Atividade antimicrobiana de endófitos e de extratos foliares de Schinus Terebenthifolius Raddi (Aroeira)

Resumo: A pesquisa de compostos químicos biologicamente ativos para fins terapêuticos em plantas utilizadas na medicina popular e em seus microrganismos endofíticos tem enriquecido as opções terapêuticas com novos fármacos antinflamatórios, antimicrobianos, antitumorais, entre outros. Em busca de soluções para o avanço das bactérias multiresistentes o presente trabalho buscou a confirmação científica para o uso popular de Schinus terebenthifolius Raddi, aroeira, como atimicrobiano e ampliou o estudo buscando a relação desta atividade aos seus endófitos. Para isto foi avaliada a atividade antimicriobiana e a composição química do extrato metanólico bruto das folhas da planta, assim como suas frações. Paralelamente, foram isolados fungos filamentosos e actinomicetos endofíticos das folhas da mesma árvore, que foram confrontados com bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e levedura de interesse clínico e um fitopatógeno filamentoso para verificar o potencial de produção de compostos antimicrobianos por esses microrganismos. Os endófitos com este potencial foram selecionados para fermentação a fim de extrair seus metabólitos secundários ativos. Aqueles que apresentaram bons resultados também foram avaliados quimicamente e comparados com o extrato obtido diretamente das folhas da planta e suas frações. O extrato bruto metanólico das folhas de aroeira e suas frações de diclorometano:acetato de etila (1:1) e de acetato de etila foram ativos contra Staphylococcus aureus (ATCC 27213), Escherichia coli (ATCC 35219), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) e Candida albicans (ATCC 10231). Ainda, o extrato bruto da planta inibiu em mais de 40% o crescimento do fitopatógeno Guignardia citricarpa. Alguns dos compostos extraídos dos endófitos também apresentaram atividade contra pelo menos um dos microrganismos testados (Staphylococcus aureus - ATCC 27213, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 27853 e Candida albicans - ATCC 10231). Foram encontrados nove microrganismos endofíticos produtores de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana, entre eles foram identificados os gêneros Alternaria, Phomopsis, Penicillium e Streptomyces, um basideomiceto também apresentou a mesma propriedade. De acordo com a analíse química por cromatografia em camada delgada sugere-se que os metabólitos ativos da planta estejam relacionados com compostos fenólicos e/ou antraquinonas, enquanto a atividade antimicrobiana dos endófitos testados parece estar vinculada à produção de alcalóides, presente em todos os extratos ativos dos microrganismos. Dois extratos com atividade produzidos por endófitos também apresentaram antraquinonas e um terpenóides. Nas condições testadas não foi encontrada relação entre os compostos com atividade antimicrobiana extraídos das folhas de S. terebenthifolius Raddi com os extraídos dos fungos e actinomiceto isolados desta mesma planta. Entretanto, esta diversidade de vias metabólicas secundárias ressalta a importância da pesquisa destas duas fontes de metabólitos secundários biologicamente ativos

