabolism. We showed that SM blocks cell cycleprogression in G0/G1 phase, inhibits keratinocytes differentiation through repression of Notch3 and stimulates lipidsynthesis via inhibition of AMPK phosphorylation and activation of PPARγ transcriptional activity. Besides, SM reduceskeratinocytes migration by interfering with epithelial-to-mesenchymal transition and inhibits inflammatory responses bysuppressing NF-ƙB transcriptional activity. Because of these novel biological properties, we evaluated the therapeuticefficacy of SM in IMQ-induced-psoriasis-like mouse model. Our results indicate that SM may represent a naturalalternative treatment for psoriasis management.Les microARNs jouent un rôle essentiel dans la morphogénèse et l’homéostasie cutanée. Cette classe d’ARN non codant contrôle plusieurs voies de signalisation en régulant l’expression de réseaux entiers de gènes cibles. Ils sont donc considérés comme des cibles biologiques de choix pour les stratégies de criblage de composés bioactifs. Au laboratoire, nous avons conçu une sonde d’imagerie bioluminescente inductible par les microARNs, dénommée RILES pour « RNAi-Inducible Luciferase Expression System » qui se prête particulièrement bien au criblage cellulaire de librairies de composés synthétiques. Au cours de ce doctorat, nous avons placé le système RILES sous contrôle de l’axe de régulation TGF-β1/microARN-21 choisi pour son rôle central dans la ré-épithélialisation cutanée. Le criblage d’une extractothèque de 37 extraits bruts de plantes nous a permis d’identifier trois extraits bruts de plantes, dont celui du Chardon Marie (Silybum marianum (L.) Gaertn) qui a fait l’objet d’études mécanistiques et fonctionnelles poussées.Nous avons montré que l’effet de l’extrait de Chardon-Marie sur le microARN-21 est dépendant d'un complexe contenant six flavonolignanes, appelé silymarine (SM). Des études d’immunoprécipitation de la protéine Argonaute 2 couplée à laRT-qPCR ont permis de révéler un mécanisme de régulation original du microARN-21 par cet extrait. Le séquençage àhaut débit du transcriptome (RNA-seq) des kératinocytes en réponse au traitement par le TGF-β1 et la SM a permis demettre en évidence trois signatures d’expression génique majeures associées à la différenciation kératinocytaire, aucycle cellulaire et de façon inattendue au métabolisme des lipides. Nous avons montré que la SM bloque le cycle cellulaire en phase G0/G1, inhibe la différenciation des kératinocytes via l’inhibition de l’expression de Notch3 et active la synthèse des lipides en inhibant la phosphorylation d’AMPK et en augmentant l’activité transcriptionnelle de PPARγ. Parailleurs, la SM ralentit la migration cellulaire en perturbant la transition épithélio-mésenchymateuse et inhibe les réponses inflammatoires en bloquant l’activité transcriptionnelle de NF-ƙB. Du fait de ces propriétés biologiques, pour certaines nouvelles, nous avons évalué l’effet thérapeutique de la SM contre le développement du psoriasis en plaques induit par l’imiquimod chez la souris. Nos résultats indiquent que la SM pourrait représenter une alternative prometteuse « naturelle » aux traitements pharmacologiques actuels pour la prise en charge de cette pathologie

Impact du microenvironnement dans la composition, la plasticité et la formation des invadosomes

