Cellular reprogramming strategies for degenerative disorders involving the retinal pigment epithelium

RESUMO: A reprogramação celular permite que uma célula somática seja reprogramada para outra célula diferente através da expressão forçada de factores de transcrição (FTs) específicos de determinada linhagem celular, e constitui uma área de investigação emergente nos últimos anos. As células somáticas podem ser experimentalmente manipuladas de modo a obter células estaminais pluripotentes induzidas (CEPi), ou convertidas directamente noutro tipo de célula somática. Estas descobertas inovadoras oferecem oportunidades promissoras para o desenvolvimento de novas terapias de substituição celular e modelos de doença, funcionando também como ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares que estabelecem a identidade celular e regulam os processos de desenvolvimento. Existem várias doenças degenerativas hereditárias e adquiridas da retina que causam deficiência visual devido a uma disfunção no tecido de suporte da retina, o epitélio pigmentar da retina (EPR). Uma destas doenças é a Coroideremia (CHM), uma doença hereditária monogénica ligada ao cromossoma X causada por mutações que implicam a perda de função duma proteína com funções importantes na regulação do tráfico intracelular. A CHM é caracterizada pela degenerescência progressiva do EPR, assim como dos foto-receptores e da coróide. Resultados experimentais sugerem que o EPR desempenha um papel importante na patogénese da CHM, o que parece indicar uma possível vantagem terapêutica na substituição do EPR nos doentes com CHM. Por outro lado, existe uma lacuna em termos de modelos in vitro de EPR para estudar a CHM, o que pode explicar o ainda desconhecimento dos mecanismos moleculares que explicam a patogénese desta doença. Assim, este trabalho focou-se principalmente na exploração das potencialidades das técnicas de reprogramação celular no contexto das doenças de degenerescência da retina, em particular no caso da CHM. Células de murganho de estirpe selvagem, bem como células derivadas de um ratinho modelo de knockout condicional de Chm, foram convertidos com sucesso em CEPi recorrendo a um sistema lentiviral induzido que permite a expressão forçada dos 4 factores clássicos de reprogramação, a saber Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc. Estas células mostraram ter equivalência morfológica, molecular e funcional a células estaminais embrionárias (CES). As CEPi obtidas foram seguidamente submetidas a protocolos de diferenciação com o objectivo final de obter células do EPR. Os resultados promissores obtidos revelam a possibilidade de gerar um valioso modelo de EPR-CHM para estudos in vitro. Em alternativa, a conversão directa de linhagens partindo de fibroblastos para obter células do EPR foi também abordada. Uma vasta gama de ferramentas moleculares foi gerada de modo a implementar uma estratégia mediada por FTs-chave, seleccionados devido ao seu papel fundamental no desenvolvimento embrionário e especificação do EPR. Conjuntos de 10 ou menos FTs foram usados para transduzir fibroblastos, que adquiriram morfologia pigmentada e expressão de alguns marcadores específicos do EPR. Adicionalmente, observou-se a activação de regiões promotoras de genes específicos de EPR, indicando que a identidade transcricional das células foi alterada no sentido pretendido. Em conclusão, avanços significativos foram atingidos no sentido da implementação de tecnologias de reprogramação celular já estabelecidas, bem como na concepção de novas estratégias inovadoras. Metodologias de reprogramação, quer para pluripotência, quer via conversão directa, foram aplicadas com o objectivo final de gerar células do EPR. O trabalho aqui descrito abre novos caminhos para o estabelecimento de terapias de substituição celular e, de uma maneira mais directa, levanta a possibilidade de modelar doenças degenerativas da retina com disfunção do EPR numa placa de petri, em particular no caso da CHM.---------------ABSTRACT: Cellular reprogramming is an emerging research field in which a somatic cell is reprogrammed into a different cell type by forcing the expression of lineage-specific transcription factors (TFs). Cellular identities can be manipulated using experimental techniques with the attainment of pluripotency properties and the generation of induced Pluripotent Stem (iPS) cells, or the direct conversion of one somatic cell into another somatic cell type. These pioneering discoveries offer new unprecedented opportunities for the establishment of novel cell-based therapies and disease models, as well as serving as valuable tools for the study of molecular mechanisms governing cell fate establishment and developmental processes. Several retinal degenerative disorders, inherited and acquired, lead to visual impairment due to an underlying dysfunction of the support cells of the retina, the retinal pigment epithelium (RPE). Choroideremia (CHM), an X-linked monogenic disease caused by a loss of function mutation in a key regulator of intracellular trafficking, is characterized by a progressive degeneration of the RPE and other components of the retina, such as the photoreceptors and the choroid. Evidence suggest that RPE plays an important role in CHM pathogenesis, thus implying that regenerative approaches aiming at rescuing RPE function may be of great benefit for CHM patients. Additionally, lack of appropriate in vitro models has contributed to the still poorly-characterized molecular events in the base of CHM degenerative process. Therefore, the main focus of this work was to explore the potential applications of cellular reprogramming technology in the context of RPE-related retinal degenerations. The generation of mouse iPS cells was established and optimized using an inducible lentiviral system to force the expression of the classic set of TFs, namely Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc. Wild-type cells, as well as cells derived from a conditional knockout (KO) mouse model of Chm, were successfully converted into a pluripotent state, that displayed morphology, molecular and functional equivalence to Embryonic Stem (ES) cells. Generated iPS cells were then subjected to differentiation protocols towards the attainment of a RPE cell fate, with promising results highlighting the possibility of generating a valuable Chm-RPE in vitro model. In alternative, direct lineage conversion of fibroblasts into RPE-like cells was also tackled. A TF-mediated approach was implemented after the generation of a panoply of molecular tools needed for such studies. After transduction with pools of 10 or less TFs, selected for their key role on RPE developmental process and specification, fibroblasts acquired a pigmented morphology and expression of some RPE-specific markers. Additionally, promoter regions of RPE-specific genes were activated indicating that the transcriptional identity of the cells was being altered into the pursued cell fate. In conclusion, highly significant progress was made towards the implementation of already established cellular reprogramming technologies, as well as the designing of new innovative ones. Reprogramming into pluripotency and lineage conversion methodologies were applied to ultimately generate RPE cells. These studies open new avenues for the establishment of cell replacement therapies and, more straightforwardly,raise the possibility of modelling retinal degenerations with underlying RPE defects in apetri dish, particularly CHM

