Detektion des Kartoffelspindelknollen Viroids mit Hilfe der Loop Mediated Isothermal Amplification

PSTV ist ein hoch infektiöses Viroid, das in Kartoffeln verkleinerte und spindelähnliche Knollen verursacht. Um Ernteverlusten vorzubeugen, ist eine Detektion in frühen Infektionsstadien von großer Bedeutung. Aufgrund ihrer hohen Sensitivität und Spezifität wird die PCR als Standardnachweisverfahren für PSTV verwendet. Nachteilig an dieser Methode sind der apparative Aufwand und die zeitaufwändige Durchführung. Als viel versprechende Alternative konnte der Nachweis von PSTV mit Hilfe der Reverse Transcription Loop Mediated Isothermal Amplification (RT-LAMP) gezeigt werden. Hierbei handelt es sich um eine einfache und schnelle Methode, für die wenig aufwändige Laborausrüstung benötigt wird. Dabei ermöglichte eine an den Amplifikationsprozess gekoppelte Fluoreszenzreaktion die Detektion von Produkten direkt nach der Nachweisreaktion mit dem bloßen Auge (bzw. unter UV-Licht). Die Ergebnisse konnten mit Hilfe einer Real Time Detektion des auftretenden Fluoreszenzsignals bestätigt werden.PSTV is a highly infectious viroid which leads to small and spindle shaped tubers in potatoes. The detection at an early stage of infection is important to minimize loss of harvest. Normally PCR is used for the detection of PSTV, because of its high sensitivity and specificity. Disadvantages of this method are the requirement of sophisticated equipment and the time consuming process. As a promising alternative, the detection of PSTV with the reverse transcription loop mediated isothermal amplification (RT-LAMP) was shown. LAMP is a very fast and simple detection method requiring only standard laboratory equipment. A fluorescence reaction, coupled to the amplification process, allowed the detection of amplification products directly after the reaction with the naked eye (or under UV light, respectively). Real time detection of the occurring fluorescence signal was possible and confirmed the obtained results

Variable Turnierpreise in Forced-Distribution-Systemen: Eine theoretische und empirische Analyse der Effekte auf die Zusammenarbeit in Teams

Forced-Distribution-Systeme (FDS) sind eine spezielle Form der Leistungsbeurteilung, bei de-nen Personalbeurteiler an eine vorgegebene Verteilung gebunden sind. Diese sind in der Literatur sowie in der betrieblichen Praxis nicht unumstritten. Als zentraler Nachteil wird insbesondere angeführt, dass aufgrund der durch FDS induzierten künstlichen Verknappung guter Beurteilungen die Zusammenarbeit unter den Mitarbeitern leide bzw. letztere zu Sabotageaktivitäten ange-reizt werden könnten. Die Dissertation befasst sich mit der Frage, ob diese adversen Effekte nur mit fixen oder aber auch mit variablen Turnierpreisen verbunden sind. Bei fixen Turnierpreisen stehen die mit einer bestimmten Leistungsbeurteilung verbundenen Prämien im Voraus fest. Bei variablen Turnierpreisen ist entweder die Anzahl der in eine Leistungskategorie einzugruppierenden Mitarbeiter variabel oder die Höhe der mit einer Leistungskategorie verbundenen Prämie ist variabel (jeweils in Abhängigkeit vom erzielten Gesamtoutput). Anhand einer eigens erhobenen Befragungsstudie wird im ersten Teil der Arbeit der Frage nachgegangen, ob und inwiefern von (Fixpreis-)FDS in der Praxis Sabotageanreize ausgehen. Im zweiten Teil wird modelltheoretisch untersucht, welche Effekte hinsichtlich der Sabotageneigung von FDS mit variablen Preisen im Vergleich zu Fixpreis-FDS ausgehen. Der dritte Teil präsentiert die Ergebnisse eines selbst durchgeführten Laborexperiments, in dem die Effekte eines Fixpreis-FDS mit denen eines FDS mit variablen Preishöhen verglichen werden. Es zeigt sich, dass FDS mit fixen Turnierpreisen in der Tat zu adversen Effekten führen. Variable Turnierpreise sind auf Basis der modelltheoretischen und empirischen Befunde jedoch in der Lage, Sabotageaktivitäten wirksam zu reduzieren, bzw. die Zusammenarbeit zu fördern

Variable prizes in forced-distribution-systems: a sabotage-reducing approach?

