Studien zur Biosynthese von Sactipeptiden: Charakterisierung der an der Thioetherbrückenbildung beteiligten Radical SAM Enzyme AlbA und SkfB

Sactipeptide sind eine neue Klasse ribosomal synthetisierter, meist bioaktiver Peptide, die aus 26 bis 35 proteinogenen Aminosäuren bestehen. Ihr charakteristisches Merkmal ist eine Thio-etherbindung, die das Schwefelatom einer Cysteingruppe mit dem α-Kohlenstoffatom einer Ak-zeptoraminosäure verknüpft. Als Akzeptoren wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt die Aminosäu-ren Phenylalanin, Threonin, Methionin, Asparagin, Serin, Alanin und Tyrosin identifiziert. Alle bekannten Sactipeptide verfügen über eine relativ starre helikale Struktur. Teilweise wird auch ein zyklisches Peptidrückgrat gefunden. Der Sporulation Killing Factor (SKF) verfügt neben der Thioetherbrücke über eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese der Thioetherbildung in den Sactipeptide Subti-losin A und SKF untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bildung der Thioetherbrücken von den Enzymen AlbA (Subtilosin A) und SkfB (SKF) katalysiert wird. Diese beiden Proteine wurden als Radical SAM Enzyme identifiziert, da sie nur in der mit Eisen und Schwefel beladenen Form und nur unter reduktiven Bedingungen in der Lage sind S-Adenosylmethionin (SAM) in Methio-nin und das 5’-Deoxyadenosylradikal zu spalten. Des Weiteren wurde durch die Bestimmung des Eisengehaltes von-Varianten der beiden Enzyme und auch durch spektroskopische Unter-suchungen dieser Proteinvarianten gezeigt, dass AlbA wie auch SkfB zwei [4Fe-4S]-Cluster binden. Der über ein für Radical SAM Enzyme charakteristisches CXXXCXXC-Motiv gebundene [4Fe-4S]-Cluster ist für die Spaltung von SAM verantwortlich wohin gegen der andere [4Fe-4S]-Cluster eine wichtige Rolle in der Synthese des Thioethers spielt. Durch Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit und ohne Zugabe von Iodacetamid, die anschlie-ßend per HPLC-HRMS analysiert wurden, wurde gezeigt, dass die Enzyme jeweils für die Syn-these der Thioetherbrücken in dem dazugehörigen Vorläuferpeptid (SboA, SkfA) verantwortlich sind. Durch Leaderpeptidlose SboA und SkfA-Varianten wurde gezeigt, dass die Reaktion den ersten Schritt in der jeweiligen Biosynthese bildet. Durch AlbA und SkfB-Varianten wie auch Interaktionsstudien mit AlbA, AlbA-Varianten und SboA wurde eine Wechselwirkung des zwei-ten gebundenen [4Fe-4S]-Clusters und dem Vorläuferpeptid nachgewiesen. Des Weiteren wur-den SkfA-Varianten hergestellt die Fragen zur Substratspezifität im Bezug auf Donor- und Ak-zeptorposition in der SkfB katalysierten Reaktion beantworten sollten. Dabei wurde u.a. gezeigt, dass die Enzymklasse nicht in der Lage ist die Synthese von Etherbindungen zu katalysieren. Aufbauend auf den dabei erhaltenen Ergebnissen wurde ein vollständig neuer, über radikale Zwischenstufen verlaufender Mechanismus für die Synthese der Thioetherbindungen vorge-schlagen und verifziert

Dissecting Bottromycin Biosynthesis Using Comparative Untargeted Metabolomics.

Bottromycin A2 is a structurally unique ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide (RiPP) that possesses potent antibacterial activity towards multidrug-resistant bacteria. The structural novelty of bottromycin stems from its unprecedented macrocyclic amidine and rare β-methylated amino acid residues. The N-terminus of a precursor peptide (BtmD) is converted into bottromycin A2 by tailoring enzymes encoded in the btm gene cluster. However, little was known about key transformations in this pathway, including the unprecedented macrocyclization. To understand the pathway in detail, an untargeted metabolomic approach that harnesses mass spectral networking was used to assess the metabolomes of a series of pathway mutants. This analysis has yielded key information on the function of a variety of previously uncharacterized biosynthetic enzymes, including a YcaO domain protein and a partner protein that together catalyze the macrocyclization.This work was supported by a BBSRC studentship (W.J.K.C.), BBSRC grant BB/M003140/1 (A.W.T. and J.S-A), a Royal Society University Research Fellowship (A.W.T.), and by the BBSRC MET ISP grant to the John Innes Centre.This is the final version of the article. It first appeared from Wiley via http://dx.doi.org/10.1002/anie.20160430

