Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

Effects of hospital facilities on patient outcomes after cancer surgery: an international, prospective, observational study

Background Early death after cancer surgery is higher in low-income and middle-income countries (LMICs) compared with in high-income countries, yet the impact of facility characteristics on early postoperative outcomes is unknown. The aim of this study was to examine the association between hospital infrastructure, resource availability, and processes on early outcomes after cancer surgery worldwide.Methods A multimethods analysis was performed as part of the GlobalSurg 3 study-a multicentre, international, prospective cohort study of patients who had surgery for breast, colorectal, or gastric cancer. The primary outcomes were 30-day mortality and 30-day major complication rates. Potentially beneficial hospital facilities were identified by variable selection to select those associated with 30-day mortality. Adjusted outcomes were determined using generalised estimating equations to account for patient characteristics and country-income group, with population stratification by hospital.Findings Between April 1, 2018, and April 23, 2019, facility-level data were collected for 9685 patients across 238 hospitals in 66 countries (91 hospitals in 20 high-income countries; 57 hospitals in 19 upper-middle-income countries; and 90 hospitals in 27 low-income to lower-middle-income countries). The availability of five hospital facilities was inversely associated with mortality: ultrasound, CT scanner, critical care unit, opioid analgesia, and oncologist. After adjustment for case-mix and country income group, hospitals with three or fewer of these facilities (62 hospitals, 1294 patients) had higher mortality compared with those with four or five (adjusted odds ratio [OR] 3.85 [95% CI 2.58-5.75]; p&lt;0.0001), with excess mortality predominantly explained by a limited capacity to rescue following the development of major complications (63.0% vs 82.7%; OR 0.35 [0.23-0.53]; p&lt;0.0001). Across LMICs, improvements in hospital facilities would prevent one to three deaths for every 100 patients undergoing surgery for cancer.Interpretation Hospitals with higher levels of infrastructure and resources have better outcomes after cancer surgery, independent of country income. Without urgent strengthening of hospital infrastructure and resources, the reductions in cancer-associated mortality associated with improved access will not be realised

Multiancestry analysis of the HLA locus in Alzheimer’s and Parkinson’s diseases uncovers a shared adaptive immune response mediated by HLA-DRB1*04 subtypes

Across multiancestry groups, we analyzed Human Leukocyte Antigen (HLA) associations in over 176,000 individuals with Parkinson’s disease (PD) and Alzheimer’s disease (AD) versus controls. We demonstrate that the two diseases share the same protective association at the HLA locus. HLA-specific fine-mapping showed that hierarchical protective effects of HLA-DRB1*04 subtypes best accounted for the association, strongest with HLA-DRB1*04:04 and HLA-DRB1*04:07, and intermediary with HLA-DRB1*04:01 and HLA-DRB1*04:03. The same signal was associated with decreased neurofibrillary tangles in postmortem brains and was associated with reduced tau levels in cerebrospinal fluid and to a lower extent with increased Aβ42. Protective HLA-DRB1*04 subtypes strongly bound the aggregation-prone tau PHF6 sequence, however only when acetylated at a lysine (K311), a common posttranslational modification central to tau aggregation. An HLA-DRB1*04-mediated adaptive immune response decreases PD and AD risks, potentially by acting against tau, offering the possibility of therapeutic avenues

Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

Optimierung der Transportbedingungen von mesenchymalen Stromazellen für die klinisch-therapeutische Anwendung am Pferd

