8 research outputs found
Affinity maturation by targeted diversification of the CDR-H2 loop of a monoclonal Fab derived from a synthetic naïve human antibody library and directed against the internal trimeric coiled-coil of gp41 yields a set of Fabs with improved HIV-1 neutralization potency and breadth
AbstractPreviously we reported a broadly HIV-1 neutralizing mini-antibody (Fab 3674) of modest potency that was derived from a human non-immune phage library by panning against the chimeric gp41-derived construct NCCG-gp41. This construct presents the N-heptad repeat of the gp41 ectodomain as a stable, helical, disulfide-linked trimer that extends in helical phase from the six-helix bundle of gp41. In this paper, Fab 3674 was subjected to affinity maturation against the NCCG-gp41 antigen by targeted diversification of the CDR-H2 loop to generate a panel of Fabs with diverse neutralization activity. Three affinity-matured Fabs selected for further study, Fabs 8060, 8066 and 8068, showed significant increases in both potency and breadth of neutralization against HIV-1 pseudotyped with envelopes of primary isolates from the standard subtype B and C HIV-1 reference panels. The parental Fab 3674 is 10–20-fold less potent in monovalent than bivalent format over the entire B and C panels of HIV-1 pseudotypes. Of note is that the improved neutralization activity of the affinity-matured Fabs relative to the parental Fab 3674 was, on average, significantly greater for the Fabs in monovalent than bivalent format. This suggests that the increased avidity of the Fabs for the target antigen in bivalent format can be partially offset by kinetic and/or steric advantages afforded by the smaller monovalent Fabs. Indeed, the best affinity-matured Fab (8066) in monovalent format (∼50 kDa) was comparable in HIV-1 neutralization potency to the parental Fab 3674 in bivalent format (∼120 kDa) across the subtype B and C reference panels
Recombinant Anti-Idiotypic Antibodies for Antibody Drug Development
<p>Antibody drug development projects require tools for monitoring the concentration of these drug candidates in patient samples and standards for measuring anti-drug antibodies (ADA). We have used the HuCAL® recombinant antibody technology for fast development of fully human Fab and IgG anti-idiotypic (anti-ID) antibodies binding specifically and with high affinity to well-known drugs like Herceptin®, Avastin®, Rituxan®, Remicade®, Humira® and others.</p>
<p>The HuCAL phage display approach allows for the generation of inhibitory and non-inhibitory anti-idiotypic antibodies as well as development of antibodies against drug-target complexes. These reagents are used as fully human reference standards in ADA assays and for the development of PK assays for analysis of non-clinical and clinical samples.</p
Selection of high-affinity RNAs for the Alzheimer´s beta-amyloid
Titel, Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
> 1.1 Morbus Alzheimer
>
> 1.2 RNA
>
> 1.3 In vitro-Selektion
>
> 1.4 Stabilisierung von RNA
>
> 1.5 Vergleich von Aptameren und Antikörpern
2 Aufgabenstellung
3 Methoden
> 3.1 Chemische Nukleinsäuresynthese
> 3.2 Aufreinigung von Nukleinsäuren
> 3.3 Molekularbiologische Methoden
> 3.4 Vorbereitung der Affinitätschromatographie
> 3.5 Mikrobiologische Methoden
> 3.6 Charakterisierung der Aptamere
4 Ergebnisse
> 4.1 Immobilisierung der Peptide
>
> 4.2 In vitro-Selektion
>
> 4.3 Charakterisierung der Aptamere
5 Diskussion
6 Zusammenfassung
7 Summary
8 Literaturverzeichnis
Anhang
> A Geräte, Enzyme und Chemikalien
>
> B Puffer und Medien
>
> C Lebenslauf
>
> D Eigene PublikationenDie Ursache der Alzheimer-Krankheit ist immer noch unbekannt, jedoch ist sie
nach dem derzeitigen Kenntnisstand eng verknüpft mit der Ablagerung des
Amyloid-Peptids im Gehirn der Patienten. Daher spielt das Amyloid bei der
Suche nach Medikamenten und Diagnostika eine entscheidende Rolle. Durch
Einsatz der RNA-Technologien sollte mit dieser Arbeit ein Hilfsmittel für die
weitere Untersuchung der Alzheimer-Krankheit zur Verfügung gestellt werden.