Radical reaction control in the AdoMet radical enzyme CDG Synthase (QueE): consolidate, destabilize, accelerate

Controlling radical intermediates and thus catalysing and directing complex radical reactions is a central feature of S-adensosylmethionine (SAM)-dependent radical enzymes. We report ab initio and DFT calculations highlighting the specific influence of ion complexation, including Mg2+, identified as a key catalytic component on radical stability and reaction control in 7-carboxy-7-deazaguanine synthase (QueE). Radical stabilisation energies (RSEs) of key intermediates and radical clock-like model systems of the enzyme-catalysed rearrangement of 6-carboxytetrahydropterin (CPH4), reveals a directing role of Mg2+ in destabilising both the substrate-derived radical and corresponding side reactions, with the effect that the experimentally-observed rearrangement becomes dominant over possible alternatives. Importantly, this is achieved with minimal disruption of the thermodynamics of the substrate itself, affording a novel mechanism for an enzyme to both maintain binding potential and accelerate the rearrangement step. Other mono and divalent ions were probed with only dicationic species achieving the necessary radical conformation to facilitate the reaction

Studien zur Biosynthese von Sactipeptiden: Charakterisierung der an der Thioetherbrückenbildung beteiligten Radical SAM Enzyme AlbA und SkfB

Sactipeptide sind eine neue Klasse ribosomal synthetisierter, meist bioaktiver Peptide, die aus 26 bis 35 proteinogenen Aminosäuren bestehen. Ihr charakteristisches Merkmal ist eine Thio-etherbindung, die das Schwefelatom einer Cysteingruppe mit dem α-Kohlenstoffatom einer Ak-zeptoraminosäure verknüpft. Als Akzeptoren wurden bis zum jetzigen Zeitpunkt die Aminosäu-ren Phenylalanin, Threonin, Methionin, Asparagin, Serin, Alanin und Tyrosin identifiziert. Alle bekannten Sactipeptide verfügen über eine relativ starre helikale Struktur. Teilweise wird auch ein zyklisches Peptidrückgrat gefunden. Der Sporulation Killing Factor (SKF) verfügt neben der Thioetherbrücke über eine Disulfidbindung zwischen zwei Cysteinen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Biosynthese der Thioetherbildung in den Sactipeptide Subti-losin A und SKF untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bildung der Thioetherbrücken von den Enzymen AlbA (Subtilosin A) und SkfB (SKF) katalysiert wird. Diese beiden Proteine wurden als Radical SAM Enzyme identifiziert, da sie nur in der mit Eisen und Schwefel beladenen Form und nur unter reduktiven Bedingungen in der Lage sind S-Adenosylmethionin (SAM) in Methio-nin und das 5’-Deoxyadenosylradikal zu spalten. Des Weiteren wurde durch die Bestimmung des Eisengehaltes von-Varianten der beiden Enzyme und auch durch spektroskopische Unter-suchungen dieser Proteinvarianten gezeigt, dass AlbA wie auch SkfB zwei [4Fe-4S]-Cluster binden. Der über ein für Radical SAM Enzyme charakteristisches CXXXCXXC-Motiv gebundene [4Fe-4S]-Cluster ist für die Spaltung von SAM verantwortlich wohin gegen der andere [4Fe-4S]-Cluster eine wichtige Rolle in der Synthese des Thioethers spielt. Durch Vorläuferpeptidmodifikationsassays mit und ohne Zugabe von Iodacetamid, die anschlie-ßend per HPLC-HRMS analysiert wurden, wurde gezeigt, dass die Enzyme jeweils für die Syn-these der Thioetherbrücken in dem dazugehörigen Vorläuferpeptid (SboA, SkfA) verantwortlich sind. Durch Leaderpeptidlose SboA und SkfA-Varianten wurde gezeigt, dass die Reaktion den ersten Schritt in der jeweiligen Biosynthese bildet. Durch AlbA und SkfB-Varianten wie auch Interaktionsstudien mit AlbA, AlbA-Varianten und SboA wurde eine Wechselwirkung des zwei-ten gebundenen [4Fe-4S]-Clusters und dem Vorläuferpeptid nachgewiesen. Des Weiteren wur-den SkfA-Varianten hergestellt die Fragen zur Substratspezifität im Bezug auf Donor- und Ak-zeptorposition in der SkfB katalysierten Reaktion beantworten sollten. Dabei wurde u.a. gezeigt, dass die Enzymklasse nicht in der Lage ist die Synthese von Etherbindungen zu katalysieren. Aufbauend auf den dabei erhaltenen Ergebnissen wurde ein vollständig neuer, über radikale Zwischenstufen verlaufender Mechanismus für die Synthese der Thioetherbindungen vorge-schlagen und verifziert