Los linfocitos B y las células plasmáticas regulan la respuesta inflamatoria en la infección con Trypanosoma cruzi

Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2016La enfermedad de Chagas, causada por el parásito Trypanosoma cruz¡, afecta a 8 millones de personas e impone una importante carga económica debido a la mortalidad temprana y discapacidad fisica. Es endémica en América Latina, pero se convirtió en un problema de salud pública mundial por la migración de las personas infectadas. La progresión de la enfermedad, desde asintomática a grave, está vinculada a la heterogeneidad de las distintas cepas del parásito existentes y a una variable respuesta inmune del hospedador infectado. Se ha informado que la persistencia del parásito, así como la intensidad de la respuesta inflamatoria son determinantes de las manifestaciones clínicas de la enfermedad [1, 21. A pesar de que la inflamación es indispensable para la defensa del huésped [3-14], cuando está desregulada puede contribuir a lesiones tisulares y disfunción orgánica [15-19]. En consecuencia, la identificación de la naturaleza de las células y moléculas capaces de mantener la integridad del hospedador, así como la replicación del patógeno, es crucial para la comprensión de la patogénesis de la enfermedad de Chagas y también para el diseño de nuevos enfoques terapéuticos. La fase aguda de la enfermedad de Chagas en ratones y seres humanos se caracteriza por un estado de inmunosupresión en el que T. cruz¡ se replica extensivamente e induce moléculas inmunomoduladoras que retrasan las respuestas de linfocitos (Li) T específicos del parásito. Este estado de las células T coexiste con la activación policlonal de LiB, lo que sugiere que los LiB pueden influir en la función de LiT y viceversa. Durante la infección por T cruz¡, se ha establecido que los LiB tienen un rol protector fundamental [20], y se ha descripto que los anticuerpos (Acs), los cuales son producto de estas células, pueden ejercer funciones tanto protectoras [21-23] como deletéreas (Acs autoreactivos) [24, 251]. Sin embargo, no se han descripto en profundidad mecanismos ejercidos por los LiB independientes de su capacidad para producir Acs. Últimamente, en diversos modelos experimentales, se han reportado funciones regulatorias tanto para los LiB [26] como para LiB que expresan CD138 y que corresponden a estadios de diferenciación, denominados plasmoblastos y/o células plasmáticas (PL/CP), siendo las células plasmáticas (CF) el estadio de diferenciación terminal [27-30]. La mayoría de los mecanismos regulatorios, ejercidos por las células mencionadas, involucran la secreción de citoquinas [28-31]. Sin embargo, queda por esclarecer el posible papel regulador desempeñado por los LiB y los PL/CP vía moléculas inhibitorias expresadas en la superficie celular. Es por ello que el objetivo de este trabajo de tesis fue: Evaluar la función regulatoria de los LiB y de su producto de diferenciación, los PL/CP, sobre la respuesta 1q inflamatoria disparada en la infección con T. cruz¡ y tratar de identificar alguno de los mediadores involucrados. Para ello, utilizamos un modelo de infección en ratones ya descripto y en curso en nuestro laboratorio, que consiste en la infección de ratones C57BL/6 (controles, del Inglés: WT) con tripomastigotes del T cruzi cepa Y-br. Para llevar a cabo nuestro objetivo empleamos además ratones muMT, los cuales son ratones modificados genéticamente deficientes en LiB maduros. Observamos que los ratones muMT infectados presentan una prematura mortalidad pero son capaces de controlar la replicación del T. cruz¡. Los ratones muMT infectados presentaron un aumento significativo en la concentración plasmática de IFN-y y TNF, en comparación a ratones WT infectados; sugiriendo que en ausencia de LiB la infección dispara una exacerbada respuesta inmune pro-inflamatoria. En particular, los ratones muMT infectados presentaron alteraciones clínicas y bioquímicas asociadas a elevados niveles de TNF en suero, y una correlación entre la concentración de TNF y su mortalidad. El bloqueo de TNF promovió una recuperación inicial en el peso corporal de los ratones muMT infectados tratados, pero a tiempos tardíos los ratones murieron por exacerbación de la respuesta pro-inflamatoria. En correlación con los incrementados valores de TNF en plasma, los ratones muMT infectados presentaron un mayor porcentaje y número relativo de células productoras de TNF en bazo y ganglios linfáticos. En particular, la composición de la población secretora de TNF de los ratones muMT infectados con respecto a ratones WT infectados fue diferente; contenía un mayor porcentaje de LiT CD4*Ly6C+, LiT CD8Ly6C y de células con fenotipo de neutrófilo Ly6GLy6C. A su vez, siendo los LiT CD4 la mayoría de las células productoras de TNF en ambas cepas de ratones, los LiT CD4 de ratones muMT infectados presentaron un perfil pro-inflamatorio más exacerbado que sus análogos en ratones WT infectados, y la transferencia de LiT CD4 de ratones muMT infectados a ratones WT infectados alteró el perfil de los LiT CD4 en los ratones receptores y aumentó la secreción de IFN-y sistémico. Debido a que las alteraciones presentes en los ratones muMT infectados se producen en ausencia de los LiB, evaluamos los cambios fenotípicos y funcionales que sufre esta población celular durante la infección en los ratones WT, para así poder identificar a las poblaciones regulatorias B. Observamos que los Li B sufrieron una expansión inicial y posterior contracción tanto en bazo como en ganglios linfáticos, y que se generaron LiB de centro geiiiiinal (CG) y CF. Evaluando posibles mediadores regulatorios, observamos que durante la infección con T. cruz¡ los LiB y CP produjeron las citoquinas ILlO, TGF!3 e 1L6 y expresaron significativamente el Ligando 1 para el receptor PD1 (PDL1). Por medio de ensayos de eliminación de LiB y PL/CP, dentro de las células esplénicas de ratones infectados, evidenciamos que los LiB son capaces de regular negativamente, in vitro, a células secretantes de TNF a través de un mecanismo dependiente de contacto celular y que dicha función se abolió con el bloqueo de PDL1. Con el mismo tipo de ensayos evidenciamos que los PL/CP generadas durante la infección también son capaces de regular negativamente a células secretantes de TNF e IFN-y in vitro presentes en esplenocitos de ratones WT infectados. Al caracterizar en mayor profundidad a las CP de los ratones infectados con T. cruz¡, determinamos que las CP se ubican en focos extrafoliculares (EF), expresan CD11 c, PDL1 y otros receptores asociados a funciones supresoras como PDL2 y CD39. Demostramos que PDL1 se induce en los LiB a través de estímulos como ligandos de Toli, tripomastigotes de T cruz¡ e IFNy, y que CP generadas in vitro, al igual a lo determinado in vivo, presentaron mayor expresión de PDL1 que LiB activados. En base a este dato decidimos expandir, in vitro, a los LiB PDL1 para poder evaluar la función supresora de éstas células. Contrariamente a lo esperado, observamos que LiB activados con ligandos de TLR, o parásitos e IFNy o combinaciones de ellos y que expresan PDL1 indujeron la secreción de TNF y de IFNy por células esplénicas sin LiB (NoB) de ratones infectados. En estas condiciones experimentales los LiB parecían tener más una función presentadora de antígenos (Ag) que una función regulatoria. Para poder comprender este último resultado evaluamos el perfil fenotípico de los LiB y de las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ y los comparamos con el perfil de los LiB activados in vitro con los estímulos arriba mencionados. Observamos que las CP de los ratones infectados con T. cruz¡ expresaron menos niveles de CD80 y MHCII, y mayores niveles de PDL1 y CD39 que LiB estimulados in vitro. Los resultados indican que los LiB y CP de los ratones infectados que ejercen una función regulatoria tienen un fenotipo particular que no es expresado por sus equivalentes obtenidos in vitro y que el solo aumento de la expresión de PDL1 en LiB o CP no garantiza una función regulatoria. En conclusión general, en la presente tesis doctoral, determinamos que las CP generadas en la infección con T cruzi son capaces de ejercer funciones adicionales a las de secretar Acs, como es la de ejercer una función regulatoria de células secretantes de TNF e IFN'y, a través de la expresión de PDL1.Fil: Gorosito Serrán, Melisa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina

IL-10 Producing B Cells Dampen Protective T Cell Response and Allow Chlamydia muridarum Infection of the Male Genital Tract

A significant proportion of individuals develop chronic, persistent and recurrent genital tract infections with Chlamydia trachomatis, which has been attributed to the numerous strategies that the bacterium uses to subvert host immune responses. Animal chlamydia models have demonstrated that protective immune response is mediated by CD4+ Th1 cytokine responses. Herein, we demonstrate that early after infecting the male genital tract, C. muridarum triggers the production of IL-10 by splenic and lymph node cells. In addition, C. muridarum triggers IL-6 and TNFα secretion. Data obtained from in vitro and in vivo experiments revealed B cells as the major IL-10 contributors. Indeed, purified B cells produced high amounts of IL-10 and also exhibited enhanced expression of inhibitory molecules such as CD39, PD-L1 and PD1 after C. muridarum stimulation. In vitro experiments performed with sorted cell subsets revealed that Marginal Zone B cells were the main IL-10 producers. In vitro and in vivo studies using TLR-deficient mice indicated that TLR4 signaling pathway was essential for IL-10 production. In addition, in vivo treatments to neutralize IL-10 or deplete B cells indicated that IL-10 and B cells played a significant role in delaying bacterial clearance ability. Moreover, the latter was confirmed by adoptive cell transfer experiments in which the absence of IL-10-producing B cells conferred the host a greater capability to induce Th1 responses and clear the infection. Interestingly, NOD mice, which were the least efficient in clearing the infection, presented much more Marginal Zone B counts and also enhanced TLR4 expression on Marginal Zone B cells when compared to B6 and BALB/c mice. Besides, treatment with antibodies that selectively deplete Marginal Zone B cells rendered mice more capable of inducing enhanced IFNγ responses and clearing the infection. Our findings suggest that B cells play a detrimental role in C. muridarum infection and that activation by innate receptors like TLR4 and IL-10 production by these cells could be used by Chlamydia spp. as a strategy to modulate the immune response establishing chronic infections in susceptible hosts

