Virulence potential of the Fonseceae species related to the chromoblastomycosis diseases

Orientadora : PhD. Vania Aparecida VicenteCoorientadoras : PhD. Gerrit Sybren de Hoog ; PhD. Renata Rodrigues GomesTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 27/06/2017Inclui referênciasResumo: As leveduras negras associadas à infecção em hospedeiros animais pertencentes à família Herpotrichiellaceae são microorganismos extremamente relevantes quanto a sua natureza ecológica e consequentemente, em relação às interações desenvolvidas com diferentes substratos e hospedeiros. As infecções recorrentes e consistentes causadas por estes agentes indicam uma possibilidade de adaptação ao hospedeiro. Neste contexto, a doença cromoblastomicose caracterizada por uma infecção subcutânea em humanos, causada por diferentes espécies desta família, é decorrente da implantação destes agentes de forma traumática, com posterior adaptação no tecido subcutâneo do hospedeiro através da formação de estruturas diferenciadas, denominadas de corpos muriformes. A hipótese atual baseada em dados epidemiológicos é que os pacientes adquirem a doença principalmente a partir de um trauma causado por material de origem vegetal, como por exemplo, espinhos de plantas. Portanto, o objetivo principal deste estudo foi estabelecer protocolos de isolamento e avaliação do potencial de virulência das espécies do gênero Fonsecaea relacionadas à doença cromoblastomicose. Para os testes de virulência foram utilizadas linhagens de procedência clínica, agentes de cromoblastomicose, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) e Fonsecaea monophora (CBS 102248); e a de origem ambiental Fonsecaea erecta (CBS 125763) isolada de planta viva, em região endêmica da doença. Para o estudo foram estabelecidos protocolos de infecção utilizando como modelo vegetal, plantas, produtoras de espinhos: a planta rastejante Mimosa pudica e a palmeira Bactris gasipaes. E, em animais foi adotado como modelo a larva de Tenebrio molitor para estudos de virulência e de isolamento ambiental. Testes complementares de imunogenicidade foram realizados utilizando camundongos BALB/c. As plantas eram produzidas in vitro com posterior transferência para vasos. Plantas in vitro e em vasos eram inoculadas por injeção direta da solução fúngica na concentração 102cels/mL no caule e através da contaminação do meio de cultura e ou do solo. Todas as linhagens foram capazes de colonizar os tecidos das duas espécies de plantas produzidas in vitro e em vaso. As linhagens clínicas F. monophora e F. pedrosoi permaneciam na região da epiderme das plantas inoculadas, enquanto que, a espécie associada à planta viva F. erecta apresentava um perfil colonizador na planta, semelhante aos isolados endofíticos utilizados como controles neste trabalho. As análises histológicas mostraram que as linhagens clínicas eram capazes de invadir os tecidos das plantas, permanecendo como células leveduriformes e poucas hifas na epiderme, enquanto que a F. erecta isolada de planta viva, assim como os endofíticos utilizados como controle, produziam hifas dentro dos tecidos das plantas atingindo a região de vascularização. Nos testes de virulência utilizando T. molitor observou-se que as larvas infectadas com F. erecta apresentaram menor taxa de sobrevida, seguidas das infectadas por F. monophora e F. pedrosoi, demonstrando que a espécie procedente de planta viva pode sobreviver dentro do hospedeiro animal. Entretanto, somente a espécie de origem clínica F. pedrosoi foi capaz de formar células muriformes, considerada característica clinica da cromoblastomicose. Tais resultados, demonstraram diferenças na ecologia e virulência destas linhagens, além do potencial dessas larvas como modelo de reprodução da doença. O re-isolamento dos fungos a partir das larvas infectadas após 240 horas demonstrou que F. erecta apresentava diminuição significativa, baseado nas UFC/mL, em relação às linhagens clínicas, o que pode ter sido induzida pela alta imunogenicidade desta espécie verificada nos ensaios imunológicos em camundongos BALB/c. O T. Molitor foi também avaliado como meio de enriquecimento e isolamento onde foram obtidos a partir de larvas inoculadas com amostras de coco da palmeira babassu quatro isolados da família Herpotrichiellaceae, identificados como F. erecta (n=2) e F. monophora (n=2) e seis isolados da ordem Capnodiales identificados como Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) e Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae). Estes resultados indicaram a eficácia deste modelo como um método alternativo de isolamento de leveduras negras do meio ambiente. Em conclusão, estes estudos demonstraram que as linhagens de origem clínica podem sobreviver em tecidos vegetais, confirmando a hipótese de infecção traumática destes agentes a partir de substratos vegetais, revelando, no entanto, um comportamento diferenciado das espécies de procedência clinica e daquelas isoladas de plantas vivas. Além disso, os testes realizados em T. Molitor