Einleitung: Mesenchymale Stromazellen (MSC) werden zunehmend für klinische Anwendungen bei Pferdepatienten eingesetzt. Für die MSC-Isolation und Expansion ist ein Laborschritt obligatorisch, danach werden die Zellen an den teilnehmenden Tierarzt zurückgesandt. Die Erhaltung der biologischen Eigenschaften von MSCs bzw. die Erhaltung der Qualität der MSCs ist für den Erfolg der Therapie während dieses Transports von größter Bedeutung. Ziele der Untersuchung: Das Ziel der Studie war es, transportbezogene Parameter (Transportbehälter, Medien, Temperatur, Zeit, Zellkonzentration) zu vergleichen, die potenziell Einfluss auf die Eigenschaften der in Kultur expandierten MSC während des Transportes in Suspension haben können. Material und Methoden: Diese Studie wurde in drei Teile geteilt, in welchen (I) fünf verschiedene Transportbehälter (Kryotube, zwei Arten von Plastikspritzen, Glasspritze, CellSeal), (II) sieben verschiedene Transportmedien, vier Temperaturen (4 °C gegen Raumtemperatur, - 20 °C vs. - 80 °C), zwei verschiedene Zeitrahmen (24 h gegen 48 h im positiven Temperaturbereich, 48 h gegen 72 h im negativen Temperaturbereich) und (III) drei MSC-Konzentrationen (5 x 106, 10 x 106, 20 x 106 MSC/ml) für den positiven und negativen Temperaturbereich verglichen wurden. Jeder Teil der Studie wurde unter Verwendung von Proben von sechs Pferden (n = 6) ausgewertet und Differenzierungsprotokolle (adipogene, osteogene und chondrogene) sowie Untersuchung der Vitalität und Proliferationsfähigkeit der MSC wurden für jeden Teil der Studie in doppeltem Einsatz bzw. verdoppelt bestimmt. Die Ergebnisse wurden als Median und mittlerer Interquartilabstand (IQR) dargestellt (p ≤ 0,05). Eine Anpassung des Signifikanzniveaus bei multiplen Vergleichen wurde mittels Bonferroni- Korrektur durchgeführt. Die Überprüfung der Daten auf Normalverteilung erfolgte mittels Shapiro- Wilk-Test. Ergebnisse: In Teil I der Studie lieferten die Spritzenmodelle die höheren Werte hinsichtlich des Endvolumens und gleichzeitig erzielte die Glasspritze die beste Zellvitalität. Dieser Behälter wurde für die nachfolgenden Teile der Studie ausgewählt. In Teil II der Studie wurde die höchste Zelllebensfähigkeit mit autologen Knochenmarküberständen als Transportmedium bei 4 °C für 24 h beobachtet (70,6 % gegenüber der Kontrollgruppe 75,3 %). Im Gegensatz dazu war die Lebensfähigkeit für alle Gefrierprotokolle bei -20 °C oder -80 °C, insbesondere bei Knochenmarküberstand oder Plasma und DMSO, unannehmbar niedrig (< 40 %). In Teil III der Studie zeigten die untersuchte Zellkonzentrationen keinen Einfluss auf die ausgewerteten Parameter. Diskussion: In dieser Studie wurden keine signifikanten Unterschiede festgestellt, möglicherweise war dies durch die hohe Anzahl von Transportbedingungen, welche gleichzeitig verglichen wurden, sowie die Anzahl der Stichproben (n=6) bedingt. Jedoch ergaben sich wichtige Hinweise zur Verbesserung des Transports der MSC für die klinisch-therapeutische Anwendung. Eine Einschränkung der chondrogenen Differenzierungsfähigkeit der MSC trat unter allen untersuchten Bedingungen auf. Im Vergleich zu früheren Pferdestudien wurde eine niedrigere Lebensfähigkeit der MSC nach dem Auftauen beobachtet. Mögliche Ursachen können unterschiedliche Protokolle beim Einfrieren und Auftauen der MSC sowie die große Anzahl an gleichzeitig bearbeiteten Proben sein. Zukünftige Studien könnten die möglicherweise negativen Auswirkungen des Transports auf die chondrogene Differenzierung klären. Schlussfolgerung: Trotz fehlender signifikanter Unterschiede ist eine deutliche Tendenz erkennbar, dass MSC aus dem Knochenmark schnellstmöglich bei 4 °C in autologem bzw. eigenem Knochenmark-Überstand aus dem Labor zum Patienten, in dem in dieser Studie untersuchten Glasspritzenmodell, zurückgesandt werden sollten.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ...................................................................................................................1 2 Literaturübersicht ......................................................................................................2 2.1 Der Ursprung mesenchymaler Stromazellen .........................................................2 2.2 Klassifizierung der MSC .........................................................................................3 2.3 Charakterisierung der MSC ....................................................................................4 2.4 Quellen von MSC ...................................................................................................4 2.5 Ablauf der MSC-Therapie beim Pferd ....................................................................4 2.6 Empfehlungen der EMA zur klinisch-therapeutischen Anwendung zellbasierter Therapien ..........................................................................................6 2.7 Rechtliche Aspekte ................................................................................................7 2.8 Tetrazoliumsalze zur Bestimmung der Zellaktivität (WST-1-Reagenztest) .............9 2.9 Zielstellung dieser Arbeit.......................................................................................10 2.10 Hypothese dieser Arbeit......................................................................................10 3 Material und Methoden............................................................................................11 3.1 Versuchspferde ....................................................................................................11 3.2 Allgemeine Schritte für die gesamte Studie ........................................................11 3.2.1 Knochenmarkentnahme beim Pferd .................................................................11 3.2.2 Blutentnahme beim Pferd ..................................................................................13 3.2.3 Probenverarbeitung und Zellkultur ....................................................................13 3.2.4 Isolation der MSC ..............................................................................................14 3.2.5 Bestimmung der Zellzahl ...................................................................................15 3.2.6 Expansion der MSC ..........................................................................................16 3.2.7 Kryokonservierung ............................................................................................16 3.2.8 Auftauen der MSC ............................................................................................16 3.2.9 Bestimmung der Zellvitalität .............................................................................17 3.2.10 Kumulative Populationsverdopplungen (kPV) der MSC ..................................18 3.2.11 Differenzierungspotentiale der MSC ...............................................................18 3.2.11.1 Differenzierung in Monolayer-Zellkultur für die adipogene und osteogene Linie ............................................................................................................................19 3.2.11.1.1 Adipogene Differenzierung ........................................................................19 3.2.11.1.2 Osteogene Differenzierung ........................................................................22 3.2.11.2 Chondrogene Differenzierung (dreidimensionales Modell) ...........................25 3.3 Studiendesign – allgemeine Darstellung ..............................................................32 3.3.1 Teil 1: Untersuchung zur Ermittlung des optimalen Transportbehälters ...........33 3.3.1.1 Studiendesign zum ersten Teil der Studie ......................................................33 3.3.1.2 Zeit0: Vorbereitung der Kontrolle ...................................................................33 3.3.1.3 Zeit0: Vorbereitung der Versuchsbedingungen nach 24 Stunden .................34 3.3.1.4 Transportbehälter ......................................................................................... 34 3.3.1.5 Zeit1: Auswertung der Transportbehälter nach 24 Stunden Inkubationszeit 35 3.3.2 Teil 2: Untersuchung zum optimalen Verhältnis von Medium-Temperatur-Zeit 36 3.3.2.1 Studiendesign zum zweiten Teil der Studie ................................................. 36 3.3.2.2 Untersuchungsbedingungen .........................................................................37 3.3.2.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ........................ 37 3.3.3 Teil 3: Untersuchung zur optimalen Zellkonzentration ..................................... 38 3.3.3.1 Studiendesign zum dritten Teil der Studie .................................................... 38 3.3.3.2 Untersuchungsbedingungen ......................................................................... 39 3.3.3.3 Auswertung der Kontrolle und der Konditionsbedingungen ......................... 39 3.4 Statistische Auswertung ..................................................................................... 40 4 Ergebnisse ............................................................................................................. 41 4.1 Teil 1: Behälter .................................................................................................... 41 4.1.1 Evaluierung der Endvolumen pro Behälter ....................................................... 41 4.1.2 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 42 4.1.2.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 42 4.1.2.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 43 4.1.3 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 44 4.1.4 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 45 4.1.4.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 45 4.1.4.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 47 4.1.4.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 49 4.2 Teil 2: Medium, Temperatur und Zeit .................................................................. 53 4.2.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 53 4.2.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 53 4.2.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 54 4.2.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 56 4.2.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 58 4.2.3.1 Adipogene Differenzierung ............................................................................ 58 4.2.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 59 4.2.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 61 4.3 Teil 3: Zellkonzentration ...................................................................................... 64 4.3.1 Evaluierung der Zellvitalität .............................................................................. 64 4.3.1.1 Evaluierung der Zellvitalität durch Trypanblau-Färbung ................................ 64 4.3.1.2 Evaluierung der Zellvitalität durch WST-1-Reagenztest ................................ 65 4.3.2 Proliferationsverhalten der MSC ...................................................................... 66 4.3.3 Evaluierung des Differenzierungspotentials der MSC ...................................... 67 4.3.3.1 Adipogene Differenzierung .......................................................................... 67 4.3.3.2 Osteogene Differenzierung ............................................................................ 69 4.3.3.3 Chondrogene Differenzierung ....................................................................... 71 5 Diskussion .............................................................................................................. 74 5.1 Zielsetzung der geplanten Durchführung ............................................................ 74 5.2 Diskussion zum Material ..................................................................................... 75 5.3 Vorversuche ........................................................................................................ 76 5.3.1 Inkubationsbedingungen ................................................................................. 76 5.3.2 Sechster Behälter ............................................................................................. 76 5.3.3 WST-1-Reagenztest ......................................................................................... 77 5.3.4 Adipogene Differenzierung ............................................................................... 77 5.3.5 Chondrogene Differenzierung .......................................................................... 78 5.3.6 Kryokonservierungsmedium in der Pferdereproduktionsmedizin..................... 79 5.3.7 Die Auswirkung von Druck auf die Zellmembran ............................................. 80 5.4 Diskussion der Ergebnisse und Vergleich mit der Literatur ................................ 80 5.4.1 Diskussion des ersten Teils der Studie............................................................. 80 5.4.2 Diskussion des zweiten Teils der Studie........................................................... 82 5.4.3 Diskussion des dritten Teils der Studie............................................................. 87 5.4.4 Schlussfolgerungen ..........................................................................................87 6 Zusammenfassung ................................................................................................ 89 7 Summary ............................................................................................................... 91 8 Literaturverzeichnis ................................................................................................ 9