IL-17RA-Signaling Modulates CD8+ T Cell Survival and Exhaustion During Trypanosoma cruzi Infection

The IL-17 family contributes to host defense against many intracellular pathogens by mechanisms that are not fully understood. CD8+ T lymphocytes are key elements against intracellular microbes, and their survival and ability to mount cytotoxic responses are orchestrated by several cytokines. Here, we demonstrated that IL-17RA-signaling cytokines sustain pathogen-specific CD8+ T cell immunity. The absence of IL-17RA and IL-17A/F during Trypanosoma cruzi infection resulted in increased tissue parasitism and reduced frequency of parasite-specific CD8+ T cells. Impaired IL-17RA-signaling in vivo increased apoptosis of parasite-specific CD8+ T cells, while in vitro recombinant IL-17 down-regulated the pro-apoptotic protein BAD and promoted the survival of activated CD8+ T cells. Phenotypic, functional, and transcriptomic profiling showed that T. cruzi-specific CD8+ T cells derived from IL-17RA-deficient mice presented features of cell dysfunction. PD-L1 blockade partially restored the magnitude of CD8+ T cell responses and parasite control in these mice. Adoptive transfer experiments established that IL-17RA-signaling is intrinsically required for the proper maintenance of functional effector CD8+ T cells. Altogether, our results identify IL-17RA and IL-17A as critical factors for sustaining CD8+ T cell immunity to T. cruzi

Immunity and vaccine development efforts against Trypanosoma cruzi

Artículo de revisión especializadoTrypanosoma cruzi (T. cruzi) is the causative agent for Chagas disease (CD). There is a critical lack of methods for prevention of infection or treatment of acute infection and chronic disease. Studies in experimental models have suggested that the protective immunity against T. cruzi infection requires the elicitation of Th1 cytokines, lytic antibodies and the concerted activities of macrophages, T helper cells, and cytotoxic T lymphocytes (CTLs). In this review, we summarize the research efforts in vaccine development to date and the challenges faced in achieving an efficient prophylactic or therapeutic vaccine against human CD.UTM

Neuronal Degeneration in Mice Induced by an Epidemic Strain of Saint Louis Encephalitis Virus Isolated in Argentina

Saint Louis encephalitis virus (SLEV) is a neglected flavivirus that causes severe neurological disorders. The epidemic strain of SLEV, CbaAr-4005, isolated during an outbreak in Córdoba city (Argentina), causes meningitis and encephalitis associated with neurological symptoms in a murine experimental model. Here, we identified the affected brain areas and the damage triggered by this neurotropic arbovirus. We performed a detailed analysis of brain neurodegeneration associated with CbaAr-4005 SLEV infection in mice. The motor cortex, corpus striatum and cerebellum were the most affected structures. Neurodegeneration was also found in the olfactory bulb, thalamus, hypothalamus, hippocampus, and hindbrain. SLEV infection triggered brain cell apoptosis as well as somatodendritic and terminal degeneration. In addition, we observed massive excitotoxic-like degeneration in many cortical structures. Apoptosis was also detected in the neuroblastoma cell line N2a cultured with SLEV. The results evidenced that SLEV CbaAr-4005 infection induced severe degenerative alterations within the central nervous system of infected mice, providing new information about the targets of this flavivirus infection

CD8+ T Cell Immunity Is Compromised by Anti-CD20 Treatment and Rescued by Interleukin-17A