mostraram um modelo potencialmente útil para elucidar e comparar a virulência e o dimorfismo desses agentes, e assim, proposto como o primeiro modelo animal para a reprodução de células muriformes. Palavras-chave: Leveduras negras, Testes de virulência, Isolamento, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, cromoblastomicose.Abstract: The black yeasts belonging to Herpotrichiellaceae family cause infections in animal hosts and are extremely relevant microorganisms with regard to their ecology and interactions with different substrates and hosts. Recurrent and consistent infections caused by these agents indicate a possible adaptation potential in the host. In this context, chromoblastomycosis is characterized by a subcutaneous infection due to traumatic implantation of these agents within the host tissue, followed by their adaptation through the formation of differentiated structures called muriform cells. According to the current hypothesis that is based on existing epidemiological data, patients acquire this disease mainly from the trauma caused by plant materials (e.g., thorns). Therefore, the aims of this study were to establish protocols for their isolation and to evaluate virulence potential of the Fonsecaea species that associate with animals and plants and leads to chromoblastomycosis. For the virulence tests, the clinical strains of chromoblastomycosis agents namely, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) and Fonsecaea monophora (CBS 102248) and an environmental species isolated from living plants in the endemic area known as Fonsecaea erecta (CBS 125763) were used. The infection protocols, in plants, were established using the thorny plants, Mimosa pudica (creeper) and Bactris gasipaes (palm tree), as models. In animals, the Tenebrio molitor larvae were chosen for the evaluation of virulence and environmental isolation and BALB/c mice were used for performing complementary immunogenicity tests. The plants were produced in vitro with subsequent transfer to culture vessels. These in vitro and in vessel plants were then inoculated by direct injection of the fungal solution (102 cells/mL) into the stem and by contamination of the culture medium and/or soil. All strains were able to colonize tissues of both the in vitro and in vessel produced plant species. The histological analysis showed that the clinical strains of F. monophora and F. pedrosoi remained in the epidermal region of the infected plants as yeast cells and hyphae, while the clinical strain of F. erecta (associated with the living plant) produced hyphae within the tissues of the plants, reaching the region of vascularization. The colonization profile of F. erecta was similar to that of the endophytic isolates, used as controls in this work. In the virulence tests, it was observed that the T. molitor larvae that were infected by F. erecta had the lowest survival rate followed by the larvae infected with F. monophora and F. pedrosoi, indicating that the fungal species from a living plant have better survivability inside a host animal. However, it was also observed that only the clinical strain of F. pedrosoi was able to form muriform cells, constituting a hallmark of chromoblastomycosis. These results demonstrated that there were differences in ecology and virulence among these strains and also hinted at the potential of these larvae to be used as disease models. The re-isolation of fungi from the infected larvae after 240 h showed a significant decrease in the quantity (in CFU/mL) of F. erecta, in relation to other clinical strains. This seemed to be induced due to the high immunogenicity of this species that was seen in immunological assays of BALB/c mice. The T. molitor was also employed in methods for enrichment and isolation of chromoblastomycosis causing agents from the environment. A total of four isolates of the family Herpotrichiellaceae, namely, F. erecta (n=2) and F. monophora (n=2) and six isolates of the order Capnodiales, namely, Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) and Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae), were obtained from the larvae inoculated with coconut samples from the babassu palm tree. These results revealed the efficacy of this model as an alternative method for the isolation of black yeast from the environment. In conclusion, this study showed the ability of clinical strains to survive in plant tissues, confirming the hypothesis that these traumatic infection-causing agents are derived from plant substrates. The different behavior of these species originating from the clinical and environmental (living plants) source was also recorded. In addition, the T. molitor larvae functioned as a potentially useful model for elucidation of virulence and dimorphism of these agents and thus proposed as the first animal model for the reproduction of muriform cells in research. Keys-words: Black yeasts, virulence tests, isolation, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, chromoblastomycosis