Bioprospecção de metabólitos secundários de endófitos de Shinus terebinthifolius

Orientadora : Profª Drª Chirlei GlienkeTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 29/09/2014Inclui bibliografiaResumo: A obtenção de novos compostos bioativos com diferentes mecanismos de ação, menores efeitos indesejáveis, maior segurança na utilização e maior eficácia é uma necessidade constante na saúde, agronomia e indústria. Essa busca é indiscutivelmente importante tratando-se de compostos antimicrobianos devido a capacidade dos microrganismos tornarem-se resistentes aos mesmos. A bioprospecção é uma das ferramentas utilizadas para a obtenção de produtos naturais com essa ação. Uma das fontes promissoras utilizadas nesse tipo de investigação são os metabólitos secundários produzidos por microrganismos endofíticos obtidos a partir de plantas medicinais. Deste modo, o trabalho a seguir teve como propósito a obtenção de produtos bioativos produzidos por fungos endofíticos das folhas de Schinus terebinthifolius, árvore popularmente conhecida como aroeira. O trabalho de Bioprospecção de Metabólitos Secundários de Endófitos de S. terebinthifolius foi dividido em dois capítulos voltados à otimização da produção de extratos ativos. O primeiro objetiva a obtenção de compostos contra patógenos humanos e o segundo contra o fitopatógeno Phyllosticta citricarpa. O primeiro capítulo, intitulado "Antimicrobial potential of endophytic fungi from Schinus terebinthifolius", explorou a capacidade de produção de extratos de interesse a partir de três fungos pertencentes aos gêneros Alternaria, Bjerkandera e Xylaria, sob diferentes condições de cultivo, comprovando a influência das fontes de carbono e nitrogênio, pH e temperatura sobre o metabolismo secundário dos microrganismos. A obtenção do extrato do fungo Alternaria sp. Sect. Alternata teve a escala ampliada e o mesmo foi avaliado frente à bactéria Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA). Duas porções do extrato bruto foram ativas contra essa bactéria. Hexadecanoato de metila e um alcaloide pirrolopirazina foram identificados nas frações ativas do isolado de Alternaria sp. Sect. Alternata. O segundo estudo, "Biological activity of Diaporthe terebinthifolii extracts against Phyllosticta citricarpa", possibilitou a obtenção de uma fração biologicamente ativa contra o fitopatógeno. Da biodiversidade fúngica estudada dois isolados de D. terebinthifolii foram os mais promissores contra P. citricarpa. Diferentes meios de cultivo foram avaliados na seleção do isolado mais eficiente, o qual foi escolhido para a produção do extrato em maior escala. O meio sólido arroz foi o mais apropriado. Foram identificados alguns compostos de interesse produzidos pelo endófito: álcool fenetílico, verbanol, hexadecanoato de metila e acetato de verbenil. De modo geral, os fungos endofíticos isolados das folhas de aroeira apresentaram interessante potencial biotecnológico, tanto para a área médica como agronômica, pela produção de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana. Palavras-chave: endófitos - metabólitos secundários - Schinus terebinthifolius - atividade antimicrobianaAbstract: The obtainment of new bioactive compounds with different mechanisms of action, minor side effects, more effective and safest is a constant need in health, agronomy and industry. This search is unquestionably important in the case of antimicrobial compounds because of the ability of microorganisms become resistant to them. The bioprospection is one of the tools used to obtain natural products with this action. One of the promising sources used in this type of investigation are secondary metabolites produced by endophytic microorganisms obtained from medicinal plants. Thus, the following work had as purpose obtaining bioactive products produced by endophytic fungus from the leaves of Schinus terebinthifolius, tree popularly known as aroeira. The work "Secondary Metabolites Bioprospection of S. terebinthifolius Endophytes" was divided into two chapters. The first one focused in the optimization of active extracts production against human pathogens and the second in the obtainment of a product against the phytopathogen Phyllosticta citricarpa. The first chapter, entitled "Antimicrobial potential of endophytic fungi from Schinus terebinthifolius", explored the capacity of production of interest extracts using three fungi belonging to the genera Alternaria, Bjerkandera and Xylaria under different culture conditions demonstrating the influence of carbon and nitrogen sources, pH and temperature on the secondary metabolism of these microorganisms. The scale production of Alternaria sp. Sect. Alternata extract was expanded and the product has been evaluated against the methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA). Two active portions against the microorganism were isolated from the crude extract. Methyl hexadecanoate and a pyrrolopyrazine alkaloid were identified in the active fractions of the Alternaria sp. Sect. Alternata isolated. The second study, "Biological activity of Diaporthe terebinthifolii extracts against Phyllosticta citricarpa", allowed obtaining a biologically active fraction against the phytopathogen. Of the fungal biodiversity studied two isolates of D. terebinthifolii were the most promising against P. citricarpa. Different culture media were evaluated for selecting the most efficient isolate for the production of the extract on a larger scale. The rice solid medium was the most appropriate. Some compounds of interest produced by the endophyte were identified: phenylethyl alcohol, verbanol, methyl-hexadecanoate and verbenyl acetate. In general, the endophytic fungi isolated from the leaves of aroeira showed interesting biotechnological potential, both for medical and agronomic field, by the production of secondary metabolites with antimicrobial activity. Keywords: endophytes - secondary metabolites - Schinus terebinthifolius - antimicrobial activit