Forced-Distribution-Systems (FDS) have many indisputable benefits (such as identification of high potential and low performers or incentive effects to exert higher efforts). However, many companies take a critical stance toward FDS, one of the main reasons being the agents' incentive to execute sabotage activities. While a large number of tournament studies deal with the problem of sabotage, to be best of my knowledge none of the studies investigates the impact of variable tournament prizes on sabotage activities. Variable prizes are a special tournament design where prizes are not fixed in advance, but are a function of a target variable set by the principal (see Güth et al. 2010). In this study, I theoretically analyze if variable tournament prizes can help in reducing sabotage activities in FDS. Two versions of variable prizes are considered for this study: variable prize levels and variable prize distribu- tions. In the former version, prize levels depend on the cumulative output (higher the output, higher the prize levels), and in the latter version, prize distribution depends on the cumulative output (higher the output, higher the portion of prizes for the winner and lower the portion of prizes for the loser). The findings of the model are as follows: Variable tournament prizes not only reduce sabotage activities effectively, but also incentivize agents to exert helping activities. Accordingly, variable tournament prizes could be of high importance in organizational practice

Identifizierung und Charakterisierung von Metallchelat-bindenden Peptiden mittels Phage-Display

Rekombinante Proteine können verändert werden um Metallionen zu binden. Dieses Prinzip wird zur Aufreinigung mittels immobilisierter Metallchelat Chromatographie (IMAC) verwendet. Eine Fusion mit einer kurzen Sequenz von 6 Histidinresten zur Bindung von Übergangsmetallionen wie Cu2+, Ni2+, Co2+ and Zn2+ bewirkt dies. Eine Phagen-Bibliothek mit einer 15-mer Zufallssequenz wurde verwendet, um Peptide mit Affinität zu Übergangsmetallionen sowie harten Lewissäuren wie Fe3+ and Al3+ zu selektieren. Verschiedene Metallchelate sowie Stringenzen wurden bei der Selektion verwendet. Vier Selektionsrunden reichten zur Anreicherung für Metallchelat spezifischer Phagenpopulationen aus. Übergangsmetall bindende Peptide mit der größten Affinität hatten 4 Histidinreste, flankiert von hydrophoben Aminosäuren und Prolin. Die Spezifität für den Chelatbildner korrelierte mit der relativen Position des Bindungsmotifs im Peptid sowie der Hydrophobizität.Recombinant proteins can be engineered for affinity to metal ions. This principle is exploited for the purification by immobilised affinity chromatography (IMAC). Fusion of a short sequence of 6 histidine residues to a protein is sufficient for binding to transition metal ions like Cu2+, Ni2+, Co2+ and Zn2+. A phage-displayed random 15-mer library was used to select peptides binding to transition metal ions as well as to hard lewis acids such as Fe3+ and Al3+. Different formats for the immobilisation of metal ions and stringency of selection were employed. Four rounds of panning were sufficient to enrich a phage population with specific binding to the given metal chelates. Peptides binding to transition metals with highest affinity contained 4 consecutive histidine residues, flanked with hydrophobic amino acids and proline. Specificity for the chelating support material correlated with relative position of the binding motif in the sequence and hydrophobicity. As an example, a helper phage carrying a transition metal binding peptide was constructed and shown to purify by IMAC. Panning on Fe3+ yielded positively charged peptides. The best binder contained 4 lysine and two histidine residues and was shown to bind to Ni2+ in absence of imidazole. Binding to Fe3+- IDA complexes could be efficiently competed with either primary amines, phosphate or pH 8 and higher. This bispecific peptide may serve for a cascade purification on Ni2+ and Fe3+ columns, yielding higher homogeneity. Furthermore, affinity purification with iron abrogates the tedious removal of contaminating toxic heavy metal ions in traditional IMAC

Bacterial protein microarrays for identification of new potential diagnostic markers for Neisseria meningitidis infections

Neisseria meningitidis is the most common cause of meningitis and causes epidemic outbreaks. One trait of N. meningitidis, which is associated with most of the currently recognized virulence determinants, is the presence of phase-variable genes that are suspected to enhance its ability to cause an invasive disease. To detect the immune responses to phase-variable expressed proteins, we applied protein microarray technology for the screening of meningitis patient sera. We amplified all 102 known phase-variable genes from N. meningitidis serogroup B strain MC58 by polymerase chain reaction and subcloned them for expression in Escherichia coli. With this approach, we were able to express and purify 67 recombinant proteins representing 66% of the annotated genes. These were spotted robotically onto coated glass slides to generate protein microarrays, which were screened using 20 sera of patients suffering from meningitis, as well as healthy controls. From these screening experiments, 47 proteins emerged as immunogenic, exhibiting a variable degree of seroreactivity with some of the patient sera. Nine proteins elicited an immune response in more than three patients, with one of them, the phase-variable opacity protein OpaV (NMB0442), showing responses in 11 patient sera. This is the first time that protein microarray technology has been applied for the investigation of genetic phase variation in pathogens. The identification of disease-specific proteins is a significant target in biomedical research, as such proteins may have medical, diagnostic, and commercial potential as disease markers