Perfil de suscetibilidade in vitro e caracterização molecular de leveduras do gênero Candida isoladas de pacientes com vulvovaginite

Orientador : Prof. Dr. Flávio Queiroz Telles FilhoCo-orientadores : Profª Drª Vania Aparecida Vicente e Profº. Drº. Newton Sérgio de CarvalhoDissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 21/03/2013Inclui bibliografiasÁrea de concentração: MicrobiologiaResumo: A candidíase vulvovaginal afeta mulheres em idade reprodutiva representando aproximadamente 15 a 25% dos casos de vaginites. As diferentes espécies de Candida relacionadas à infecção podem ser encontradas na mucosa vaginal como colonizadoras e, em condições apropriadas, aceleram o processo de multiplicação e expressam fatores de virulência. O objetivo deste trabalho foi isolar leveduras de pacientes com ausência de sintomas clínicos (grupo colonizado) e de portadores da infecção. O perfil de sensibilidade in vitro destes isolados foi estabelecido e marcadores moleculares utilizados para identificar a distribuição das espécies. Um total de 40 isolados foram obtidos e identificados através do Cromoagar, sistema API20aux e pelo seqüenciamento das regiões ITS e D1/D2 do gene DNAr. Diferentes isolados de C. albicans foram genotipados pelo sistema ABC. A análise multilocus confirmou isolados das espécies Candida albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr e Saccharomyces cerevisiae. A espécie prevalente foi a C. albicans. No grupo colonizado foi encontrado C. albicans (60%), C. glabrata (25%), C. guilliermondii (5%), C. kefyr (5%) e Saccharomyces cerevisiae (5%). No grupo com infecção não complicada todos os isolados eram C. albicans (100%) e no grupo de infecção complicada a maioria eram C. albicans (90,9%), seguido de C. dubliniensiis (9,1%). Os diferentes isolados de C. albicans foram divididos em dois grupos genotípicos (A e B). Em relação ao perfil de sensibilidade in vitro dos isolados das diferentes espécies de Candida procedentes dos diferentes grupos estudados, pode se afirmar que os isolados obtidos a partir do grupo com infecção complicada apresentaram resistência a nistatina e eram sensíveis ao fluconazol, anfotericina B e cetoconazol, enquanto que os isolados do grupo com infecção não complicada e colonizada e individuos colonizados apresentaram sensibilidade dose dependente aos antifúngicos fluconazol, anfotericina B e cetoconazol. Os isolados de C. albicans pertencentes aos diferentes grupos genotípicos (A e B) não apresentaram correlação com os testes de suscetibilidade in vitro. Palavras-chave: candidíase vulvovaginal; suscetibilidade in vitro; variabilidade genética.Abstract: Vulvovaginal candidiasis affects women of reproductive age representing aproximatedly 15 to 25% of vaginitis cases. Different Candida species related to infection can be found colonizing the vaginal mucosa, and under appropriate conditions boost the reproduction process and express virulence factors. This study aimed to isolate yeasts of patients with clinical symptoms absence (colonized group) and also the ones with infection. The susceptibility of in vitro profile from these isolates was stablished and molecular markers were used to identify the species distribution. A total of 40 isolates were obtained and identified through the Cromoagar API20aux system and by sequencing of ITS regions and D1/D2 from the DNAr gene. Different C. albicans strains were genotyped by the ABC system. The multilocus analysis confirmed Isolates of Candida albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr and Saccharomyces cerevisiae. The most prevalent species was C. albicans. In the colonized group it was found C. albicans (60%), C glabrata (25%), C guilliermondii (5%), C kefyr (5%) and Saccharomyces cerevisiae (5%). In the uncomplicated infection group all isolates were C. albicans (100%) and in the complicated infection group most of the isolates were C. albicans (90.9%), followed by C. dubliniensiis (9.1%). The different isolates of C. albicans were diveded into two genotypic groups (A and B). Regarding the profile of sensibility in vitro of the isolates of different species of Cândida derived from distinct groups that were studied, it can be confirmed that the isolated obtained from the complicated infection group present resistance to nystatin and were sensitive to fluconazole, amphotericin B and ketoconazole, while the colonized presented dose-dependent sensitivty to the antifungal agents fluconazole, amphotericin B and ketoconazole. The C. albicans isolates which belong to different genotypic groups (A and B) did not show any correlation with the susceptibility tests in vitro. key-words: vulvovaginal candidiasis; susceptibility in vitro; variability genetic