Proteinase activity in latex of three plants of the family Euphorbiaceae

In the family of Euphorbiaceae, the genera Euphorbia and Sapium are known to contain essentially latex-bearing species. In the present study, the latex of Euphorbia selloi (Klotzsch & Garcke) Boiss., Euphorbia papillosa A.St.-Hil., and Sapium glandulosum (L.) Morong, plants native from Brazil, were examined concerning proteolytic activity. All studied species have proteins with significant proteolytic activity and E. papillosa has the greatest specific activity. Aiming to verify the type of protease present, an assay with different inhibitors was performed. In the three tested plants, the proteolytic activity was significantly inhibited by a serine protease inhibitor 4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF). Using techniques of electrophoresis with polyacrylamide gels (SDS-PAGE), the subunits of proteins were separated according to their molecular masses, and the protein activity was visually detected by zymography.Dentro da família Euphorbiaceae, os gêneros Euphorbia e Sapium são conhecidos por incluírem basicamente espécies produtoras de látex. No presente estudo, o látex das plantas Euphorbia selloi (Klotzsch & Garcke) Boiss., Euphorbia papillosa A.St.-Hil. e Sapium glandulosum (L.) Morong, espécies nativas do Brasil, foi analisado em relação à atividade proteolítica. Todas as amostras analisadas possuem proteínas com significativa atividade, sendo que o látex da espécie E. papillosa apresenta a maior atividade específica. Com o objetivo de analisar quais os tipos de proteases responsáveis pela atividade proteolítica, realizaram-se ensaios com diferentes inibidores. Nas três plantas testadas a atividade foi inibida significativamente pelo cloridrato de 4-(fluoreto de 2-aminoetilbenzenossulfonil) (AEBSF), um inibidor de serino-proteases. Utilizando técnicas de eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), as subunidades das proteínas foram separadas de acordo com sua massa molecular e, através da zimografia, a atividade proteolítica pode ser detectada visualmente

Endophytes Potential Use in Crop Production

The endophytic microorganisms have the potential to improve the yield of agricultural crops. They can be used as biological control, plant growth promoter, or bioremediators. The action of endophytes in controlling phytopathogens, insects, and weeds that harm agriculture may be the result of microbial interactions with other organisms or the production of bioactive metabolites. Also, microorganisms can have the ability to favor plant growth and convert toxic compounds present in the soil. The presence of pollutants in the substrate reduces its quality for plant development, so bioremediation also impacts agricultural production. Therefore, prospecting endophytic microorganisms with agronomic potential may provide sustainable alternatives to increase crop yield

Biomass production for utilization in biomortar comparing animal and vegetable organic matter