Vitimação múltipla de mulheres socialmente excluídas: da prevalência à significação

Dissertação de mestrado integrado em Psicologia (área de especialização em Psicologia da Justiça)No presente estudo procurámos obter uma compreensão integrada do fenómeno da vitimação múltipla de mulheres em situação de exclusão social. Primeiramente, caraterizámos o fenómeno (prevalência, tipos de violência, perpetradores) e o seu impacto, avaliando também a relação entre a vitimação e o impacto no ajustamento psicológico, e o efeito de variáveis sociodemográficas para o risco de vitimação múltipla. Procurámos depois analisar a experiência subjetiva da vitimação múltipla, percebendo as formas de vitimação mais marcantes e o significado pessoal atribuído. O estudo incluiu 39 mulheres em condição de exclusão social, utilizando-se uma metodologia mista (quantitativa e qualitativa). Os resultados evidenciaram um elevado número de experiências de vitimação ao longo da vida, com maior prevalência na idade adulta, perpetrada pelo parceiro. Contudo, a maioria das mulheres vitimadas exibiu reduzida sintomatologia clínica. Maiores níveis de sintomatologia estavam associados à experiência de mais crimes contra a propriedade. As que tendiam a apresentar menos sintomas eram as que estavam institucionalizadas em casa abrigo. As experiências de vitimação mais marcantes ocorreram no contexto da intimidade. As mulheres não percecionaram o carácter cumulativo da vitimação mas teceram reflexões críticas na tentativa de dar sentido à vitimação sofrida. Possíveis explicações para estes resultados são discutidas.This study aims to provide an integrated understanding about victimization experienced by women socially excluded. First we characterize the phenomenon (prevalence, types, perpetrators) and its impact, also evaluating the relationship between victimization and the impact on psychological adjustment, and the effect of sociodemographic variables for risk of multiple victimization. We tried to analyze the subjective experience of multiple victimization, realizing the most striking forms of victimization and personal meaning assigned. The study included 39 socially excluded women, using a mixed methodology (quantitative and qualitative). The results showed a high number of experiences of violence suffered lifelong, with a higher prevalence in adulthood perpetrated by partners. However, most women present reduced clinical symptoms. Higher levels of symptoms were associated with the experience of more crimes against property. Those who tended to present fewer symptoms were women who were institutionalized in shelter house. The most significant experiences of victimization are those suffered in intimate relationships. Women do not perceive the cumulative nature of victimization but they made some critical reflections to create sense of the violence experienced. Possible explanations for these results are discussed.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) - Projeto de Investigação “Vitimação Múltipla de Mulheres Socialmente Excluídas: Interseção de Significados e Trajetórias de Mudança” (PTDC/PSI-APL/113885/2009