Virulence potential of the Fonseceae species related to the chromoblastomycosis diseases

Orientadora : PhD. Vania Aparecida VicenteCoorientadoras : PhD. Gerrit Sybren de Hoog ; PhD. Renata Rodrigues GomesTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 27/06/2017Inclui referênciasResumo: As leveduras negras associadas à infecção em hospedeiros animais pertencentes à família Herpotrichiellaceae são microorganismos extremamente relevantes quanto a sua natureza ecológica e consequentemente, em relação às interações desenvolvidas com diferentes substratos e hospedeiros. As infecções recorrentes e consistentes causadas por estes agentes indicam uma possibilidade de adaptação ao hospedeiro. Neste contexto, a doença cromoblastomicose caracterizada por uma infecção subcutânea em humanos, causada por diferentes espécies desta família, é decorrente da implantação destes agentes de forma traumática, com posterior adaptação no tecido subcutâneo do hospedeiro através da formação de estruturas diferenciadas, denominadas de corpos muriformes. A hipótese atual baseada em dados epidemiológicos é que os pacientes adquirem a doença principalmente a partir de um trauma causado por material de origem vegetal, como por exemplo, espinhos de plantas. Portanto, o objetivo principal deste estudo foi estabelecer protocolos de isolamento e avaliação do potencial de virulência das espécies do gênero Fonsecaea relacionadas à doença cromoblastomicose. Para os testes de virulência foram utilizadas linhagens de procedência clínica, agentes de cromoblastomicose, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) e Fonsecaea monophora (CBS 102248); e a de origem ambiental Fonsecaea erecta (CBS 125763) isolada de planta viva, em região endêmica da doença. Para o estudo foram estabelecidos protocolos de infecção utilizando como modelo vegetal, plantas, produtoras de espinhos: a planta rastejante Mimosa pudica e a palmeira Bactris gasipaes. E, em animais foi adotado como modelo a larva de Tenebrio molitor para estudos de virulência e de isolamento ambiental. Testes complementares de imunogenicidade foram realizados utilizando camundongos BALB/c. As plantas eram produzidas in vitro com posterior transferência para vasos. Plantas in vitro e em vasos eram inoculadas por injeção direta da solução fúngica na concentração 102cels/mL no caule e através da contaminação do meio de cultura e ou do solo. Todas as linhagens foram capazes de colonizar os tecidos das duas espécies de plantas produzidas in vitro e em vaso. As linhagens clínicas F. monophora e F. pedrosoi permaneciam na região da epiderme das plantas inoculadas, enquanto que, a espécie associada à planta viva F. erecta apresentava um perfil colonizador na planta, semelhante aos isolados endofíticos utilizados como controles neste trabalho. As análises histológicas mostraram que as linhagens clínicas eram capazes de invadir os tecidos das plantas, permanecendo como células leveduriformes e poucas hifas na epiderme, enquanto que a F. erecta isolada de planta viva, assim como os endofíticos utilizados como controle, produziam hifas dentro dos tecidos das plantas atingindo a região de vascularização. Nos testes de virulência utilizando T. molitor observou-se que as larvas infectadas com F. erecta apresentaram menor taxa de sobrevida, seguidas das infectadas por F. monophora e F. pedrosoi, demonstrando que a espécie procedente de planta viva pode sobreviver dentro do hospedeiro animal. Entretanto, somente a espécie de origem clínica F. pedrosoi foi capaz de formar células muriformes, considerada característica clinica da cromoblastomicose. Tais resultados, demonstraram diferenças na ecologia e virulência destas linhagens, além do potencial dessas larvas como modelo de reprodução da doença. O re-isolamento dos fungos a partir das larvas infectadas após 240 horas demonstrou que F. erecta apresentava diminuição significativa, baseado nas UFC/mL, em relação às linhagens clínicas, o que pode ter sido induzida pela alta imunogenicidade desta espécie verificada nos ensaios imunológicos em camundongos BALB/c. O T. Molitor foi também avaliado como meio de enriquecimento e isolamento onde foram obtidos a partir de larvas inoculadas com amostras de coco da palmeira babassu quatro isolados da família Herpotrichiellaceae, identificados como F. erecta (n=2) e F. monophora (n=2) e seis isolados da ordem Capnodiales identificados como Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) e Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae). Estes resultados indicaram a eficácia deste modelo como um método alternativo de isolamento de leveduras negras do meio ambiente. Em conclusão, estes estudos demonstraram que as linhagens de origem clínica podem sobreviver em tecidos vegetais, confirmando a hipótese de infecção traumática destes agentes a partir de substratos vegetais, revelando, no entanto, um comportamento diferenciado das espécies de procedência clinica e daquelas isoladas de plantas vivas. Além disso, os