Distinct activation mechanisms of NF-κB regulator inhibitor of NF-κB Kinase (IKK) by isoforms of the Cell Death Regulator Cellular FLICE-like Inhibitory Protein (cFLIP)*

The vFLIP protein from Kaposis sarcoma-associated herpesvirus activates the NF-kB pathway by forming a stable complex with a central region (amino acids 150-272) of the IKKgamma subunit, thereby activating IKK. Cellular FLIP forms are also known to activate the NF-kB pathway via IKK activation. Here we demonstrate that cFLIPL, cFLIPS, and their proteolytic product p22-FLIP, all require the C-terminal region of NEMO/IKKgamma (amino acids 272-419) and its ubiquitin binding function for activation of the IKK kinase (or kinase complex), but none form a stable complex with IKKgamma. Our results further reveal that cFLIPL requires the linear ubiquitination complex LUBAC and the kinase TAK1 for activation of the IKK kinase. Similarly, cFLIPS and p22-FLIP also require TAK1 but do not require LUBAC. In contrast, these isoforms are both components of complexes that incorporate FADD and RIP1 which appear essential for kinase activation. This conservation of IKK activation among the cFLIP family using different mechanisms suggests that the mechanism plays a critical role in their function

Zelluläre Regulation von Leben und Tod durch Todeseffektordomänen (DED)-enthaltende Proteine: CAP3, c-FLIP R und p22-FLIP

Die Apoptose als programmierter Zelltod spielt eine bedeutende Rolle bei der Ontogenese und Homöostase von mehrzelligen Organismen. CD95 (Fas, APO-1) ist einer von acht bislang identifizierten Rezeptoren, die direkt Apoptose auslösen können und als Todesrezeptoren (engl.: death receptor, DR) bezeichnet werden. CD95-vermittelte Apoptose ist von entscheidender Bedeutung für die Homöostase des Immunsystems. Fehlregulationen im CD95-System tragen außerdem zur Entstehung von Krankheiten wie Autoimmunität, Krebs oder AIDS bei. Bei der initialen Regulation Todesrezeptor-vermittelter Apoptose spielen vor allem Proteine eine Rolle, die sich durch das Vorhandensein von Todeseffektordomänen (DEDs) auszeichnen. Es sind sowohl pro-apoptotische als auch anti-apoptotische DED-enthaltende Proteine bekannt. Zu den pro-apoptotischen DED-enthaltenden Proteinen gehören u.a. Procaspase-8 und -10, während die c-FLIPs (engl.: cellular FLICE inhibitory proteins) zu den wichtigsten anti-apoptotischen DED-enthaltenen Proteinen gehören. Das CD95-vermittelte Todessignal wird nach Aktivierung des Rezeptors durch Anlagerung von cytosolischen Signalmolekülen mit DED-Domänen übertragen. Durch Bindung des CD95-Liganden wird CD95 oligomerisiert, und es bildet sich ein Tod-induzierender Signalkomplex (engl.: death-inducing signaling complex, DISC). In den CD95-DISC werden sowohl die pro-apoptotischen DED-Proteine wie Procaspase-8 als auch die anti-apoptotischen DED-Proteine wie c-FLIPs rekrutiert und abhängig von ihrem Mengenverhältnis zueinander wird der Prozess der Apoptose initiiert oder blockiert. Nicht nur in CD95-vermittelter Apoptose spielen DED-enthaltende Proteine eine Rolle. Es spricht immer mehr dafür, dass DED-Proteine zusätzliche Funktionen bei der Kontrolle zellulärer Aktivierung sowie Proliferation innehaben. Somit charakterisiert die DED-Domäne eine Familie von Proteinen, die wichtig für die Regulation zellulärer Homöostase sind und Proliferation und Apoptose zugleich regulieren können. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das bislang nicht identifizierte DED-enthaltende Protein CAP3 (engl.: cytotoxicity-dependent APO-1 associated protein 3) während der Prozessierung von Procaspase-8 im DISC gebildet wird. Dabei scheint Procaspase-8-Aktivität eine wichtige Rolle zu spielen. Wenn Procaspase-8 zur aktiven Caspase-8 prozessiert wird, findet eine Weiterspaltung von CAP3 in die bekannte Prodomäne von Procaspase-8 statt. Damit wurden neue Erkenntnisse zum entscheidenden Prozess der Aktivierung von Procaspase-8 und damit zu initialen Ereignissen bei der Induktion Todesrezeptor-vermittelter Apoptose gewonnen. Zudem wurde nach weiteren DED-enthaltenden Regulatoren zellulärer Homöostase gesucht und dabei zwei neue c-FLIP-Proteine gefunden: c-FLIPR und p22-FLIP. C-FLIPR wurde als eine neue kurze c-FLIP-Spleißvariante identifiziert, während p22-FLIP ein bisher unbekanntes Spaltprodukt von c-FLIP darstellt. C-FLIPR ist in verschiedenen T- und B-Zelllinien sowie in primären humanen T-Zellen vorhanden. Es enthält ebenso wie die bekannte Spleißvariante c-FLIPS Tandem-DEDs als N-Terminus und einen kurzen C-Terminus. C-FLIPR kann an den CD95-DISC rekrutiert werden und zeigt inhibitorische Funktion bezüglich Todesrezeptor-induzierter Apoptose. Wie c-FLIPS zeichnet es sich durch eine kurze Halbwertszeit und ein ähnliches Expressionsprofil nach Aktivierung und T-Zell-Rezeptor-Restimulation in primären humanen T-Zellen aus. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein weiteres c-FLIP-Protein entdeckt, p22-FLIP. Nach der Identifizierung von p22-FLIP als Spaltprodukt und N-Terminus von c-FLIP-Proteinen wurde p22-FLIP in funktioneller wie mechanistischer Weise charakterisiert. Dabei wurde gezeigt, dass p22-FLIP durch die Aktivität von Procaspase-8 im Cytosol unter nicht-apoptotischen Bedingungen geschnitten wird. Außerdem wurde gezeigt, dass p22-FLIP eine inhibitorische Funktion bei Todesrezeptor-vermittelter Apoptose innehat und gleichzeitig sehr effizient die Aktivität des nukleären Faktors B (NFB) und damit Überlebens-Signalleitung induzieren kann. Damit konnte p22-FLIP als ein wichtiger Parameter für zelluläre Homöostase identifiziert werden, der ähnlich wie virale FLIPs wichtige Prozesse wie Proliferation und Apoptose regulieren kann. Die Fehlregulation von Proliferation und Apoptose ist wahrscheinlich eine entscheidende Voraussetzung für Tumorentstehung und -progression