O uso de microrganismos em meio líquido para o processo de biocimentação, favorece a continuidade do crescimento bacteriano. Entretanto se este demora para ser usado, para de crescer rapidamente, levando a morte celular. Este estudo comparou duas formas de produção de uma biomassa, capaz de armazenar os microrganismos em estado de latência mantendo a viabilidade para posterior utilização. Aqui foi descrito o preparo de biomassas, feitas com materiais orgânicos e bactéria Sporosarcina pasteurii (CCT 0538 ATCC 1185). Foram testadas biomassas de origem animal (esterco de aves) e vegetal (ervilhaca - Vicia villosa Roth). Ambas biomassas mantiveram a viabilidade dos microrganismos, sendo que a vegetal foi mais eficiente apresentando maior crescimento bacteriano após a revitalização. Para teste foram moldados corpos de prova referência (sem biomassa) e também com cada uma delas, e depois de 28 dias ensaiados a tração e compressão. A resistência a tração apresentou um aumento de 41,2 % (biomassa animal) e de 44,7 % (biomassa vegetal). Na resistência a compressão o aumento foi de 37,8 % (biomassa animal) e de 38,8 % (biomassa vegetal), comparados a argamassa de referencia (sem adição de microrganismo).The use of microorganisms in liquid medium for the biocementation process, favors the continuity of bacterial growth. However, if it takes too long to use, it stops growing rapidly, leading to cell death. This study compared two forms of biomass production, capable of storing microorganisms in a latent state, maintaining viability for later use. Here we described the preparation of biomasses, made with organic materials and bacteria Sporosarcina pasteurii (CCT 0538 ATCC 1185). Animal (poultry manure) and vegetable (vetch - Vicia villosa Roth) biomasses were tested. Both biomasses maintained the viability of the microorganisms, and the vegetable was more efficient, presenting greater bacterial growth after revitalization. For testing, reference specimens were molded (without biomass) and also with each one of them, and after 28 days tested for traction and compression. The tensile strength showed an increase of 41.2% (animal biomass) and 44.7% (plant biomass). In the compressive strength, the increase was 37.8% (animal biomass) and 38.8% (vegetable biomass), compared to the reference mortar (without the addition of a microorganism)

Estratégias de internacionalização de pequenas e médias empresas: estudo multicasos

Este estudo teve como objetivo compreender as estratégias adotadas pelas pequenas e médias empresas (PMEs) do Oeste de Santa Catarina para a internacionalização. O método de pesquisa utilizado trata-se de pesquisa qualitativa, a coleta de dados ocorreu por meio de entrevista semiestruturada, a amostra foi composta por três gestores de empresas da região oeste de Santa Catarina, participantes do Programa Exporta – SC, projeto realizado por intermédio do Sebrae. Os dados foram analisados por meio da técnica de análise do conteúdo. Os resultados apresentam que a forma de internacionalização das três empresas compreendeu o modelo de Uppsala (Teoria Comportamental) e o modo de entrada utilizado foi a exportação. Esta pesquisa apresentou como contribuição empírica a compreensão da atuação estratégica de PMEs que busca a internacionalização como uma forma de crescimento e desenvolvimento econômico

Biodepoisition - fill of pores with asperation of bacteria in mortar.

A busca por materiais sustentáveis e de desempenho semelhante ao cimento tem aumentado, visto as complicações ambientais causadas pela produção do material. Uma das opções de material “substituto” são os microrganismos produtores de uréase, capazes de precipitar carbonato de cálcio, responsável pela cristalização. Esses microrganismos podem ser utilizados de diferentes formas para aumentar a resistência de argamassas. A biodeposição é o processo de aspersão de uma solução bacteriana em corpos de prova endurecidos. Neste estudo foram realizadas aspersões semanais de solução bacteriana em amostras de argamassa, e deixadas outras amostras como referência, com aspersão apenas de água, com o objetivo de verificar se a precipitação de carbonato de cálcio produziria aumento na resistência da argamassa. Ao romper os exemplares à compressão e tração, verificou-se aumento significativo nos que tiveram adição de bactérias, indicando que houve preenchimento de poros.The search for sustainable materials and cement-like performance has increased, given the environmental complications caused by the production of the material. One of the options for "substitute" material is urea-producing microorganisms, capable of precipitating calcium carbonate, responsible for crystallization. These microorganisms can be used in different ways to increase the strength of mortars. Biodeposition is the process of sprinkling a bacterial solution on hardened test bodies. In this study, weekly spraying of bacterial solution on mortar samples was carried out, and other samples were left as reference, with only water spray, to verify if the precipitation of calcium carbonate would increase the resistance of the mortar. When breaking the specimens to compression and traction, there was a significant increase in those with bacteria addition, indicating that there was pore filling