testes realizados em T. Molitor mostraram um modelo potencialmente útil para elucidar e comparar a virulência e o dimorfismo desses agentes, e assim, proposto como o primeiro modelo animal para a reprodução de células muriformes. Palavras-chave: Leveduras negras, Testes de virulência, Isolamento, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, cromoblastomicose.Abstract: The black yeasts belonging to Herpotrichiellaceae family cause infections in animal hosts and are extremely relevant microorganisms with regard to their ecology and interactions with different substrates and hosts. Recurrent and consistent infections caused by these agents indicate a possible adaptation potential in the host. In this context, chromoblastomycosis is characterized by a subcutaneous infection due to traumatic implantation of these agents within the host tissue, followed by their adaptation through the formation of differentiated structures called muriform cells. According to the current hypothesis that is based on existing epidemiological data, patients acquire this disease mainly from the trauma caused by plant materials (e.g., thorns). Therefore, the aims of this study were to establish protocols for their isolation and to evaluate virulence potential of the Fonsecaea species that associate with animals and plants and leads to chromoblastomycosis. For the virulence tests, the clinical strains of chromoblastomycosis agents namely, Fonsecaea pedrosoi (CBS 271.37) and Fonsecaea monophora (CBS 102248) and an environmental species isolated from living plants in the endemic area known as Fonsecaea erecta (CBS 125763) were used. The infection protocols, in plants, were established using the thorny plants, Mimosa pudica (creeper) and Bactris gasipaes (palm tree), as models. In animals, the Tenebrio molitor larvae were chosen for the evaluation of virulence and environmental isolation and BALB/c mice were used for performing complementary immunogenicity tests. The plants were produced in vitro with subsequent transfer to culture vessels. These in vitro and in vessel plants were then inoculated by direct injection of the fungal solution (102 cells/mL) into the stem and by contamination of the culture medium and/or soil. All strains were able to colonize tissues of both the in vitro and in vessel produced plant species. The histological analysis showed that the clinical strains of F. monophora and F. pedrosoi remained in the epidermal region of the infected plants as yeast cells and hyphae, while the clinical strain of F. erecta (associated with the living plant) produced hyphae within the tissues of the plants, reaching the region of vascularization. The colonization profile of F. erecta was similar to that of the endophytic isolates, used as controls in this work. In the virulence tests, it was observed that the T. molitor larvae that were infected by F. erecta had the lowest survival rate followed by the larvae infected with F. monophora and F. pedrosoi, indicating that the fungal species from a living plant have better survivability inside a host animal. However, it was also observed that only the clinical strain of F. pedrosoi was able to form muriform cells, constituting a hallmark of chromoblastomycosis. These results demonstrated that there were differences in ecology and virulence among these strains and also hinted at the potential of these larvae to be used as disease models. The re-isolation of fungi from the infected larvae after 240 h showed a significant decrease in the quantity (in CFU/mL) of F. erecta, in relation to other clinical strains. This seemed to be induced due to the high immunogenicity of this species that was seen in immunological assays of BALB/c mice. The T. molitor was also employed in methods for enrichment and isolation of chromoblastomycosis causing agents from the environment. A total of four isolates of the family Herpotrichiellaceae, namely, F. erecta (n=2) and F. monophora (n=2) and six isolates of the order Capnodiales, namely, Cladosporium cladospoioides (Cladosporiacea) and Pseudocercospora norchiensis (Mycosphaerellaceae), were obtained from the larvae inoculated with coconut samples from the babassu palm tree. These results revealed the efficacy of this model as an alternative method for the isolation of black yeast from the environment. In conclusion, this study showed the ability of clinical strains to survive in plant tissues, confirming the hypothesis that these traumatic infection-causing agents are derived from plant substrates. The different behavior of these species originating from the clinical and environmental (living plants) source was also recorded. In addition, the T. molitor larvae functioned as a potentially useful model for elucidation of virulence and dimorphism of these agents and thus proposed as the first animal model for the reproduction of muriform cells in research. Keys-words: Black yeasts, virulence tests, isolation, F. pedrosoi, F. monophora, F. erecta, chromoblastomycosis