In Situ Oberflächenröntgenbeugungsuntersuchungen an der Kupfer-Elektrolyt-Grenzschicht: Atomare Strukture und Homoepitaktisches Wachstum

Copper electrodeposition is the predominantly used technique for on-chip wiring in the fabrication of ultra-large scale integrated (ULSI) microchips. In this `damascene copper electroplating’ process, multicomponent electrolytes containing organic additives realize void-free filling of trenches with high aspect ratio (`superconformal deposition’). Despite manifold studies, motivated by the continuous trend to shrink wiring dimensions and thus the demand of optimized plating baths, detailed knowledge on the growth mechanism - in presence and absence of additives - is still lacking. Using a recently developed hanging meniscus x-ray transmission cell, brilliant synchrotron x-rays and a fast, one-dimensional detector system, unique real-time in situ surface x-ray diffraction studies of copper electrodeposition were performed under realistic reaction conditions, approaching rates of technological relevance. Preparatory measurements of the electrochemical dissolution of Au(001) in chloride-containing electrolyte demonstrated the capability of this powerful technique, specifically the possibility to follow atomic-scale deposition or dissolution processes with a time resolution down to five milliseconds. The electrochemical as well as structural characterization of the Cu(001)- and Cu(111)-electrolyte interfaces provided detailed insight into the complex atomic-scale structures in presence of specifically adsorbed chloride on these surfaces. The interface of Cu(001) in chloride-containing electrolyte exhibits a continuous surface phase transition of a disordered Cl adlayer to a c(2×2) Cl adlayer with increasing potential. The latter was found to induce a small vertical corrugation of substrate atoms, which can be ascribed to lattice relaxations induced by the presence of coadsorbed water molecules and cations in the outer part of the electrochemical double layer. The study of the specific adsorption of chloride on Cu(111) from acidic aqueous electrolyte revealed a hexagonal, rotated adlayer structure, which was not reported before for this system. In comparison to other halide-metal(111) systems, the potential dependence of this structure suggests a strong adsorbate-adsorbate interaction. Operating under diffusion-limited conditions, i.e., at constant deposition rate, homoepitaxial growth of the Cu(001) single crystal electrode in chloride-containing solution has been investigated in situ for 1 and 5 mM Cu ion concentrations as a function of deposition overpotential. Detailed insight into the complex relationship between the atomic-scale structure of the solid-liquid interface, the growth behavior, and the resulting surface morphology was gained, revealing a pronounced mutual interaction of the Cu growth process and the Cl adlayer order. Depending on the latter, transitions from step-flow to layer-by-layer to 3D growth are observed, attributed to a reduction in the Cu surface mobility with increasing order. The kinetics of the c(2×2) adlayer ordering, in turn, are strongly affected during Cu deposition as compared to results obtained in Cu-free solution. Moreover, an oscillatory average strain in the surface layer is observed during layer-by-layer growth, indicating an expansion of the topmost layer occurring periodically for fractional coverages. Addition of polyethylene glycol (PEG), a commonly used inhibitor in the industrial damascene process, considerably changes the growth conditions. The chloride ordering kinetics are influenced such that the c(2×2) covered phase is stabilized in a widened potential regime. The onset of the transition to 3D growth is observed at more negative potentials, limiting the occurrence of layering oscillations to a narrower potential regime. Compared to the PEG-free