Potencial antimicrobiano e caracterização fitoquímica de extratos da casca do caule de Drimys brasiliensis Miers (Winteraceae)

Introdução: na área da saúde, a resistência aos antimicrobianos tem se constituído um grave problema, fazendo com que a busca por alternativas farmacológicas assuma grande importância. Produtos de origem natural, como extratos de plantas, têm sido pesquisados para uso potencial no tratamento antibacteriano. Drimys brasiliensis Miers (Winteraceae) é uma árvore nativa do Brasil que tem sido utilizada como medicinal. Objetivo: investigar o perfil fitoquímico e a atividade antimicrobiana de amostras obtidas a partir de extratos da casca do caule de Drimys brasiliensis. Metodologia:  frações de características químicas variadas foram obtidas a partir de extratos da casca do caule da planta. Realizou-se o screening fitoquímico destas frações através de reações gerais de caracterização e cromatografia em camada delgada. As amostras foram testadas por difusão em ágar e por microdiluição contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas e contra uma levedura. Resultados: o perfil fitoquímico mostrou diferenças entre as frações analisadas. Alcaloides foram detectados nas frações mais apolares. Taninos e flavonoides estavam presentes nas amostras mais polares e obtidas sem o uso de calor. As amostras com maior atividade antimicrobiana foram as obtidas com os solventes hexano e diclorometano, de características mais apolares. Destaca-se a atividade contra Bacillus cereus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus resistente à meticilina e Candida albicans. Conclusão: extratos da casca do caule de Drimys brasiliensis apresentam potencial antimicrobiano, com destaque para as frações mais apolares contra bactérias gram positivas

COMPARAÇÃO DE BIOMASSA VEGETAL E ANIMAL EM BIOARGAMASSA

The use of microorganisms in liquid medium for the biocementation process, favors the continuity of bacterial growth. However, if it takes too long to use, it stops growing rapidly, leading to cell death. This study compared two forms of biomass production, capable of storing microorganisms in a latent state, maintaining viability for later use. Here we described the preparation of biomasses, made with organic materials and bacteria Sporosarcina pasteurii (CCT 0538 ATCC 1185). Animal (poultry manure) and vegetable (vetch - Vicia villosa Roth) biomasses were tested. Both biomasses maintained the viability of the microorganisms, and the vegetable was more efficient, presenting greater bacterial growth after revitalization. For testing, reference specimens were molded (without biomass) and also with each one of them, and after 28 days tested for traction and compression. The tensile strength showed an increase of 41.2% (animal biomass) and 44.7% (plant biomass). In the compressive strength, the increase was 37.8% (animal biomass) and 38.8% (vegetable biomass), compared to the reference mortar (without the addition of a microorganism)O uso de microrganismos em meio líquido para o processo de biocimentação, favorece a continuidade do crescimento bacteriano. Entretanto se este demora para ser usado, para de crescer rapidamente, levando a morte celular. Este estudo comparou duas formas de produção de uma biomassa, capaz de armazenar os microrganismos em estado de latência mantendo a viabilidade para posterior utilização. Aqui foi descrito o preparo de biomassas, feitas com materiais orgânicos e bactéria Sporosarcina pasteurii (CCT 0538 ATCC 1185). Foram testadas biomassas de origem animal (esterco de aves) e vegetal (ervilhaca - Vicia villosa Roth). Ambas biomassas mantiveram a viabilidade dos microrganismos, sendo que a vegetal foi mais eficiente apresentando maior crescimento bacteriano após a revitalização. Para teste foram moldados corpos de prova referência (sem biomassa) e também com cada uma delas, e depois de 28 dias ensaiados a tração e compressão. A resistência a tração apresentou um aumento de 41,2 % (biomassa animal) e de 44,7 % (biomassa vegetal). Na resistência a compressão o aumento foi de 37,8 % (biomassa animal) e de 38,8 % (biomassa vegetal), comparados a argamassa de referencia (sem adição de microrganismo)