Study of EEG spectral bands from Parkinson's disease patients treated with transcranial magnetic stimulation

A doença de Parkinson é uma condição degenerativa do Sistema Nervoso Central, relacionado com a perda de um neurotransmissor, a Dopamina. Os principais sintomas presentes são: os tremores nos membros assim como, o maxilar e a face; a instabilidade postural e a afectação do equilíbrio e coordenação. Em Portugal a doença de Parkinson afecta cerca de vinte mil de pessoas, enquanto na Finlândia são cerca de dez mil pessoas. Estes doentes são normalmente sujeitos a medicações que reduzem parte dos sintomas, como o caso da Levodopa (L-dopa), e também é comum estes doentes apresentarem problemas na marcha. Com este estudo é pretendido ver se a técnica Estimulação Magnética Transcraniana pode ser um tratamento alternativo para os doentes de Parkinson. Estas pessoas detêm uma actividade da banda de frequência Beta superior ao normal, e pretende-se que esta diminua após o tratamento. Para tal foram adquiridos dados de electroencefalograma (EEG) de 26 pacientes previamente divididos em dois grupos, um dos quais receberia a estimulação e o outro seria o seu controlo. Este estudo baseia-se num protocolo duplamente cego, onde os pacientes foram distribuídos aleatoriamente, e nem os médicos ou técnicos têm conhecimento dos grupos. Os doentes de Parkinson seleccionados tinham idades compreendidas entre 40-80 anos, classificados de acordo com os parâmetros de UK-PD-Brain-Bank-criteria Hoehn –Yahrstage (escala: 2-4), eram medicados com 300mg ou mais de Levodopa ou semelhante; e apresentavam dificuldades no andar (demorando 6 segundos ou mais a percorrer 10 metros). A técnica intermittent Theta Burst Stimulation (iTBS) foi aplicada no Córtex Motor e no Córtex Dorsolateral Prefrontal (DLPFC) dos pacientes pertencentes ao grupo experimental. Como tratamento dos dados de EEG foi usada a Análise de Componentes Independentes, assim como Fast Fourier Transform para o cálculo da Potência no domínio das frequências. No entanto a hipótese não foi confirmada, uma vez que os resultados obtidos não mostraram as diferenças significativas desejadas entre o grupo controlo e o grupo que sofreu a estimulação no que concerne a actividade da frequência Beta.Parkinson’s disease (PD) is a degenerative condition of the Central Nervous System, that is related with the loss of the neurotransmitter, Dopamine. The main symptoms are: tremors especially on limbs, jaw and face; the postural instability and loss of control of coordination and balance. In Portugal there are twenty thousand people that suffer from Parkinson’s disease, and ten thousand in Finland. Usually these people take medication to reduce the symptoms, such as Levodopa (L-dopa) and they also have problems walking. The study intended to verify if the technique Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) may be an alternative treatment for Parkinson's disease patients. These patients have the activity of beta band higher than normal, and it is supposed to be lower after treatment. For that, electroencephalogram (EEG) data of 26 patients were acquired and divided into two groups: one that would receive the stimulation and the other would be its control. The study was designed to be a random, double-blind study. The PD patients included 40-80 years old, were classified according to UK-PD-Brain-Bank-criteria, Hoehn-Yahr-stage 2 to 4; also, these patients were medicated with a total dose of Levodopa or other Dopamine agonist agents of equal or more than 300 mg or more revealed problems with walking (taking 6 or more seconds to walk a 10 meter distance). Standard tests were performed before and during this study, to test walking capacity of patients. The intermittent Theta Burst Stimulation (iTBS) was applied to the Motor Cortex and Dorsolateral Prefrontal Cortex (DLPFC) of patients belonging to the experimental group. While processing the EEG data, the Independent Component Analysis (ICA), as well as Fast Fourier Transform (FFT) were used to calculate the band power in the frequency domain. However the hypothesis was not fully confirmed, since the results showed no significant differences between the sham group and the group that received stimulation as for the activity of Beta band was concerned