Onychomycosis by Fusarium oxysporum probably acquired in utero

Fusarium oxysporum has been described as a pathogen causing onychomycosis, its incidence has been increasing in immunocompetent and disseminated infection can occur in immunosuppressed individuals. We describe the first case of congenital onychomycosis in a child caused by Fusarium oxysporum. The infection being acquired in utero was proven by molecular methods with the identification of the fungus both in the nail and placenta, most probably as an ascending contamination/infection in a HIV-positive, immunosuppressed mother

Susceptibility and molecular characterization of Candida species from patients with vulvovaginitis

Abstract Vulvovaginal candidiasis affects women of reproductive age, which represents approximately 15–25% of vaginitis cases. The present study aimed to isolate and characterize yeast from the patients irrespective of the presentation of clinical symptoms. The isolates were subjected to in vitro susceptibility profile and characterization by molecular markers, which intended to assess the distribution of species. A total of 40 isolates were obtained and identified through the CHROMagar, API20aux and by ITS and D1/D2 regions sequencing of DNAr gene. Candida albicans strains were genotyped by the ABC system and the isolates were divided into two genotypic groups. The identity of the C. albicans, C. glabrata, C. guilliermondii, C. kefyr and Saccharomyces cerevisiae isolates was confirmed by the multilocus analysis. The strains of Candida, isolated from patients with complications, were found to be resistant to nystatin but sensitive to fluconazole, amphotericin B and ketoconazole, as observed by in vitro sensitivity profile. The isolates from asymptomatic patients, i.e., the colonized group, showed a dose-dependent sensitivity to the anti-fungal agents, fluconazole and amphotericin B. However, the isolates of C. albicans that belong to distinct genotypic groups showed the same in vitro susceptibility profile

Environmental Screening of Fonsecaea Agents of Chromoblastomycosis Using Rolling Circle Amplification

Chromoblastomycosis is a chronic, cutaneous or subcutaneous mycosis characterized by the presence of muriform cells in host tissue. Implantation disease is caused by melanized fungi related to black yeasts, which, in humid tropical climates, are mainly members of the genus Fonsecaea. In endemic areas of Brazil, F. pedrosoi and F. monophora are the prevalent species. The current hypothesis of infection is traumatic introduction via plant materials, especially by plant thorns. However, isolation studies have demonstrated a low frequency of the agents in environmental substrates. The present study aimed to detect F. pedrosoi and F. monophora in shells of babassu coconuts, soil, plant debris, and thorns from endemic areas of chromoblastomycosis in Maranhão state, northern Brazil, using Rolling Circle Amplification (RCA) with padlock probes as a new environmental screening tool for agents of chromoblastomycosis. In addition to molecular screening, the environmental samples were analyzed by fungal isolation using mineral oil flotation. The limit of detection of the RCA method was 2.88 × 107 copies of DNA per sample for the used padlock probes, indicating that this represents an efficient and sensitive molecular tool for the environmental screening of Fonsecaea agents. In contrast, with isolation from the same samples using several selective methods, no agents of chromoblastomycosis were recovered

Molecular Epidemiology of Agents of Human Chromoblastomycosis in Brazil with the Description of Two Novel Species

The human mutilating disease chromoblastomycosis is caused by melanized members of the order Chaetothyriales. To assess population diversity among 123 clinical strains of agents of the disease in Brazil we applied sequencing of the rDNA internal transcribed spacer region, and partial cell division cycle and β-tubulin genes. Strains studied were limited to three clusters divided over the single family Herpotrichiellaceae known to comprise agents of the disease. A Fonsecaea cluster contained the most important agents, among which F. pedrosoi was prevalent with 80% of the total set of strains, followed by 13% for F. monophora, 3% for F. nubica, and a single isolate of F. pugnacius. Additional agents, among which two novel species, were located among members of the genus Rhinocladiella and Cyphellophora, with frequencies of 3% and 1%, respectively

Comparative genomics of sibling species of Fonsecaea associated with Human Chromoblastomycosis