Global variation in postoperative mortality and complications after cancer surgery: a multicentre, prospective cohort study in 82 countries

Background: 80% of individuals with cancer will require a surgical procedure, yet little comparative data exist on early outcomes in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared postoperative outcomes in breast, colorectal, and gastric cancer surgery in hospitals worldwide, focusing on the effect of disease stage and complications on postoperative mortality. Methods: This was a multicentre, international prospective cohort study of consecutive adult patients undergoing surgery for primary breast, colorectal, or gastric cancer requiring a skin incision done under general or neuraxial anaesthesia. The primary outcome was death or major complication within 30 days of surgery. Multilevel logistic regression determined relationships within three-level nested models of patients within hospitals and countries. Hospital-level infrastructure effects were explored with three-way mediation analyses. This study was registered with ClinicalTrials.gov, NCT03471494. Findings: Between April 1, 2018, and Jan 31, 2019, we enrolled 15 958 patients from 428 hospitals in 82 countries (high income 9106 patients, 31 countries; upper-middle income 2721 patients, 23 countries; or lower-middle income 4131 patients, 28 countries). Patients in LMICs presented with more advanced disease compared with patients in high-income countries. 30-day mortality was higher for gastric cancer in low-income or lower-middle-income countries (adjusted odds ratio 3·72, 95% CI 1·70–8·16) and for colorectal cancer in low-income or lower-middle-income countries (4·59, 2·39–8·80) and upper-middle-income countries (2·06, 1·11–3·83). No difference in 30-day mortality was seen in breast cancer. The proportion of patients who died after a major complication was greatest in low-income or lower-middle-income countries (6·15, 3·26–11·59) and upper-middle-income countries (3·89, 2·08–7·29). Postoperative death after complications was partly explained by patient factors (60%) and partly by hospital or country (40%). The absence of consistently available postoperative care facilities was associated with seven to 10 more deaths per 100 major complications in LMICs. Cancer stage alone explained little of the early variation in mortality or postoperative complications. Interpretation: Higher levels of mortality after cancer surgery in LMICs was not fully explained by later presentation of disease. The capacity to rescue patients from surgical complications is a tangible opportunity for meaningful intervention. Early death after cancer surgery might be reduced by policies focusing on strengthening perioperative care systems to detect and intervene in common complications. Funding: National Institute for Health Research Global Health Research Unit

Common variants in Alzheimer’s disease and risk stratification by polygenic risk scores

Genetic discoveries of Alzheimer’s disease are the drivers of our understanding, and together with polygenetic risk stratification can contribute towards planning of feasible and efficient preventive and curative clinical trials. We first perform a large genetic association study by merging all available case-control datasets and by-proxy study results (discovery n = 409,435 and validation size n = 58,190). Here, we add six variants associated with Alzheimer’s disease risk (near APP, CHRNE, PRKD3/NDUFAF7, PLCG2 and two exonic variants in the SHARPIN gene). Assessment of the polygenic risk score and stratifying by APOE reveal a 4 to 5.5 years difference in median age at onset of Alzheimer’s disease patients in APOE ɛ4 carriers. Because of this study, the underlying mechanisms of APP can be studied to refine the amyloid cascade and the polygenic risk score provides a tool to select individuals at high risk of Alzheimer’s disease

Global variation in postoperative mortality and complications after cancer surgery: a multicentre, prospective cohort study in 82 countries