Study of the influence of σ factors on the kinetics of RNA production

Gene expression dynamics inEscherichia coliis controlled at the transcription initiation stage, whichbeginswhen an RNA polymerase holoenzyme, composed of RNA polymerase core enzyme and the σ factor, recognizes the promoter sequence of a gene. Under different conditions, different σ factors are used. Also,some promoters require a specific σ factor, while others haveless specificity. The intracellular levels of σ factors vary between σ factorsand with the cell growth phase.It is still unknown whether different σ factors will lead to differing kinetics of transcription initiation, thereby,in this study it will be characterized the dynamicsof this processby different σ factors, under optimal growth conditionsandunder the control of either of twopromoters, PtetAandPBAD, during the exponential and stationary growth phases. Mutant cells,lacking σ54 or σ38were used and the dynamics of transcription initiation was compared with wild-type cells, for each of the two promoters and during each of the two growth phases. For this, RNA molecules are detected as soon as they are producedin each cell, using an MS2-GFP tagging method,and the distribution of time intervals between consecutive RNA productions are obtainedin each condition.From the results obtained it is concluded that: PtetAis not affected by the σ factors’ populationcompositionduring the two growth cellular phases studied, while PBADit is;the dynamics of transcription initiation is affected by the promoter used; there are 3 rate-limiting steps in transcription initiation under control of the two promoters for the 3 strains during the phases analyzed; the distribution of the intervals are not exponential-like; RNA production is sub-Poissonian; the results of the model developed are in agreement with the observations from in vivomeasurements under control of PtetA,while for PBAD there are some differences

The use of seismic wave velocities in the measurement of stiffness of a residual soil

Tese de doutoramento. Engenharia Civil. Faculdade de Engenharia. Universidade do Porto. 200