electrolyte, the deposition rate is notably slowed down by a factor of approximately 3. The present study reports new direct experimental observations of the growth mechanisms at electrochemical interfaces on the atomic-scale.Die elektrochemische Abscheidung von Kupfer ist die vorherrschende Methode zur Herstellung von Leiterbahnen in integrierten Schaltungen moderner Mikrochips. Im sog. Damaszener-Verfahren wird durch Elektrolyte, die diverse organische Additive enthalten, das lückenlose Füllen von Gräben mit hohen Aspektverhältnissen realisiert. Trotz vieler Studien, - motiviert durch die Notwendigkeit Abscheidebäder zu optimieren -, fehlen detaillierte Einblicke in den Wachstumsmechanismus, sowohl mit als auch ohne beigefügte Additive. Durch Verwendung einer neuartigen elektrochemischen Röntgentransmissionszelle, brillianter Synchrotronstrahlung und eines schnellen 1D-Detektorsystems wurden einzigartige Studien der Elektrodeposition unter realistischen, sich technologischen Verhältnissen annähernden Reaktionsbedingungen mittels oberflächensensitiver Röntgenbeugung möglich. Vorbereitende Messungen der elektrochemischen Auflösung von Au(001) in chlorhaltigem Elektrolyt demonstrierten das Potential dieser leistungsstarken Technik, speziell die Möglichkeit, Abscheide- und Auflöseprozesse auf atomarer Skala mit einer Zeitauflösung von bis zu fünf Millisekunden zu verfolgen. Die elektrochemische und strukturelle Charakterisierung von Cu(001)- und Cu(111)-Elektrolyt-Grenzflächen ermöglichte einen detaillierten Einblick in die komplexe atomare Struktur in Gegenwart von spezifisch adsorbiertem Chlor auf diesen Oberflächen. Die Cu(001) Grenzschicht in 10 mM HCl weist mit ansteigendem Potential einen kontinuierlichen Phasenübergang von einer ungeordneten zu einer geordneten c(2×2) Cl Adschicht auf. Dabei verursacht letztere eine vertikale Welligkeit (Relaxation) der Substratoberfläche, induziert durch Anlagerung von Wassermolekülen und Kationen in der äußeren Doppelschicht. Die Untersuchung der Adsorption von Chlor auf Cu(111) in saurem Elektrolyt zeigte eine bisher unbekannte hexagonale, rotierte Adschichtstruktur. Im Vergleich mit anderen Halogen-Metall(111)-Systemen lässt die Potentialabhängigkeit dieser Struktur auf eine starke Adsorbat-Adsorbat-Wechselwirkung schließen. Das homoepitaktische Wachstum von Cu(001)-Einkristallelektroden wurde in Cl-haltigem Elektrolyt unter diffusionslimitierten Bedingungen für 1 und 5 mM Cu Ionenkonzentration als Funktion des Abscheidepotentials untersucht. Dabei wurden detaillierte Einblicke in den komplexen Zusammenhang von atomarer Struktur der Fest-Flüssig-Grenzfläche, Wachstumsverhalten und der daraus resultierenden Oberflächenmorphologie gewonnen. Eine starke Wechselwirkung zwischen Wachstumsprozess und der Cl Adschicht wurde beobachtet. Zum einen werden abhängig vom Cl Ordnungsgrad Übergänge von Stufenfluss- zu lagenweisem zu 3D-Wachstum induziert, die mit einer Abnahme der Cu Adatommobilität mit zunehmender Ordnung erklärt wird. Zum anderen ist die c(2×2) Ordnungskinetik im Vergleich zu Beobachtungen in Cu-freien Elektrolyten während des Wachstums stark beeinflusst. Während des lagenweisen Wachstums wurde darüber hinaus eine bedeckungsabhängige periodische Verspannung der Oberfläche beobachtet, die zu einer Expansion der obersten abgeschiedenen Schicht führt. Durch Zugabe von Polyethylenglykol (PEG), eines in der Industrie häufig verwendeten Inhibitors, werden die Wachstumsbedingungen stark verändert. Die Cl-Umordnungskinetik ist beeinflusst, sodass die c(2×2) bedeckte Phase in einem erweiterten Potentialbereich stabilisiert wird. Der Übergang zum 3D-Multilagen-Wachstum ist zu negativen Potentialen verschoben und das Auftreten von Wachstumsoszillationen auf einen engeren Potentialbereich limitiert. Im Vergleich zum PEG-freien Elektrolyt ist die Abscheiderate auf ca. 30% verlangsamt