Invadosomes are plastic and dynamic invasive structures interacting with the microenvironement. Those structures are involved in several functions as adhesion, mecanotransduction and degradation of the extracellular matrix (ECM). My PhD work focuses on i) the study of the invadosomes composition by mass spectrometry and ii) on the impact of microenvironmental elements on the formation of those invasive structures.i) Invadosomes are multi-protein complexes in which all partners are not yet fully identified. In the laboratory, a new approach combining laser micordissection followed by mass spectrometry analysis was developed. This technique has been applied to the study of invadosome rosettes. We have demontrasted a new function associated with indosomes, defining them as active sites of protein translation. Invadosomes, however, are plastic structures whose formation and morphology are modulated by different elements of the environment. We now wish to determine the common and specific partners between the different invadosomes organizations in order to identify the molecules involved in their plasticity.The invadosomes formation can be induced by different elements of the microenvironment such as growth factors or the composition and rigidity of the ECM. TGF-β is a growth factor involved in the invadosomes formation, in the ECM rigidity and in liver fibrosis that can lead to the development of hepatocellular carcinoma. We have studied the impact of TGF-β in the formation of linear invadosomes in the context of type I collagen. We show that TGF-β modulates the molecular machinery associated with linear invadosomes by inducing the expression of DDR1 and MT1-MMP, as well as elements involved in their formation, such as collagen I. These modulations are dependent on the TGF-β canonical signaling pathway through Smad4 and promote the formation and activity of linear invadosomes. In addition, TGF-β induces an overexpression of LOXL2, which is a collagen cross-linking enzyme, increasing the matrix stiffness and promotes the formation of these structures.Taken together, these results enabled us to better define the elements involved in the composition and formation of invadosomes.Les invadosomes sont des structures d’invasion plastiques et dynamiques qui interagissent avec leur microenvironnement. Ils possèdent différentes fonctions telles que l’adhésion, la mécanotransduction ou encore la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC). Mon travail de thèse s’est concentré sur i) l’étude globale de la composition des invadosomes par spectrométrie de masse et ii) sur l’impact d’éléments du microenvironnement dans la formation de ces structures d’invasion.i) Les invadosomes sont des complexes multi-protéiques dont tous les partenaires ne sont pas encore totalement identifiés. Au laboratoire, une nouvelle approche combinant la microdissection laser suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, a été développée. Cette technique a été appliquée à l’étude des invadosomes rosettes. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction associée aux invadosomes, en les définissants comme des sites actifs de traduction protéique. Les invadosomes cependant, sont des structures plastiques dont la formation et la morphologie sont modulées par différents éléments de l’environnement. Nous souhaitons à présent déterminer les partenaires communs et spécifiques entre les différentes organisations des invadosomes afin d’identifier les molécules impliquées dans cette plasticité.ii) La formation des invadosomes peut être induite par différents éléments du microenvironnement comme des facteurs de croissance ou encore la composition et la rigidité de la MEC. Le TGF-β est un facteur de croissance impliqué dans la formation des invadosomes, dans la promotion de la rigidité de la MEC et dans la fibrose hépatique pouvant mener au développement du carcinome hépatocellulaire. Nous avons alors étudié l’impact du TGF-β dans la formation des invadosomes linéaires en contexte de collagène de type I. Nous montrons que le TGF-β module la machinerie moléculaire associée aux invadosomes linéaires en induisant l’expression de DDR1 et MT1-MMP, ainsi que des éléments impliqués dans leur formation tels que le collagène I. Ces modulations sont dépendantes de la voie de signalisation canonique du TGF-β passant par Smad4 et favorisent la formation et l’activité des invadosomes linéaires. De plus, le TGF-β induit une surexpression de la LOXL2 qui est une enzyme de réticulation du collagène, augmentant la rigidité de la matrice ce qui favorise la formation des invadosomes.Les résultats obtenus durant ma thèse auront permis de mieux définir les éléments impliqués dans la composition et la formation des invadosomes

Microenvironment involvement in invadosomes composition, plasticity and formation