Enantiomer separation through biocatalysis using NADES

Currently, the separation process of racemic secondary alcohols has a great environmental impact because it involves the use of large amounts of organic solvents and energy. Based on the principles of green chemistry, the main purpose of this work is the development of a sustainable process, without the use of organic solvents and using reusable catalysts (enzymes) in order to make the most efficient separation process in terms of energy and reduce the associated environmental impact. In this work we developed a process for the separating of the enantiomers of (±)-menthol, via a transesterification reaction with vinyl decanoate. At optimum conditions, this reaction will yield the pure enantiomer (-)-menthyl decanoate, while (+)-menthol will remain unreacted. The use of reusable biological catalysts is possible due to the enantioselectivity of the enzyme, allowing the resolution of secondary alcohols to obtain pure enantiomers of high added value. Candida Rugosa lipase is a selective enzyme capable of selectively converting the (-)-menthol into a different chemical compound and with different characteristics the (+)-menthol. At the end of the reaction, the menthol enantiomers will be present in the reaction medium in the form of (+)-menthol and (-)-menthyl decanoate. As such it is necessary to use a method based on the properties of alternative solvents to physically separate the compounds. The main objective of this study is to evaluate deep eutectic solvents as solvents for the transesterification reaction, but also to experiment if whether they themselves are able to act as substrates. Another approach is to test whether they can also act as separating agents of (+)-menthol and menthyl decanoate. In the first phase it is intended to develop a DES using combinations of choline chloride, urea, and glycerol. The second objective is to synthesize DES based on menthol, containing one or both of the reaction substrates in the composition. The transesterification reaction is conducted in these solvents in order to assess whether the reaction is feasible in the presence of a biocatalyst. After the reaction, the enantiomers can be separated, since they are different entities. This separation is based on the interaction of the compounds with the DES, which allows the physical separation of the two compounds ((+)-menthol and (-)-menthyl decanoate). Through this work, we got the required proof of concept for all experiments performed in DES. Using hexane as reaction medium, a (±)-menthol conversion of 26.3 % was achieved, nevertheless controlling the water content in the reaction medium and in the atmosphere a maximum conversion of 50.9 % was achieved after 24 hours at 40°C. In DES ChCl:glycerol (1:2) and ChCl:urea (1:2) conversions are similar to those obtained in hexane at the same conditions, with values of 10.9 % and 10.2 % respectively. In DES menthol:camphor (4:1) was obtained 23% conversion at 40°C after 50 hours. In DES menthol:lauric acid (2:1) and menthol:phenylpropionic acid (1:1) conversions are higher with a maximum of 79.6 % and 62.1 % respectively. For the separation of compounds, DES choline dodecanediote:glycerol (1:1) was most effective with a separation factor of 16±6.5

Estudo da saúde mental positiva em jovens adultos: Relações entre psicopatologia e bem-estar

A investigação tem vindo a demonstrar que a saúde mental positiva e o bem-estar são mais do que a ausência de psicopatologia, desempenhando um importante papel na saúde em geral (Huppert, 2005). Este estudo teve como objetivo caraterizar a saúde mental positiva e a doença mental de uma amostra de 150 jovens adultos, com idades compreendidas entre os 18 e os 30 anos de idade. Para a recolha de dados utilizamos a Escala de Bem-Estar Mental de Warwic--Edinburgh (Tennant et al., 2007), a versão reduzida da Escala Continuum de Saúde Mental (Keyes, 2002) e a Escala de Ansiedade, Depressão e Stresse (Pais-Ribeiro, Honrado, & Leal, 2004). Os resultados indicaram que a maior parte dos participantes apresenta bons níveis de saúde mental positiva e níveis inferiores de psicopatologia, tendo sido encontradas correlações negativas entre ambas. Constatámos, ainda, que são os mais novos e os homens da amostra que apresentaram níveis mais elevados de saúde mental positiva. As mulheres e os desempregados foram os que apresentaram os níveis mais elevados de psicopatologia. Os resultados sublinham a necessidade de incluir medidas de avaliação da saúde mental positiva e bem estar no estudo da saúde em geral.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

TOPAS-MC Extension for Nuclear Medicine Applications

Monte Carlo (MC) techniques are currently deemed the gold standard for internal dosimetry, since the simulations can perform full radiation transport and reach a precision level not attainable by analytical methods. In this study, a custom voxelized particle source was developed for the TOPAS-MC toolkit to be used for internal dosimetry purposes. The source was designed to allow the use of clinical functional scans data to simulate events that reproduce the patient-specific tracer biodistribution. Simulation results are very promising, showing that this can be a first step towards the extension of TOPAS-MC to nuclear medicine applications. In the future more studies are needed to further ascertain the applicability and accuracy of the developed routines.Comment: 5 pages, 3 figure

Caraterização da Saúde Mental numa população jovem do concelho da Póvoa de Varzim: da psicopatologia ao bem-estar

