Engineered β\beta-lactoglobulin produced in E-coli : purification, biophysical and structural characterisation

Functional recombinant bovine β-lactoglobulin has been produced by expression in E. coli using an engineered protein gene and purified to homogeneity by applying a new protocol. Mutations L1A/I2S introduced into the protein sequence greatly facilitate in vivo cleavage of the N-terminal methionine, allowing correctly folded and soluble protein suitable for biochemical, biophysical and structural studies to be obtained. The use of gel filtration on Sephadex G75 at the last purification step enables protein without endogenous ligand to be obtained. The physicochemical properties of recombinant β-lactoglobulin such as CD spectra, ligand binding (n, K(a), ΔH, TΔS, ΔG), chemical and thermal stability (ΔG(D), C(mid)) and crystal structure confirmed that the protein obtained is almost identical to the natural one. The substitutions of N-terminal residues did not influence the binding properties of the recombinant protein so that the lactoglobulin produced and purified according to our protocol is a good candidate for further engineering and potential use in pharmacology and medicine. ELECTRONIC SUPPLEMENTARY MATERIAL: The online version of this article (doi:10.1007/s12033-016-9960-z) contains supplementary material, which is available to authorized users

The optimization of expression, isolation, purification and crystallization conditions of recombinant beta-lactoglobulin and its variant V92F

β-laktoglobulina (BlgB) jest białkiem należącym do rodziny lipokalin. Lipokaliny, można poddać modyfikacjom mającym na celu zwiększenie ich powinowactwa do wybranych związków, dzięki temu mogą one znaleźć potencjalne zastosowanie w medycynie do transportu leków lub usuwania toksyn z organizmu. Badania miały na celu optymalizację produkcji BlgB oraz jej wariantu V92F w komórkach E.coli w ilościach umożliwiających badania strukturalne, kalorymetryczne i spektroskopowe. Mutant V92F został zaprojektowany w celu zwiększenia specyficzności wiązania fragmentów aromatycznych oraz spłycenia miejsca wiążącego.BlgB i V92F były produkowane w trakcie koekspresji z bakteryjną izomerazą DsbC. Dla takiego układu optymalizowano czas prowadzenia hodowli oraz moment zaindukowania ekspresji. Izolowane białko oczyszczano z wykorzystaniem chromatografii jonowymiennej oraz frakcjonowanego wysalania oraz krystalizowano techniką wiszącej kropli. Otrzymana laktoglobulina wykazywała własności odmienne od białka naturalnego. Przyczyną tego jest prawdopodobnie obecność nieodciętej reszty Met na N końcu łańcucha, której obecność potwierdzono za pomocą spektrometrii mas oraz sekwencjonowania chemicznego. Rozwiązana struktura BlgB ujawniła, że mostki disiarczkowe w białku są utworzone poprawnie, natomiast w okolicach N-końca, pojawiają się dodatkowe, nieobserwowane dla naturalnego białka oddziaływania.β-Lactoglobulin is a protein that belongs to lipocalin family. Lipocalins can be re-engineered to increase their affinity to selected compounds. Modified lipocalins can find potential application in medicine as drugs carriers or as agents binding toxic compounds. The aim of this study was to optimize process of BlgB and V92F production, to obtain correctly folded protein in quantities suitable for spectroscopic, calorimetric and structural studies. Mutant V92F was engineered to increase specificity for binding aromatic fragments and to shallow ligand binding site. BlgB and V92F were produced in E. coli strain in co-expression with disulphide bond isomerase DsbC. The moment of expression induction and the time of E.coli culture were optimized. BlgB and V92F were isolated from cells by sonication. Cell lysate was purified by anion exchange chromatography and salting-out. BlgB was crystallized by hanging drop technique. The recombinant protein showed different properties than its natural counterpart probably due to uncleaved N-terminal Met. The presence of Met at protein N-terminus was confirmed by mass spectrometry and chemical sequencing. The determined BlgB crystal structure revealed proper formation of disulphide bonds and additional interactions in the N-terminal region that were not observed previously in the crystal structures of natural protein