The endogenous caspase-8 inhibitor c-FLIPL regulates ER morphology and crosstalk with mitochondria

Components of the death receptors-mediated pathways like caspase-8 have been identified in complexes at intracellular membranes to spatially restrict the processing of local targets. In this study, we report that the long isoform of the cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIPL), a well- known inhibitor of the extrinsic cell death initiator caspase-8, localizes at the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondria-associated membranes (MAMs). ER morphology was disrupted and ER Ca2+-release as well as ER-mitochondria tethering were decreased in c-FLIP-/- mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Mechanistically, c-FLIP ablation resulted in enhanced basal caspase-8 activation and in caspase-mediated processing of the ER-shaping protein reticulon-4 (RTN4) that was corrected by re-introduction of c-FLIPL and caspase inhibition, resulting in the recovery of a normal ER morphology and ER-mitochondria juxtaposition. Thus, the caspase-8 inhibitor c-FLIPL emerges as a component of the MAMs signaling platforms, where caspases appear to regulate ER morphology and ER-mitochondria crosstalk by impinging on ER-shaping proteins like the RTN4

Glucose and glutamine fuel protein O-GlcNAcylation to control T cell self-renewal and malignancy

Sustained glucose and glutamine transport are essential for activated T lymphocytes to support ATP and macromolecule biosynthesis. We now show that glutamine and glucose also fuel an indispensible dynamic regulation of intracellular protein O-GlcNAcylation at key stages of T cell development, transformation and differentiation. Glucose and glutamine are precursors of UDP-GlcNAc, a substrate for cellular glycosyltransferases. Immune activated T cells contained higher concentrations of UDP-GlcNAc and increased intracellular protein O-GlcNAcylation controlled by the enzyme O-GlcNAc glycosyltransferase as compared to naïve cells. We identified Notch, the T cell antigen receptor and c-Myc as key controllers of T cell protein O-GlcNAcylation, via regulation of glucose and glutamine transport. Loss of O-GlcNAc transferase blocked T cell progenitor renewal, malignant transformation, and peripheral T cell clonal expansion. Nutrient-dependent signaling pathways regulated by O-GlcNAc glycosyltransferase are thus fundamental for T cell biology

Nutrient sensing, signal transduction and immune responses

Most cells in the body have a constant supply of nutrients, which are required to sustain cellular metabolism and functions. In contrast, cells of the immune system can encounter conditions with a limited nutrient supply during the course of an immune response. Cells of the immune system frequently operate in complex nutrient restricted microenvironments such as tumour or inflammatory sites. The concentrations of key nutrients such as glucose and certain amino acids, can be low at these sites, and this can have an impact upon immune cell function. Nutrient sufficiency is important to supply the metabolic and biosynthetic pathways of immune cells. In addition nutrients can also act as important cues that influence immunological signalling pathways to affect the function of immune cells. This review will describe the various nutrient sensing signalling pathways and discuss the evidence that nutrients are critical signals that shape immune responses.</p

Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL

A systems biology–based approach shows that life and death decisions for cells depend on the stoichiometry of c-FLIP isoforms

Caspase-8 activity has an essential role in CD95/Fas-mediated MAPK activation

Stimulation of CD95/Fas/APO-1 results in the induction of both apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. The processes regulating these two opposing pathways have not been thoroughly elucidated to date. In this study, using quantitative immunoblots, imaging, and mathematical modeling, we addressed the dynamics of the DED proteins of the death-inducing signaling complex (DISC), procaspase-8, and cellular FLICE inhibitory proteins (c-FLIPs) to the onset of CD95-mediated ERK1/2 and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. We found that CD95 DISC-induced caspase-8 activity is important for the initiation of ERK1/2 and p38 MAPK activation. The long c-FLIP isoform, c-FLIPL, and the short c-FLIP isoform, c-FLIPR, inhibited MAPK induction by blocking caspase-8 processing at the DISC. Furthermore, we built a mathematical model describing CD95 DISC-mediated MAPK activation and apoptosis. The model quantitatively defined the dynamics of DED proteins, procaspase-8, and c-FLIP, which lead to caspase-8 activation and induction of apoptotic and non-apoptotic signaling pathways. In conclusion, the combination of biochemical analysis with mathematical modeling provides evidence for an important role of caspase-8 in CD95-mediated activation of MAPKs, while c-FLIP exerts a regulatory function in this process

Infected Cell Killing by HIV-1 Protease Promotes NF-κB Dependent HIV-1 Replication

Acute HIV-1 infection of CD4 T cells often results in apoptotic death of infected cells, yet it is unclear what evolutionary advantage this offers to HIV-1. Given the independent observations that acute T cell HIV-1 infection results in (1) NF-κB activation, (2) caspase 8 dependent apoptosis, and that (3) caspase 8 directly activates NF-κB, we questioned whether these three events might be interrelated. We first show that HIV-1 infected T cell apoptosis, NF-κB activation, and caspase 8 cleavage by HIV-1 protease are coincident. Next we show that HIV-1 protease not only cleaves procaspase 8, producing Casp8p41, but also independently stimulates NF-κB activity. Finally, we demonstrate that the HIV protease cleavage of caspase 8 is necessary for optimal NF-κB activation and that the HIV-1 protease specific cleavage fragment Casp8p41 is sufficient to stimulate HIV-1 replication through NF-κB dependent HIV-LTR activation both in vitro as well as in cells from HIV infected donors. Consequently, the molecular events which promote death of HIV-1 infected T cells function dually to promote HIV-1 replication, thereby favoring the propagation and survival of HIV-1

The role of c-FLIP splice variants in urothelial tumours

Deregulation of apoptosis is common in cancer and is often caused by overexpression of anti-apoptotic proteins in tumour cells. One important regulator of apoptosis is the cellular FLICE-inhibitory protein (c-FLIP), which is overexpressed, for example, in melanoma and Hodgkin's lymphoma cells. Here, we addressed the question whether deregulated c-FLIP expression in urothelial carcinoma impinges on the ability of death ligands to induce apoptosis. In particular, we investigated the role of the c-FLIP splice variants c-FLIPlong (c-FLIPL) and c-FLIPshort (c-FLIPS), which can have opposing functions. We observed diminished expression of the c-FLIPL isoform in urothelial carcinoma tissues as well as in established carcinoma cell lines compared with normal urothelial tissues and cells, whereas c-FLIPS was unchanged. Overexpression and RNA interference studies in urothelial cell lines nevertheless demonstrated that c-FLIP remained a crucial factor conferring resistance towards induction of apoptosis by death ligands CD95L and TRAIL. Isoform-specific RNA interference showed c-FLIPL to be of particular importance. Thus, urothelial carcinoma cells appear to fine-tune c-FLIP expression to a level sufficient for protection against activation of apoptosis by the extrinsic pathway. Therefore, targeting c-FLIP, and especially the c-FLIPL isoform, may facilitate apoptosis-based therapies of bladder cancer in otherwise resistant tumours