Dissertação apresentada à Universidade Fernando Pessoa como parte dos requisitos para a obtenção do grau de Mestre em Psicologia, ramo de Psicologia Clínica e da SaúdeA saúde mental é conceptualizada como um “estado completo” em que os indivíduos estão livres de psicopatologia e em flourishing, e com níveis elevados de bem-estar emocional, psicológico e social (Keyes, 2002). Este constructo indica que quando um indivíduo se sente bem, é mais produtivo, sociável, criativo, tem perspetivas futuras e sente-se feliz (García-Viniegras & Benitez, 2000). Contudo, a saúde mental e doença mental não são extremidades opostas do mesmo conceito, constituem eixos distintos mas correlacionados (Keyes, 2005); e a doença mental continua a ser bastante prevalente, essencialmente a ansiedade e a depressão (e.g. APA, 2012). Este estudo pretende efetuar a caraterização da saúde mental e bem-estar (emocional, social e psicológico) e doença mental/psicopatologia de jovens entre os 18 e os 30 anos, residentes no concelho da Póvoa de Varzim. Para a recolha de dados, foram utilizadas a Escala de Bem-Estar Mental de Warwick-Edinburgh (WEMWBS) - versão Portuguesa, a versão reduzida para adultos da Escala Continuum de Saúde Mental-Versão Reduzida (MHC-SF) e a Escala de Ansiedade, Depressão e Stress (EADS-21). Os resultados encontrados indicaram que a maior parte da amostra apresenta bons níveis de saúde mental (flourishing) e bem-estar (emocional, psicológico e social) e níveis inferiores de doença mental (ansiedade, depressão e stress), correlações negativas entre a saúde mental/bem-estar e psicopatologia, e associações entre estas variáveis e variáveis sociodemográficas. Verificamos que os mais novos (18-25 anos) apresentam melhor saúde mental e bem-estar em geral, assim como, melhor bem-estar emocional; os homens apresentam maior bem-estar em geral do que as mulheres e estas, maiores níveis de psicopatologia; a depressão é mais frequente nos desempregados, e os que completaram o ensino básico apresentam melhor bem-estar emocional do que os completaram o ensino secundário, mas menos psicopatologia em geral e menor stress. Concluímos que apesar da maioria da amostra se encontrar em flourishing, algumas variáveis interferem com a saúde mental, bem-estar e psicopatologia, o que realça a necessidade de se investir na promoção da saúde mental positiva.The mental health is conceptualized as a “complete state” in which individuals are free of psychopathology and flourishing with high levels of emotional, psychological and social well-being (Keyes, 2002). This construct indicates that individuals that feels good is more productive, companionable and creative, has future prospects and feels happy (Garcia-Viniegras & Benitez, 2000). Nevertheless, mental health and mental illness aren´t the opposite of the same concept, they are distinct but correlated (Keyes, 2005); and the mental illness is still quite prevalent, mainly anxiety and depression (e.g. APA, 2012). This study intends to make the characterization of mental health and well-being (emotional, social and psychological) and mental illness/psychopathology of young people between 18 and 30 years old, residents in the Póvoa de Varzim country. For data collection, were used the Warwick-Edinburgh Mental Wellbeing Scale (WEMWBS) - portuguese version, the for adults Mental Health Continuum Scale- short form (MHC-SF) and the Depression Anxiety Stress Scale-21 (DASS-21). The results indicate that most of the sample shows high levels of mental health and well-being and lower levels of mental illness (anxiety, depression and stress), negative correlations with mental health/well-being and psychopathology, and associations between these variables and sociodemographic variables. We found that the younger (18-25 years) have better mental health and well-being (emotional, psychological and social) in general, as well as better emotional well-being; men have higher well-being than woman, and woman higher levels of psychopathology; depression is more prevalent in the unemployed, and those who finished the basic education present better emotional well-being than those who have completed high school, but less psychopathology in general and less stress. We conclude that although the majority of the sample is in flourishing, some variables interfere with mental health, well-being and psychopathology, which highlights the need to invest in the promotion of positive mental health