Monoclonal antibody targeting the CD20 antigen on B cells is used to treat the majority of non-Hodgkin lymphoma patients and some autoimmune disorders. This therapy generates adverse effects, notably opportunistic infections and activation of viruses from latency. Here, using the infection murine model with the intracellular parasite Trypanosoma cruzi, we report that anti-CD20 treatment affects not only B cell responses but also CD8+ T cell responses, representing the most important immune effectors involved in control of intracellular pathogens. Anti-CD20 treatment, directly or indirectly, affects cytotoxic T cell number and function, and this deficient response was rescued by the cytokine IL-17A. The identification of IL-17A as the cytokine capable of reversing the poor response of CD8+ T cells provides information about a potential therapeutic treatment aimed at enhancing defective immunity induced by B cell depletion.Treatment with anti-CD20, used in many diseases in which B cells play a pathogenic role, has been associated with susceptibility to intracellular infections. Here, we studied the effect of anti-CD20 injection on CD8+ T cell immunity using an experimental model of Trypanosoma cruzi infection, in which CD8+ T cells play a pivotal role. C57BL/6 mice were treated with anti-CD20 for B cell depletion prior to T. cruzi infection. Infected anti-CD20-treated mice exhibited a CD8+ T cell response with a conserved expansion phase followed by an early contraction, resulting in a strong reduction in total and parasite-specific CD8+ T cell numbers at 20 days postinfection. Anti-CD20 injection increased the frequency of apoptotic CD8+ T cells, decreased the number of effector and memory CD8+ T cells, and reduced the frequency of proliferating and cytokine-producing CD8+ T cells. Accordingly, infected anti-CD20-treated mice presented lower cytotoxicity of T. cruzi peptide-pulsed target cells in vivo. All of these alterations in CD8+ T cell immunity were associated with increased tissue parasitism. Anti-CD20 injection also dampened the CD8+ T cell response, when this had already been generated, indicating that B cells were involved in the maintenance rather than the induction of CD8+ T cell immunity. Anti-CD20 injection also resulted in a marked reduction in the frequency of interleukin-6 (IL-6)- and IL-17A-producing cells, and recombinant IL-17A (rIL-17A) injection partially restored the CD8+ T cell response in infected anti-CD20-treated mice. Thus, anti-CD20 reduced CD8+ T cell immunity, and IL-17A is a candidate for rescuing deficient responses either directly or indirectly

Classification of the Immune Composition in the Tumor Infiltrate.

Flow cytometry is one of the most suitable techniques for analyzing and classifying different cell suspensions derived from blood or others compartments. The characterization of all different cellular subtypes is made with different antibodies that detect surface or intracytoplasmic antigens. Here we describe the technique to thoroughly characterize immune cells from tumor infiltrates and proceed to isolation using single-cell sorting

Galectin-3 deficiency drives lupus-like disease by promoting spontaneous germinal centers formation via IFN-γ

Germinal center (GC) is where B cells interact with other immune cells for optimal induction of antibody responses. Here the authors show that galectin-3 regulates GC development by modulating interferon-γ and B cell-intrinsic signaling, such that galectin-3 deficiency mice exhibit lupus-like autoimmune symptoms

CD8 +

Monoclonal antibody targeting the CD20 antigen on B cells is used to treat the majority of non-Hodgkin lymphoma patients and some autoimmune disorders. This therapy generates adverse effects, notably opportunistic infections and activation of viruses from latency. Here, using the infection murine model with the intracellular parasite Trypanosoma cruzi, we report that anti-CD20 treatment affects not only B cell responses but also CD8+ T cell responses, representing the most important immune effectors involved in control of intracellular pathogens. Anti-CD20 treatment, directly or indirectly, affects cytotoxic T cell number and function, and this deficient response was rescued by the cytokine IL-17A. The identification of IL-17A as the cytokine capable of reversing the poor response of CD8+ T cells provides information about a potential therapeutic treatment aimed at enhancing defective immunity induced by B cell depletion.Treatment with anti-CD20, used in many diseases in which B cells play a pathogenic role, has been associated with susceptibility to intracellular infections. Here, we studied the effect of anti-CD20 injection on CD8+ T cell immunity using an experimental model of Trypanosoma cruzi infection, in which CD8+ T cells play a pivotal role. C57BL/6 mice were treated with anti-CD20 for B cell depletion prior to T. cruzi infection. Infected anti-CD20-treated mice exhibited a CD8+ T cell response with a conserved expansion phase followed by an early contraction, resulting in a strong reduction in total and parasite-specific CD8+ T cell numbers at 20 days postinfection. Anti-CD20 injection increased the frequency of apoptotic CD8+ T cells, decreased the number of effector and memory CD8+ T cells, and reduced the frequency of proliferating and cytokine-producing CD8+ T cells. Accordingly, infected anti-CD20-treated mice presented lower cytotoxicity of T. cruzi peptide-pulsed target cells in vivo. All of these alterations in CD8+ T cell immunity were associated with increased tissue parasitism. Anti-CD20 injection also dampened the CD8+ T cell response, when this had already been generated, indicating that B cells were involved in the maintenance rather than the induction of CD8+ T cell immunity. Anti-CD20 injection also resulted in a marked reduction in the frequency of interleukin-6 (IL-6)- and IL-17A-producing cells, and recombinant IL-17A (rIL-17A) injection partially restored the CD8+ T cell response in infected anti-CD20-treated mice. Thus, anti-CD20 reduced CD8+ T cell immunity, and IL-17A is a candidate for rescuing deficient responses either directly or indirectly