Die in vitro-Selektion erlaubt das Design von spezifischen Nukleinsäuren gegen
fast jedes Zielmolekül. Damit ist zu den Antikörpern eine neue Stoffklasse
getreten, mit der man einige Probleme der Antikörper umgehen kann. Vor allem
die chemische Synthese der Nukleinsäuren erlaubt eine maßgeschneiderte
Modifizierung wie z. B. den Einbau von Reportermolekülen, wodurch sie sich
hervorragend eignen für analytische und diagnostische Aufgaben. Da eine
Veränderung des Amyloid-Gehalts im Blut von Alzheimer-Patienten beschrieben
wurde, wäre ein Einsatz von Aptameren für eine Diagnose denkbar. Weiterhin
wurden bereits Antikörper vorgestellt, die eine Aggregation des Amyloids zu
den senilen Plaques verhindern kann. Auch hier wäre ein Einsatz von Aptameren
vorstellbar.
Mit Hilfe der Methode der in vitro-Selektion wurde aus einer kombinatorischen
RNA-Bibliothek mit ca. 1015 unterschiedlichen Molekülen hochaffine RNA-
Aptamere gegen das Amyloid b A4(1-40) und ein Fragment b A4(1-16) isoliert.
Dazu wurde eine DNA-Bibliothek mit 70 randomisierten Nukleotiden chemisch
synthetisiert und für die Selektion in RNA transkribiert. Nach 8
Selektionszyklen, bestehend aus Selektion und Amplifikation, konnten affine
Moleküle isoliert werden. Die apparenten Dissoziationskonstanten dieser
Aptamere liegen bei 29-48 nM für das lange Peptid bzw. 758 nM für das kurze b
A4(1-16) Fragment. Die für das Amyloid erhaltenen Aptamere liegen in dem
Bereich der besten für Peptide bisher isolierten Aptamere, während für
kleinere, flexiblere Peptide häufig Aptamere im mikromolaren Bereich
beschrieben wurden.
In dieser Arbeit wurden Wege zu neuen Hilfsmitteln für die Untersuchung und
Diagnose der Alzheimer-Krankheit vorgestellt. Nun sollten diese Aptamere auf
ihre Wirksamkeit überprüft werden, um dann eine Verkürzung der Sequenzen und
eine Modifizierung der RNA zur Stabilisierung gegenüber RNasen anzuschließen.Although the cause of the Alzheimer´s disease is still unknown, it is supposed
to be closely related with the deposition of amyloid peptides in the brain of
patients. The amyloid is thus a major target in the search for novel
diagnostics and therapeutic approaches. This work employs RNA-technologies to
develop new tools for the study of the Alzheimer´s disease. The in vitro
selection enables the design of specific nucleic acids (aptamers) against
almost any target molecule. The aptamers have similar properties as monoclonal
antibodies, but several advantages. The chemical synthesis of these nucleic
acids enables tailor-made modifications. By introduction of specific reporter
groups these RNAs become suitable tools for analytical and diagnostic
purposes. Since a change of the amyloid concentration has been reported in the
blood of Alzheimer´s disease patients, the use of amyloid-specific aptamers
for diagnosing the disease seems conceivable. Moreover, antibodies have been
reported that prevent the aggregation of amyloid into senile plaques. This
points towards a potential therapeutic application of the amyloid-specific
aptamers.
High affinity RNA aptamers against the b A4(1-40) and a fragment b A4(1-16)
were isolated from a combinatorial library of 1015 different molecules by
using in vitro selection. For this purpose a DNA library containing 70
randomised nucleotides was chemically synthesised and transcribed into RNA.
Affinic molecules were isolated after 8 rounds of selection and amplification.
The apparent dissociation constants of these aptamers were 29-48 nM for the
long peptide and 758 nM for the short b A4(1-16) fragment. The binding
constants for the aptamers against the amyloid are within the range of the
highest affinities so far described for peptide-specific aptamers.
This work introduces a new approach for the study and diagnosis of the
Alzheimer´s disease. In future experiments, the efficacy of the aptamers needs
to be tested. In addition, identifying the minimal binding motifs and
enhancing the stability of the aptamers against RNase degradation are
necessary steps to render these aptamers into reliable tools
Selection of RNA Aptamers to the Alzheimer's Disease Amyloid Peptide
Alzheimer's disease is correlated with the deposition of amyloid peptides in the brain of the patients. The amyloid is thus a major target in the search for novel diagnostic and therapeutic approaches. The present work employs in vitro selection to develop new tools for the study of the Alzheimer's disease. The selection strategy enables the design of specific nucleic acids (aptamers) against virtually any target molecule. High-affinity RNA aptamers against the A4(1–40) were isolated from a combinatorial library of ~1015 different molecules. The apparent dissociation constants Kd of these aptamers are 29–48 nM. The binding of the RNA to the amyloid fibrils was confirmed by electron microscopy. The chemical synthesis of these nucleic acids enables tailor-made modifications. By introduction of specific reporter groups these RNAs can become suitable tools for analytical and diagnostic purposes. Thus, this study may introduce a new approach for diagnosis of the Alzheimer's disease