Comparative genomic analysis and molecular examination of the diversity of enterotoxigenic Escherichia coli isolates from Chile

Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) is one of the most common diarrheal pathogens in the low- and middle-income regions of the world, however a systematic examination of the genomic content of isolates from Chile has not yet been undertaken. Whole genome sequencing and comparative analysis of a collection of 125 ETEC isolates from three geographic locations in Chile, allowed the interrogation of phylogenomic groups, sequence types and genes specific to isolates from the different geographic locations. A total of 80.8% (101/125) of the ETEC isolates were identified in E. coli phylogroup A, 15.2% (19/125) in phylogroup B, and 4.0% (5/125) in phylogroup E. The over-representation of genomes in phylogroup A was significantly different from other global ETEC genomic studies. The Chilean ETEC isolates could be further subdivided into sub-clades similar to previously defined global ETEC reference lineages that had conserved multi-locus sequence types and toxin profiles. Comparison of the gene content of the Chilean ETEC identified genes that were unique based on geographic location within Chile, phylogenomic classifications or sequence type. Completion of a limited number of genomes provided insight into the ETEC plasmid content, which is conserved in some phylogenomic groups and not conserved in others. These findings suggest that the Chilean ETEC isolates contain unique virulence factor combinations and genomic content compared to global reference ETEC isolates

Identification and detection of iha subtypes in LEE-negative Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains isolated from humans, cattle and food

LEE-negative Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) strains are important cause of infection in humans and they should be included in the public health surveillance systems. Some isolates have been associated with haemolytic uremic syndrome (HUS) but the mechanisms of pathogenicity are is a field continuos broadening of knowledge. The IrgA homologue adhesin (Iha), encoded by iha, is an adherence-conferring protein and also a siderophore receptor distributed among LEE-negative STEC strains. This study reports the presence of different subtypes of iha in LEE-negative STEC strains. We used genomic analyses to design PCR assays for detecting each of the different iha subtypes and also, all the subtypes simultaneously. LEE-negative STEC strains were designed and different localizations of this gene in STEC subgroups were examinated.Genomic analysis detected iha in a high percentage of LEE-negative STEC strains. These strains generally carried iha sequences similar to those harbored by the Locus of Adhesion and Autoaggregation (LAA) or by the plasmid pO113. Besides, almost half of the strains carried both subtypes. Similar results were observed by PCR, detecting iha LAA in 87% of the strains (117/135) and iha pO113 in 32% of strains (43/135). Thus, we designed PCR assays that allow rapid detection of iha subtypes harbored by LEE-negative strains. These results highlight the need to investigate the individual and orchestrated role of virulence genes that determine the STEC capacity of causing serious disease, which would allow for identification of target candidates to develop therapies against HUS.Fil: Colello, Rocío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Krüger, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Velez, María Victoria. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comisión de Investigaciones Científicas; ArgentinaFil: Del Canto, Felipe. Universidad de Chile. Facultad de Medicina. Instituto de Ciencias Biomédicas; ChileFil: Etcheverría, Analía Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Vidal, Roberto. Universidad de Chile. Facultad de Medicina. Instituto de Ciencias Biomédicas; Chile. Universidad de Chile. Facultad de Medicina. Instituto Milenio de Inmunología e Inmunoterapia; ChileFil: Padola, Nora Lía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; Argentin

Conservation and global distribution of non-canonical antigens in enterotoxigenic Escherichia coli

BACKGROUND: Enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) cause significant diarrheal morbidity and mortality in children of resource-limited regions, warranting development of effective vaccine strategies. Genetic diversity of the ETEC pathovar has impeded development of broadly protective vaccines centered on the classical canonical antigens, the colonization factors and heat-labile toxin. Two non-canonical ETEC antigens, the EtpA adhesin, and the EatA mucinase are immunogenic in humans and protective in animal models. To foster rational vaccine design that complements existing strategies, we examined the distribution and molecular conservation of these antigens in a diverse population of ETEC isolates. METHODS: Geographically diverse ETEC isolates (n = 1159) were interrogated by PCR, immunoblotting, and/or whole genome sequencing (n = 46) to examine antigen conservation. The most divergent proteins were purified and their core functions assessed in vitro. RESULTS: EatA and EtpA or their coding sequences were present in 57.0% and 51.5% of the ETEC isolates overall, respectively; and were globally dispersed without significant regional differences in antigen distribution. These antigens also exhibited \u3e93% amino acid sequence identity with even the most divergent proteins retaining the core adhesin and mucinase activity assigned to the prototype molecules. CONCLUSIONS: EtpA and EatA are well-conserved molecules in the ETEC pathovar, suggesting that they serve important roles in virulence and that they could be exploited for rational vaccine design

