Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate-mediated calcium signalling in effector T cells regulates autoimmunity of the central nervous system

Nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate represents a newly identified second messenger in T cells involved in antigen receptor-mediated calcium signalling. Its function in vivo is, however, unknown due to the lack of biocompatible inhibitors. Using a recently developed inhibitor, we explored the role of nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate in autoreactive effector T cells during experimental autoimmune encephalomyelitis, the animal model for multiple sclerosis. We provide in vitro and in vivo evidence that calcium signalling controlled by nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate is relevant for the pathogenic potential of autoimmune effector T cells. Live two photon imaging and molecular analyses revealed that nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate signalling regulates T cell motility and re-activation upon arrival in the nervous tissues. Treatment with the nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate inhibitor significantly reduced both the number of stable arrests of effector T cells and their invasive capacity. The levels of pro-inflammatory cytokines interferon-gamma and interleukin-17 were strongly diminished. Consecutively, the clinical symptoms of experimental autoimmune encephalomyelitis were ameliorated. In vitro, antigen-triggered T cell proliferation and cytokine production were evenly suppressed. These inhibitory effects were reversible: after wash-out of the nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate antagonist, the effector T cells fully regained their functions. The nicotinic acid derivative BZ194 induced this transient state of non-responsiveness specifically in post-activated effector T cells. Naïve and long-lived memory T cells, which express lower levels of the putative nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate receptor, type 1 ryanodine receptor, were not targeted. T cell priming and recall responses in vivo were not reduced. These data indicate that the nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate/calcium signalling pathway is essential for the recruitment and the activation of autoaggressive effector T cells within their target organ. Interference with this signalling pathway suppresses the formation of autoimmune inflammatory lesions and thus might qualify as a novel strategy for the treatment of T cell mediated autoimmune diseases

Transduktion in Olfaktorischen Rezeptorneuronen von Xenopus laevis Larven: Pharmakologische Inhibierung mit FM1-43 und Endocannabinerge Modulation

Der Geruchssinn ist essentiell für die Nahrungssuche und vermittelt darüber hinaus sowohl emotionale als auch soziale Reaktionen. Eine Störung des Geruchssinnes schlägt sich oft in Krankheiten nieder. In den letzten beiden Jahrzehnten wurden große Fortschritte in diesem Forschungsbereich gemacht und Erkenntnisse über die Geruchswahrnehmung gewonnen. Diese Arbeit behandelt zwei Themen der Grundlagenforschung in der Olfaktorik und ist wie folgt gegliedert:1. Im olfaktorischen Epithel existieren verschiedene Untergruppen von olfaktorischen Rezeptorneuronen. Eine Klassifizierung dieser Untergruppen kann anhand der Signaltransduktion von Duftstoffen vorgenommen werden: Eine Untergruppe olfaktorischer Rezeptorneurone nutzt die cAMP-abhängige Signalkaskade, um Duftstoffe in Depolarisationen zu transduzieren. Bis heute ist es nicht möglich, diese Neuronenuntergruppe zu färben oder mit potenten und spezifischen Blockern ihren Generatorkanal zu inhibieren. In dieser Arbeit wurde der Styrylfarbstoff FM1-43 als Marker dieser Untergruppe von Neuronen identifiziert, die eine cAMP-abhängige Transduktionsmaschinerie haben. Der Farbstoff wird durch zyklisch Nukleotid-gesteuerte Ionenkanäle, dem Generatorkanal dieser Untergruppe, aufgenommen. Dies wurde durch die Interferenz der Aufnahme von FM1-43 mit divalenten Kationen und hochkonzentrierten, unspezifischen Blockern des zyklisch Nukleotid-gesteuerten Kationenkanals belegt und weiter durch cAMP- und Forskolin-evozierte Antworten bei FM1-43 gefärbten Zellen bestätigt. Charakteristisch für FM1-43 gefärbte olfaktorische Rezeptorneurone ist, dass sie nicht auf Duftstoffe reagierten oder schnell ihre Empfindlichkeit verloren haben. Das deutet darauf hin, dass FM1-43 die Transduktionsmaschinerie gefärbter Neurone schwerwiegend beeinträchtigt. Tatsächlich erniedrigte FM1-43 Ströme durch native zyklisch Nukleotid-gesteuerte Kanäle auf etwa 25 % und wirkte dabei extrazellulär. Dieses Hilfsmittel erlaubt es folglich, olfaktorische Rezeptorneurone mit einer cAMP-abhängigen Signalkaskade optisch zu identifizieren und pharmakologisch auf der Transduktionsebene zu beeinflussen.2. Der Geruchsinn ist für die Nahrungssuche und die Nahrungsaufnahme von Bedeutung, die zugrundeliegenden Mechanismen für diese funktionale Interaktion sind jedoch nur wenig erforscht. Ein Schlüsselfaktor für die Energiehomöostase und Ernährung im zentralen Nervensystem stellt das Endocannabinoidsystem dar. Deshalb wurde die Hypothese aufgestellt, dass das Endocannabinoidsystem die Nahrungsaufnahme mit dem Geruchssinn verknüpft. Kürzlich wurde gezeigt, dass Cannabinoide im olfaktorischen Epithel eine Rolle spielen. Die pharmakologische Beeinflussung des entsprechenden Cannabinoidrezeptors moduliert Duftstoffantworten. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Endocannabinoid 2-AG im olfaktorischen Epithel synthetisiert wird und an olfaktorischen Rezeptorneuronen wirkt. Eine Inhibierung der 2-AG Synthese verkleinert und verzögert Duftstoff-induzierte Antworten. Eine Einzelzellanalyse ergab, dass es zwei 2-AG Quellen im olfaktorischen Epithel gibt: eine ist in den Rezeptorneuronen und Diacylglycerollipase β-abhängig, die andere ist in Stützzellen lokalisiert und Diacylglycerollipase α-abhängig. Die Diacylglycerollipase α vermittelte 2-AG Synthese in Stützzellen wird vom Hungerzustand von Tieren gesteuert. Der wesentliche Effekt von 2-AG ist die Regulierung der Detektionsschwelle von Duftstoffen. Erhöhte 2-AG Konzentrationen verringern die Detektionsschwelle einzelner Rezeptorneurone, wohingegen niedrige 2-AG Konzentrationen die Detektionsschwelle steigern. Folglich werden Rezeptorneurone durch Hunger sensitiver und eine Endocannabinoid-vermittelte Modulationen könnte deshalb die Nahrungssuche wesentlich beeinflussen. Der intrazelluläre Effektor des Cannabinoidrezeptors könnte die Plasmamembran-Calcium ATPase sein. Diese Signalkaskade wurde bis jetzt noch nicht beschrieben. Zukünftige Experimente sollen die zugrundeliegende Transduktionkaskade näher charakterisieren. Neben dem Endocannabinoidsystem wurden im olfaktorischen Epithel auch Rezeptoren für andere modulierende Substanzen wie Orexin, Leptin, Adiponektin, und Dopamin gefunden. Das deutet darauf hin, dass die Wahrnehmung von Duftstoffen schon auf peripher Ebene von vielen Substanzen moduliert wird