Nachhaltigkeit im industriellen Umfeld

Im Rahmen der Lehrveranstaltung "Nachhaltigkeit im industriellen Umfeld" im Masterstudiengang Umwelt- und Verfahrenstechnik der Hochschulen Konstanz und Ravensburg-Weingarten wurde 2015 eine studentische Fachkonferenz durchgeführt. Die Studierenden entwickelten in Einzelarbeit oder als Zweierteam Konferenzbeiträge zu folgenden Themen: - Innovationen und Spannendes aus dem Bereich der Energieerzeugung und -wandlung - Aspekte der Schließung von Stoffkreisläufen und Vermeidung von Schadstoffeinträgen in die Umwelt - Chancen und Herausforderungen Nachwachsender Rohstoffe bei verschiedenen Einsatzmöglichkeiten sowie Themen der Nachhaltigkeit in der Landwirtschaft - verschiedene Blickwinkel auf das Thema Wasser (von der Abwasserreinigung bis zum Wasserkonsum der Konsumenten) - die Betrachtung spezifischer Industrien und Unternehmen sowie deren Werkzeuge zur Umsetzung von Nachhaltigkeit Die Ergebnisse der studentischen Fachkonferenz zur „Nachhaltigkeit im industriellen Umfeld“ werden in der vorliegenden Publikation präsentiert

Directed evolution of nucleotide-based libraries using lambda exonuclease

Directed evolution of nucleotide libraries using recombination or mutagenesis is an important technique for customizing catalytic or biophysical traits of proteins. Conventional directed evolution methods, however, suffer from cumbersome digestion and ligation steps. Here, we describe a simple method to increase nucleotide diversity using single-stranded DNA (ssDNA) as a starting template. An initial PCR amplification using phosphorylated primers with overlapping regions followed by treatment with lambda exonuclease generates ssDNA templates that can then be annealed via the overlap regions. Double-stranded DNA (dsDNA) is then generated through extension with Klenow fragment. To demonstrate the applicability of this methodology for directed evolution of nucleotide libraries, we generated both gene shuffled and regional mutagenesis synthetic antibody libraries with titers of 2x108 and 6x107, respectively. We conclude that our method is an efficient and convenient approach to generate diversity in nucleic acid based libraries, especially recombinant antibody libraries

Subnanoliter enzymatic assays on microarrays

Many areas of research today are based on enzymatic assays most of which are still performed as enzyme-linked immunosorbent assays in microtiter plates. The demand for highly parallel screening of thousands of samples eventually led to a miniaturization and automation of these assays. However, the final transfer of enzymatic assays from a microtiter-based technology to microarrays has proven to be difficult for various reasons, such as the inability to maintain unbound reaction products on the spot of reaction or the missing capability of multiplexing. Here, we have conducted multiplex enzymatic assays in subnanoliter volumes on a single microarray using the multiple spotting technology. We were able to measure enzymatic activity with a sensitivity down to 35 enzyme molecules, applying only conventional flat microarray surfaces and standard microarray hardware. We have performed assays of inhibition and applied this format for the detection of prognostic markers, such as cathepsin D. The new approach allows the rapid and multiplex screening of thousands of samples on a single microarray with applications in drug screening, metagenomics, and high-throughput enzyme assays

Probing the SELEX Process with Next-Generation Sequencing

Background SELEX is an iterative process in which highly diverse synthetic nucleic acid libraries are selected over many rounds to finally identify aptamers with desired properties. However, little is understood as how binders are enriched during the selection course. Next-generation sequencing offers the opportunity to open the black box and observe a large part of the population dynamics during the selection process. Methodology We have performed a semi-automated SELEX procedure on the model target streptavidin starting with a synthetic DNA oligonucleotide library and compared results obtained by the conventional analysis via cloning and Sanger sequencing with next-generation sequencing. In order to follow the population dynamics during the selection, pools from all selection rounds were barcoded and sequenced in parallel. Conclusions High affinity aptamers can be readily identified simply by copy number enrichment in the first selection rounds. Based on our results, we suggest a new selection scheme that avoids a high number of iterative selection rounds while reducing time, PCR bias, and artifacts