Identificación de subtipos de iha en cepas Escherichia coli productor de toxina Shiga LEE-negativas aisladas de humanos y bovinos en Argentina y Chile

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un grupo de cepas que ocasiona enfermedades graves como colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico, debido a que posee múltiples factores de virulencia. Entre las proteínas sugeridas como adhesinas se encuentra Iha, cuyo nombre refiere a su homología con la adhesina IrgA de Vibrio cholerae (IrgA homolog adhesin). Esta proteína se detectó por primera vez en una cepa STEC O157:H7, codificada en una isla genómica que confiere adherencia y resistencia a telurito, denominada TAI. Estudios posteriores demostraron presencia de iha en cepas STEC no-O157, como también variabilidad de su secuencia y localización. En particular, análisis filogenéticos basados en iha separan las cepas LEE-positivas y las LEE-negativas en distintos clados.El propósito de este estudio fue examinar los subtipos de iha y su localización en cepas STEC LEE-negativas aisladas de humanos y bovinos.Se analizaron secuencias genómicas de 32 aislamientos STEC LEE-negativos obtenidos de Argentina (17) y Chile (15) de distintos serotipos y orígenes. Se utilizaron herramientas bioinformáticas tales como VirulenceFinder, RAST y BLAST para detectar y localizar iha en cada genoma. Se realizó un alineamiento múltiple y se construyó un árbol filogenético con las secuencias iha obtenidas y secuencias depositadas en bases de datos. Además, se analizaron las regiones flanqueantes a iha en los distintos genomas.Se detectó iha en la mayoría de los aislamientos (29/32). El análisis demostró la presencia de 3 subtipos que denominamos iha1, iha2, iha3. Catorce aislamientos presentaron los subtipos iha2 e iha3 simultáneamente, 11 aislamientos sólo iha3, 3 sólo iha2 y 1 iha1. El análisis de secuencias flanqueantes sugiere que iha1 estaría localizado en TAI, iha2 en un plásmido similar a pO113, mientras que iha3 en una isla genómica de adherencia y autoagregación descripta en cepas LEE-negativas (LAA). La proteína Iha se encontró en una alta prevalencia en cepas LEE-negativas aisladas tanto de humanos como de bovinos en Chile y Argentina. La mayoría de las cepas presentaron subtipos de iha que estarían localizados en plásmidos y/o islas genómicas. Estudios posteriores permitirán evaluar la importancia de más de un subtipo de estas adhesinas en STEC.Fil: Colello, Rocío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Krüger, Alejandra. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Del Canto, Felipe. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Etcheverría, Analía Inés. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Vidal, Roberto. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Padola, Nora Lía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaXIV Congreso Latinoamericano de Microbiología; XL Congreso Chileno de Microbiología; II Reunión Anual de la Asociación Chilena de Inmunología y IX Reunión de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras MicobacteriosisSantiago de ChileChileAsociación Latinoamericana de MicrobiologíaAsociación Chilena de Inmunologí

Modelo predictivo de epítopos proteicos utilizando inteligencia artificial

55 p.El sistema inmunitario, encargado de detectar y eliminar agentes patógenos en el organismo, reconoce regiones específicas en las proteínas para proceder con su eliminación. Los linfocitos B y T se unen a los epítopos, los cuales corresponden a segmentos de proteínas que permiten al sistema inmune reconocer el patógeno. Se han implementado distintas técnicas para predecir regiones o segmentos de una proteína, que son reconocidas por el sistema inmune y así, probar estos epítopos tentativos mediante procesos experimentales. El proyecto plantea el desarrollo de un sistema de detección mediante inteligencia artificial, a través de la implementación de descriptores moleculares. Las medidas físico-químicas y geométricas que se obtuvieron al estudiar las secuencias de antígenos, fueron utilizadas para generar el conjunto de datos y luego, definir los atributos más importantes para la predicción del modelo. Los resultados obtenidos, fueron comparados con el método de predicción actual DTU, para evaluar la capacidad del modelo en reconocer epítopos de nuevas proteínas

Characterization of Adherent-Invasive Escherichia coli (AIEC) Outer Membrane Proteins Provides Potential Molecular Markers to Screen Putative AIEC Strains