© 2021 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an Open Access article under the CC BY-NC-ND 4.0 licenseBackground: 80% of individuals with cancer will require a surgical procedure, yet little comparative data exist on early outcomes in low-income and middle-income countries (LMICs). We compared postoperative outcomes in breast, colorectal, and gastric cancer surgery in hospitals worldwide, focusing on the effect of disease stage and complications on postoperative mortality. Methods: This was a multicentre, international prospective cohort study of consecutive adult patients undergoing surgery for primary breast, colorectal, or gastric cancer requiring a skin incision done under general or neuraxial anaesthesia. The primary outcome was death or major complication within 30 days of surgery. Multilevel logistic regression determined relationships within three-level nested models of patients within hospitals and countries. Hospital-level infrastructure effects were explored with three-way mediation analyses. This study was registered with ClinicalTrials.gov, NCT03471494. Findings: Between April 1, 2018, and Jan 31, 2019, we enrolled 15 958 patients from 428 hospitals in 82 countries (high income 9106 patients, 31 countries; upper-middle income 2721 patients, 23 countries; or lower-middle income 4131 patients, 28 countries). Patients in LMICs presented with more advanced disease compared with patients in high-income countries. 30-day mortality was higher for gastric cancer in low-income or lower-middle-income countries (adjusted odds ratio 3·72, 95% CI 1·70–8·16) and for colorectal cancer in low-income or lower-middle-income countries (4·59, 2·39–8·80) and upper-middle-income countries (2·06, 1·11–3·83). No difference in 30-day mortality was seen in breast cancer. The proportion of patients who died after a major complication was greatest in low-income or lower-middle-income countries (6·15, 3·26–11·59) and upper-middle-income countries (3·89, 2·08–7·29). Postoperative death after complications was partly explained by patient factors (60%) and partly by hospital or country (40%). The absence of consistently available postoperative care facilities was associated with seven to 10 more deaths per 100 major complications in LMICs. Cancer stage alone explained little of the early variation in mortality or postoperative complications. Interpretation: Higher levels of mortality after cancer surgery in LMICs was not fully explained by later presentation of disease. The capacity to rescue patients from surgical complications is a tangible opportunity for meaningful intervention. Early death after cancer surgery might be reduced by policies focusing on strengthening perioperative care systems to detect and intervene in common complications. Funding: National Institute for Health Research Global Health Research Unit

Effects of hospital facilities on patient outcomes after cancer surgery: an international, prospective, observational study

© 2022 The Author(s). Published by Elsevier Ltd. This is an Open Access article under the CC BY 4.0 licenseBackground: Early death after cancer surgery is higher in low-income and middle-income countries (LMICs) compared with in high-income countries, yet the impact of facility characteristics on early postoperative outcomes is unknown. The aim of this study was to examine the association between hospital infrastructure, resource availability, and processes on early outcomes after cancer surgery worldwide. Methods: A multimethods analysis was performed as part of the GlobalSurg 3 study—a multicentre, international, prospective cohort study of patients who had surgery for breast, colorectal, or gastric cancer. The primary outcomes were 30-day mortality and 30-day major complication rates. Potentially beneficial hospital facilities were identified by variable selection to select those associated with 30-day mortality. Adjusted outcomes were determined using generalised estimating equations to account for patient characteristics and country-income group, with population stratification by hospital. Findings: Between April 1, 2018, and April 23, 2019, facility-level data were collected for 9685 patients across 238 hospitals in 66 countries (91 hospitals in 20 high-income countries; 57 hospitals in 19 upper-middle-income countries; and 90 hospitals in 27 low-income to lower-middle-income countries). The availability of five hospital facilities was inversely associated with mortality: ultrasound, CT scanner, critical care unit, opioid analgesia, and oncologist. After adjustment for case-mix and country income group, hospitals with three or fewer of these facilities (62 hospitals, 1294 patients) had higher mortality compared with those with four or five (adjusted odds ratio [OR] 3·85 [95% CI 2·58–5·75]; p<0·0001), with excess mortality predominantly explained by a limited capacity to rescue following the development of major complications (63·0% vs 82·7%; OR 0·35 [0·23–0·53]; p<0·0001). Across LMICs, improvements in hospital facilities would prevent one to three deaths for every 100 patients undergoing surgery for cancer. Interpretation: Hospitals with higher levels of infrastructure and resources have better outcomes after cancer surgery, independent of country income. Without urgent strengthening of hospital infrastructure and resources, the reductions in cancer-associated mortality associated with improved access will not be realised. Funding: National Institute for Health and Care Research