Fonsecaea and Cladophialophora are genera of black yeast-like fungi harboring agents of a mutilating implantation disease in humans, along with strictly environmental species. The current hypothesis suggests that those species reside in somewhat adverse microhabitats, and pathogenic siblings share virulence factors enabling survival in mammal tissue after coincidental inoculation driven by pathogenic adaptation. A comparative genomic analysis of environmental and pathogenic siblings of Fonsecaea and Cladophialophora was undertaken, including de novo assembly of F. erecta from plant material. The genome size of Fonsecaea species varied between 33.39 and 35.23Mb, and the core genomes of those species comprises almost 70% of the genes. Expansions of protein domains such as glyoxalases and peptidases suggested ability for pathogenicity in clinical agents, while the use of nitrogen and degradation of phenolic compounds was enriched in environmental species. The similarity of carbohydrate-active vs. protein-degrading enzymes associated with the occurrence of virulence factors suggested a general tolerance to extreme conditions, which might explain the opportunistic tendency of Fonsecaea sibling species. Virulence was tested in the Galleria mellonella model and immunological assays were performed in order to support this hypothesis. Larvae infected by environmental F. erecta had a lower survival. Fungal macrophage murine co-culture showed that F. erecta induced high levels of TNF-alpha contributing to macrophage activation that could increase the ability to control intracellular fungal growth although hyphal death were not observed, suggesting a higher level of extremotolerance of environmental species8CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQCOORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES573828/2008-3059201

Comparative Genomics of Sibling Species of Fonsecaea Associated with Human Chromoblastomycosis

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Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Utrecht, Netherlands / University of Amsterdam. Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics. Amsterdam, Netherlands.Universidade Federal do Paraná. Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention. Guangdong Provincial Institute of Public Health, Guangzhou, China.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. São Paulo, SP, Brasil.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas. São Paulo, SP, Brasil.Universidade de Brasília. Departamento de Biologia Celular. Brasilia, Brasil / Northern Arizona University. Pathogen and Microbiome Institute. Flagstaff, United States.Universidade Católica de Brasília. Departamento de Ciências Genômicas e Biotecnologia. Brasília, DF, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade de Campinas. Divisão de Recursos Microbianos. Campinas, SP, Brasil.Mashhad University of Medical Sciences. School of Medicine. Department of Parasitology and Mycology. Mashhad, Iran.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Hospital das Clínicas. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Setor de Educação Profissional e Tecnológica. Laboratório de Bioinformática. Curitiba, PR, Brasil / Universidade Federal do Paraná. Departamento de Bioquímica. Curitiba, PR, Brasil.Universidade Federal do Paraná. Departamento de Patologia Básica. Laboratório de Imunogenética e Histocompatibilidade. Curitiba, PR, Brasil / CBS-KNAW Fungal Biodiversity Centre. Utrecht, Netherlands / University of Amsterdam. Institute for Biodiversity and Ecosystem Dynamics. Amsterdam, Netherlands.Fonsecaea and Cladophialophora are genera of black yeast-like fungi harboring agents of a mutilating implantation disease in humans, along with strictly environmental species. The current hypothesis suggests that those species reside in somewhat adverse microhabitats, and pathogenic siblings share virulence factors enabling survival in mammal tissue after coincidental inoculation driven by pathogenic adaptation. A comparative genomic analysis of environmental and pathogenic siblings of Fonsecaea and Cladophialophora was undertaken, including de novo assembly of F. erecta from plant material. The genome size of Fonsecaea species varied between 33.39 and 35.23 Mb, and the core genomes of those species comprises almost 70% of the genes. Expansions of protein domains such as glyoxalases and peptidases suggested ability for pathogenicity in clinical agents, while the use of nitrogen and degradation of phenolic compounds was enriched in environmental species. The similarity of carbohydrate-active vs. protein-degrading enzymes associated with the occurrence of virulence factors suggested a general tolerance to extreme conditions, which might explain the opportunistic tendency of Fonsecaea sibling species. Virulence was tested in the Galleria mellonella model and immunological assays were performed in order to support this hypothesis. Larvae infected by environmental F. erecta had a lower survival. Fungal macrophage murine co-culture showed that F. erecta induced high levels of TNF-α contributing to macrophage activation that could increase the ability to control intracellular fungal growth although hyphal death were not observed, suggesting a higher level of extremotolerance of environmental species