Les invadosomes sont des structures d’invasion plastiques et dynamiques qui interagissent avec leur microenvironnement. Ils possèdent différentes fonctions telles que l’adhésion, la mécanotransduction ou encore la dégradation de la matrice extracellulaire (MEC). Mon travail de thèse s’est concentré sur i) l’étude globale de la composition des invadosomes par spectrométrie de masse et ii) sur l’impact d’éléments du microenvironnement dans la formation de ces structures d’invasion.i) Les invadosomes sont des complexes multi-protéiques dont tous les partenaires ne sont pas encore totalement identifiés. Au laboratoire, une nouvelle approche combinant la microdissection laser suivie d’une analyse par spectrométrie de masse, a été développée. Cette technique a été appliquée à l’étude des invadosomes rosettes. Nous avons ainsi mis en évidence une nouvelle fonction associée aux invadosomes, en les définissants comme des sites actifs de traduction protéique. Les invadosomes cependant, sont des structures plastiques dont la formation et la morphologie sont modulées par différents éléments de l’environnement. Nous souhaitons à présent déterminer les partenaires communs et spécifiques entre les différentes organisations des invadosomes afin d’identifier les molécules impliquées dans cette plasticité.ii) La formation des invadosomes peut être induite par différents éléments du microenvironnement comme des facteurs de croissance ou encore la composition et la rigidité de la MEC. Le TGF-β est un facteur de croissance impliqué dans la formation des invadosomes, dans la promotion de la rigidité de la MEC et dans la fibrose hépatique pouvant mener au développement du carcinome hépatocellulaire. Nous avons alors étudié l’impact du TGF-β dans la formation des invadosomes linéaires en contexte de collagène de type I. Nous montrons que le TGF-β module la machinerie moléculaire associée aux invadosomes linéaires en induisant l’expression de DDR1 et MT1-MMP, ainsi que des éléments impliqués dans leur formation tels que le collagène I. Ces modulations sont dépendantes de la voie de signalisation canonique du TGF-β passant par Smad4 et favorisent la formation et l’activité des invadosomes linéaires. De plus, le TGF-β induit une surexpression de la LOXL2 qui est une enzyme de réticulation du collagène, augmentant la rigidité de la matrice ce qui favorise la formation des invadosomes.Les résultats obtenus durant ma thèse auront permis de mieux définir les éléments impliqués dans la composition et la formation des invadosomes.Invadosomes are plastic and dynamic invasive structures interacting with the microenvironement. Those structures are involved in several functions as adhesion, mecanotransduction and degradation of the extracellular matrix (ECM). My PhD work focuses on i) the study of the invadosomes composition by mass spectrometry and ii) on the impact of microenvironmental elements on the formation of those invasive structures.i) Invadosomes are multi-protein complexes in which all partners are not yet fully identified. In the laboratory, a new approach combining laser micordissection followed by mass spectrometry analysis was developed. This technique has been applied to the study of invadosome rosettes. We have demontrasted a new function associated with indosomes, defining them as active sites of protein translation. Invadosomes, however, are plastic structures whose formation and morphology are modulated by different elements of the environment. We now wish to determine the common and specific partners between the different invadosomes organizations in order to identify the molecules involved in their plasticity.The invadosomes formation can be induced by different elements of the microenvironment such as growth factors or the composition and rigidity of the ECM. TGF-β is a growth factor involved in the invadosomes formation, in the ECM rigidity and in liver fibrosis that can lead to the development of hepatocellular carcinoma. We have studied the impact of TGF-β in the formation of linear invadosomes in the context of type I collagen. We show that TGF-β modulates the molecular machinery associated with linear invadosomes by inducing the expression of DDR1 and MT1-MMP, as well as elements involved in their formation, such as collagen I. These modulations are dependent on the TGF-β canonical signaling pathway through Smad4 and promote the formation and activity of linear invadosomes. In addition, TGF-β induces an overexpression of LOXL2, which is a collagen cross-linking enzyme, increasing the matrix stiffness and promotes the formation of these structures.Taken together, these results enabled us to better define the elements involved in the composition and formation of invadosomes

Tumor-resident stromal cells promote breast cancer Invasion through regulation of the basal phenotype

Collective invasion can be led by breast cancer cells expressing basal epithelial markers, typified by keratin-14 (KRT14). We analyzed gene expression data from The Cancer Genome Atlas and demonstrated a significant correlation between a KRT14+ invasion signature and a stromal-mediated extracellular matrix (ECM) organization module. We then developed a novel coculture model of tumor organoids with autologous stromal cells. Coculture significantly increased KRT14 expression and invasion of organoids from both luminal and basal murine breast cancer models. However, stromal cell conditioned medium induced invasion but not KRT14 expression. Cancer cells released TGFβ and that signaling pathway was required for stromal cell-induced invasion and KRT14 expression. Mechanistically, TGFβ induced NOX4 expression in stromal cells and NOX4 inhibition reduced invasion and KRT14 expression. In summary, we developed a novel coculture model and revealed dynamic molecular interactions between stromal cells and cancer cells that regulate both basal gene expression and invasive behavior. Implications: Fibroblasts within mammary tumors can regulate the molecular phenotype and invasive behavior of breast cancer cells. Visual Overview: http://mcr.aacrjournals.org/content/molcanres/18/11/1615/F1.large.jpg

Targeting TGF-β1/miR-21 Pathway in Keratinocytes Reveals Protective Effects of Silymarin on Imiquimod-Induced Psoriasis Mouse Model

Epidermal cells integrate multiple signals that activate the signaling pathways involved in skin homeostasis. TGF-β1 signaling pathway upregulates microRNA (miR)-21-5p in keratinocytes and is often deregulated in skin diseases. To identify the bioactive compounds that enable to modulate the TGF-β1/miR-21-5p signaling pathway, we screened a library of medicinal plant extracts using our miR-ON RILES luciferase reporter system placed under the control of the miR-21-5p in keratinocytes treated with TGF-β1. We identified silymarin, a mixture of flavonolignans extracted from Silybum marianum (L.) Gaertn., as the most potent regulator of miR-21-5p expression. Using Argonaute 2 immunoprecipitation and RT-qPCR, we showed that silymarin regulates the expression of miR-21-5p through a noncanonical TGF-β1 signaling pathway, whereas RNA-sequencing analysis revealed three unexpected transcriptomic signatures associated with keratinocyte differentiation, cell cycle, and lipid metabolism. Mechanistically, we demonstrated that SM blocks cell cycle progression, inhibits keratinocyte differentiation through repression of Notch3 expression, stimulates lipid synthesis via activation of PPARγ signaling and inhibits inflammatory responses by suppressing the transcriptional activity of NF-κB. We finally showed that topical application of silymarin alleviates the development of imiquimod-induced psoriasiform lesions in mice by abrogating the altered expression levels of markers involved in inflammation, proliferation, differentiation, and lipid metabolism

miR-21-3p/IL-22 Axes Are Major Drivers of Psoriasis Pathogenesis by Modulating Keratinocytes Proliferation-Survival Balance and Inflammatory Response