Cannabis users show enhanced expression of CB1-5HT2A receptor heteromers in olfactory neuroepithelium cells

Cannabinoid CB1 receptors (CB1R) and serotonergic 2A receptors (5HT2AR) form heteromers in the brain of mice where they mediate the cognitive deficits produced by delta-9-tetrahydrocannabinol. However, it is still unknown whether the expression of this heterodimer is modulated by chronic cannabis use in humans. In this study, we investigated the expression levels and functionality of CB1R-5HT2AR heteromers in human olfactory neuroepithelium (ON) cells of cannabis users and control subjects, and determined their molecular characteristics through adenylate cyclase and the ERK 1/2 pathway signaling studies. We also assessed whether heteromer expression levels correlated with cannabis consumption and cognitive performance in neuropsychological tests. ON cells from controls and cannabis users expressed neuronal markers such as βIII-tubulin and nestin, displayed similar expression levels of genes related to cellular self-renewal, stem cell differentiation, and generation of neural crest cells, and showed comparable Na+ currents in patch clamp recordings. Interestingly, CB1R-5HT2AR heteromer expression was significantly increased in cannabis users and positively correlated with the amount of cannabis consumed, and negatively with age of onset of cannabis use. In addition, a negative correlation was found between heteromer expression levels and attention and working memory performance in cannabis users and control subjects. Our findings suggest that cannabis consumption regulates the formation of CB1R-5HT2AR heteromers, and may have a key role in cognitive processing. These heterodimers could be potential new targets to develop treatment alternatives for cognitive impairments.This work was supported by grants from DIUE de la Generalitat de Catalunya (2014-SGR-680 and 2014-SGR-1236 to RTF), Instituto de Salud Carlos III, (P14/00210 to P.R.) FIS-FEDER Funds, Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO/FEDER; grant SAF-2014-54840-R to E.I.C. and V.C., grant SAF-2015-69762-R to J.M.F-F., grant MDM-2014-0370 through the “María de Maeztu” Programme for Units of Excellence in R&D to Department of Experimental and Health Sciences), and the following networks of Instituto de Salud Carlos III: Red de Trastornos Adictivos, CIBER de Salud Mental, CIBER de Fisiopatología de la Obesidad y Nutrición and CIBER de Enfermedades Neurodegenerativas. M.I.-S. holds a “Juan de la Cierva-Formación” Fellowship funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness. We would like to thank Dr. María Inmaculada Hernández Muñoz for providing the primers in our gene expression studies and for her invaluable comments and suggestions, Klaus Langohr for his help with the statistical analyses, and Jordi García and Mitona Pujadas for excellent technical assistance. Laura Xicota is currently at ICM Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (CNRS UMR7225, INSERM U1127, UPMC) Hôpital de la PitiéSalpêtrière, Paris, France