Adherent-invasive E. coli (AIEC) is a pathotype associated with the etiopathogenesis of Crohn's disease (CD), albeit with an as-yet unclear role. The main pathogenic mechanisms described for AIEC are adherence to epithelial cells, invasion of epithelial cells, and survival and replication within macrophages. A few virulence factors have been described as participating directly in these phenotypes, most of which have been evaluated only in AIEC reference strains. To date, no molecular markers have been identified that can differentiate AIEC from other E. coli pathotypes, so these strains are currently identified based on the phenotypic characterization of their pathogenic mechanisms. The identification of putative AIEC molecular markers could be beneficial not only from the diagnostic point of view but could also help in better understanding the determinants of AIEC pathogenicity. The objective of this study was to identify molecular markers that contribute to the screening of AIEC strains. For this, we characterized outer membrane protein (OMP) profiles in a group of AIEC strains and compared them with the commensal E. coli HS strain. Notably, we found a set of OMPs that were present in the AIEC strains but absent in the HS strain. Moreover, we developed a PCR assay and performed phylogenomic analyses to determine the frequency and distribution of the genes coding for these OMPs in a larger collection of AIEC and other E. coli strains. As result, it was found that three genes (chuA, eefC, and fitA) are widely distributed and significantly correlated with AIEC strains, whereas they are infrequent in commensal and diarrheagenic E. coli strains (DEC). Additional studies are needed to validate these markers in diverse strain collections from different geographical regions, as well as investigate their possible role in AIEC pathogenicity

La adquisición de islas de patogenicidad favorece la emergencia y potencial de virulencia de Escherichia coli productor de Shiga toxina (STEC) LEE-negativo

STEC causa diarrea, disentería y síndrome hemolítico urémico (SHU). La Shiga toxina es el principal factor de virulenciade STEC, pero la capacidad de la bacteria para adherirse y colonizar el intestino humano es fundamental para causarenfermedad. La Isla de Patogenicidad (PAI) Locus of Enterocyte Effacement (LEE) contiene genes que median elfenotipo de adhesión de un grupo de cepas STEC (LEE-positivo) que son clínicamente relevantes debido a su asociacióncon SHU. No obstante, cepas STEC que carecen de LEE (LEE-negativo) también han sido aisladas de casos de SHU,indicando que factores de virulencia adicionales están involucrados en la patogenicidad de estas bacterias. De hecho,tres PAIs, denominadas como ?Locus of Proteolysis Activity?, ?Subtilase-Encoding Pathogenicity Island? y el ?Locus ofAdhesion and Autoaggregation? (LAA), han sido reportadas como exclusivamente presentes en STEC LEE-negativo. Sinembargo, se desconocen los mecanismos de patogénesis mediados por estas PAIs. Recientemente, la incidencia degastroenteritis causada por cepas STEC LEE-negativo ha aumentado en varios países. Por lo tanto, en este estudioinvestigamos la base genética para su emergencia y realizamos un análisis de genómica comparativa utilizando 367genomas de cepas STEC LEE-negativo aisladas a nivel mundial. Como resultado, identificamos tres nuevos elementosgenéticos, incluyendo dos PAIs y un Elemento Integrativo y Conjugativo. Además, encontramos que LAA fue la PAI másfrecuente, sugiriendo que juega un papel importante en la biología de STEC. En consecuencia, LAA fue eliminada delcromosoma de la cepa STEC E045 mediante reemplazo alélico. Posteriormente, se realizaron ensayos in vitro e in vivopara determinar si la deleción de LAA afecta la capacidad de adhesión, colonización y virulencia de la cepa E045. Sepresenta evidencia en apoyo a la participación de LAA en la colonización intestinal de un modelo murino de infecciónpor STEC. Finalmente, análisis filogenéticos indicaron que clados en los que se agrupan cepas con dos o más PAIs estángeográficamente más diseminados en comparación con clados filogenéticamente cercanos en los que se agrupan cepasque carecen o contienen una sola PAI. Este estudio es un paso adelante en el conocimiento de la evolución y virulenciade STEC.Fil: Montero, David A.. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Del Canto, Felipe. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Salazar, Juan C.. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Velasco, Juliana. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Colello, Rocío. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Padola, Nora Lía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tandil. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil. Provincia de Buenos Aires. Gobernación. Comision de Investigaciones Científicas. Centro de Investigación Veterinaria de Tandil; ArgentinaFil: Oñate, Angel. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileFil: Puente, José L.. Universidad Nacional Autónoma de México. Instituto de Biotecnología; MéxicoFil: Vidal, Roberto. Universidad de Chile. Facultad de Medicina; ChileXXIV Congreso Latinoamericano de Microbiología; XL Congreso Chileno de Microbiología; II Reunión Anual de la Asociación Chilena de Inmunología y IX Reunión de la Sociedad Latinoamericana de Tuberculosis y otras MicobacteriosisSantiago de ChileChileAsociación Latinoamericana de Microbiologí