Psoriasis is a chronic inflammatory skin disease that is mediated by complex crosstalk between immune cells and keratinocytes (KCs). Emerging studies have showed a specific psoriatic microRNAs signature, in which miR-21 is one of the most upregulated and dynamic miRNAs. In this study, we focused our investigations on the passenger miR-21-3p strand, which is poorly studied in skin and in psoriasis pathogenesis. Here, we showed the upregulation of miR-21-3p in an IMQ-induced psoriasiform mouse model. This upregulation was correlated with IL-22 expression and functionality, both in vitro and in vivo, and it occurred via STAT3 and NF-κB signaling. We identified a network of differentially expressed genes involved in abnormal proliferation control and immune regulatory genes implicated in the molecular pathogenesis of psoriasis in response to miR-21-3p overexpression in KCs. These results were confirmed by functional assays that validated the proliferative potential of miR-21-3p. All these findings highlight the importance of miR-21-3p, an underestimated miRNA, in psoriasis and provide novel molecular targets for therapeutic purposes

miR-21-3p/IL-22 axes are major drivers of psoriasis pathogenesis by modulating keratinocytes proliferationsurvival balance and inflammatory response

International audiencePsoriasis is a chronic inflammatory skin disease that is mediated by complex crosstalk between immune cells and keratinocytes (KCs). Emerging studies have showed a specific psoriatic microRNAs signature, in which miR-21 is one of the most upregulated and dynamic miRNAs. In this study, we focused our investigations on the passenger miR-21-3p strand, which is poorly studied in skin and in psoriasis pathogenesis. Here, we showed the upregulation of miR-21-3p in an IMQ-induced psoriasiform mouse model. This upregulation was correlated with IL-22 expression and functionality, both in vitro and in vivo, and it occurred via STAT3 and NF-κB signaling. We identified a network of differentially expressed genes involved in abnormal proliferation control and immune regulatory genes implicated in the molecular pathogenesis of psoriasis in response to miR-21-3p overexpression in KCs. These results were confirmed by functional assays that validated the proliferative potential of miR-21-3p. All these findings highlight the importance of miR-21-3p, an underestimated miRNA, in psoriasis and provide novel molecular targets for therapeutic purposes

Intracellular trafficking and functional monitoring of miRNA delivery in glioblastoma using lipopolyplexes and the miRNA-ON RILES reporter system

International audienceMicroRNA (miRNA) oligonucleotides therapeutics are potent and attractive drugs for cancer treatment, but the kinetics of their intracellular trafficking, RISC processing and interaction with their mRNA targets in the cells are still not well understood. Moreover, the absence of efficient carriers impairs their translation into the clinic. Here, we compare the kinetics of miRNA-133a activity after transfection of U87MG glioblastoma cells with either a home-made lipopolyplexes (LPRi) or with the RNAiMax transfection reagent. For this purpose, we combined miRNA intracellular trafficking studies by confocal microscopy with our previously described RILES miRNA-ON reporter system subcloned here in a lentivirus expression vector (LentiRILES) for longitudinal analysis of miRNA activity in transfected cells. Using the LentiRILES system, we report significant differences in terms of miRNA delivery kinetics performed by these two transfection regents. We decipher the mechanisms of miRNA delivery by LPRi and investigate the main steps of miRNA internalization and cytosolic processing. We demonstrate that LPRi preferentially uses caveolae-mediated endocytosis as the main internalization pathway, releases miRNA into the cytosol after the first 3 h of incubation, and addresses the cytosolic miRNAs to P-bodies, while a fraction of miRNAs are exported to the extracellular space through exosomes which were found fully capable to re-transfect the cells. We implanted the LentiRILES cells in the brain of mice and infused the tumours with LPRi.miRNA using the convection-enhanced delivery method. Bioluminescence imaging of the live mice revealed efficient delivery of miRNAs in glioblastoma tumours, attesting successful miRNA uptake, internalization and RISC activation in vivo. Overall, our study provides a comprehensive overview of miRNA intracellular trafficking and processing in a glioblastoma context and highlights the potential use of LPRi for miRNA-based therapy