Cumulative acquisition of pathogenicity islands has shaped virulence potential and contributed to the emergence of LEE-negative Shiga toxinproducing Escherichia coli strains

Shiga toxin-producing Escherichia coli (STEC) are foodborne pathogens causing severe gastroenteritis, which may lead to hemolytic uremic syndrome. The Locus of Enterocyte Effacement (LEE), a Pathogenicity Island (PAI), is a major determinant of intestinal epithelium attachment of a group of STEC strains; however, the virulence repertoire of STEC strains lacking LEE, has not been fully characterized. The incidence of LEE-negative STEC strains has increased in several countries, highlighting the relevance of their study. In order to gain insights into the basis for the emergence of LEE-negative STEC strains, we performed a large-scale genomic analysis of 367 strains isolated worldwide from humans, animals, food and the environment. We identified uncharacterized genomic islands, including two PAIs and one Integrative Conjugative Element. Additionally, the Locus of Adhesion and Autoaggregation (LAA) was the most prevalent PAI among LEE-negative strains and we found that it contributes to colonization of the mice intestine. Our comprehensive and rigorous comparative genomic and phylogenetic analyses suggest that the accumulative acquisition of PAIs has played an important, but currently unappreciated role, in the evolution of virulence in these strains. This study provides new knowledge on the pathogenicity of LEE-negative STEC strains and identifies molecular markers for their epidemiological surveillance.This study was supported by FONDECYT grant 1161161 to R. Vidal and CONICYT-PCHA/2014-63140238 fellowship to D. Montero. Work at USC-LREC was supported by Project PI16/01477 from Plan Estatal de I+D+I 2013-2016, Instituto de Salud Carlos III, Subdirección General de Evaluación y Fomento de la Investigación and FEDER, Ministerio de Economia, Industria y Competitividad, Gobierno de España and Project ED431C 2017/57 from the Consellería de Cultura, Educación e Ordenación Universitaria, Xunta de Galicia and FEDER. Fondecyt 11150966 to Felipe Del Canto. Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología; [Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico].S

Coli Surface Antigen 26 Acts as an Adherence Determinant of Enterotoxigenic Escherichia coli and Is Cross-Recognized by Anti-CS20 Antibodies

The coli surface antigen 26 (CS26) of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) had been described as a putative adhesive pilus based on the partial sequence of the crsH gene, detected in isolates from children with diarrhea in Egypt. However, its production and activity as adherence determinant has not been experimentally addressed. The crsH was identified as a homolog of genes encoding structural subunits of ETEC colonization factors (CFs) CS12, CS18, and CS20. These CFs, along with the recently discovered CS30, belong to the γ2 family of pili assembled by the chaperone-usher pathway (CU pili). Further, the complete CS26 locus, crsHBCDEFG, was described in an O141 ETEC strain (ETEC 100664) obtained from a diarrhea case in The Gambia, during the Global Enterics Multicenter Study. Here, we report that CS26 is a pilus of ∼10 nm in diameter, with the capacity to increase the cell adherence of the non-pathogenic strain E. coli DH10B. As for other related pili, production of CS26 seems to be regulated by phase variation. Deletion of crsHBCDEFG in ETEC 100664 significantly decreased its adherence capacity, which was recovered by in trans complementation. Furthermore, CrsH was cross-recognized by polyclonal antibodies directed against the major structural subunit of CS20, CsnA, as determined by Western blotting and immunogold labeling. ETEC CS26+ strains were found to harbor the heat-labile enterotoxin only, within three different sequence types of phylogroups A and B1, the latter suggesting acquisition through independent events of horizontal transfer. Overall, our results demonstrate that CS26 is an adhesive pilus of human ETEC. In addition, cross-reactivity with anti-CsnA antibodies indicate presence of common epitopes in γ2-CFs