Protein foszfatáz gének genetikai és molekuláris biológiai vizsgálata Drosophila melanogaster-ben = Genetic and molecular biological characterization of protein phosphatase genes in Drosophila melanogaster

A Drosophila melanogaster protein foszfatáz génjeinek tanulmányozásához genomikus adatbázis kutatás alapján több gént választottunk ki, amelyekre a közelben található P-elemek remobilizálásával mutációkat indukáltunk. Az indukált mutációk genetikai és molekuláris vizsgálatával következtettünk a gének funkciójára. Megállapítottuk, hogy a CG9238 gén mutációja sejtletalitást eredményez, és a glikogén-anyagcserét gátolja. A CG9238 genetikai kölcsönhatásban van az ovoD génnel. Kimutattuk, hogy a CG15031 gén terméke, amit PPYR1-nek neveztünk el, a PPY protein foszfatázzal stabil fehérje-fehérje komplexet alkot. A PPYR1-nek két izoformája van, amelyek expressziója eltérő szövetspecifitást mutat. A maternális eredetű izoforma a petekamrákban és a korai embriókban található, míg a zigótikus fehérje csak a herékben fordul elő. A PPYR1 eredendően rendezetlen szerkezetét és RNS-kötő képességét in vitro kísérletekben igazoltuk. A protein foszfatázokkal együtt a jelátviteli utakban résztvevő más géneket is megvizsgáltunk. Kimutattuk a Myo31DF szerepét a bal-jobb aszimmetria kialakulásában. Meghatároztuk egy 26S proteaszóma alegység lokalizációját és igazoltuk sejtmagba történő vándorlását. Megállapítottuk, hogy a filamin-240 fehérje gátolja a lamellociták differenciálódását. Kísérleteink igazolták a klasszikus és molekuláris genetikai módszerek együttes alkalmazásának előnyeit az ecetmuslica funkcionális genomikai kutatásában. | Based on genomic database searches we selected several Drosophila melanogaster protein phosphatase genes which have adjacent P-element insertion in order to induce loss of function mutations by the remobilization of the P-elements. Genetic and molecular biological approaches were used to study the functions of selected genes. We found that mutations in CG9238 gene result in cell autonomous lethality and the inhibition of glycogen metabolism. CG9238 interacts genetically with the ovoD gene. We discovered that the gene product of CG15031 (termed PPYR1) forms a stable protein-protein complex with the PPY protein phosphatase. PPYR1 has two different isoforms which exhibit different tissue specific expression patterns. The maternal isoform was detected in the egg chambers and early embryos, while the zygotic protein was located exclusively in the testes. The intrinsically unstructured nature and RNA binding capacity of PPYR1 was shown by in vitro experiments. In addition to the phosphatases we studied several genes which also play important roles in signal transduction. We proved the function of Myo31DF in the determination of left-right asymmetry. The localization of a 26S proteasome subunit was determined and its nuclear translocation was demonstrated. We described the inhibition of lamellocyte differentiation by filamine-240. Collectively, our results indicate the power of the combination of classical and molecular genetic approaches in the functional genetic studies of fruit flies

Separation of 1–23-kb complementary DNA strands by urea–agarose gel electrophoresis

Double-stranded (ds), as well as denatured, single-stranded (ss) DNA samples can be analyzed on urea–agarose gels. Here we report that after denaturation by heat in the presence of 8 M urea, the two strands of the same ds DNA fragment of ∼1–20-kb size migrate differently in 1 M urea containing agarose gels. The two strands are readily distinguished on Southern blots by ss-specific probes. The different migration of the two strands could be attributed to their different, base composition-dependent conformation impinging on the electrophoretic mobility of the ss molecules. This phenomenon can be exploited for the efficient preparation of strand-specific probes and for the separation of the complementary DNA strands for subsequent analysis, offering a new tool for various cell biological research areas

PP2B and ERK1/2 regulate hyaluronan synthesis of HT168 and WM35 human melanoma cell lines

Hyaluronan (HA) is the major glycosaminoglycan component of the extracellular matrix in either normal or malignant tissues and it may affect proliferation, motility and differentiation of various cell types. Three isoforms of plasma membrane-bound hyaluronan synthases (HAS 1, 2 and 3) secrete and simultaneously bind pericellular HA. HAS enzymes are subjects of post-translational protein phosphorylation which is believed to regulate their enzymatic activity. In this study, we investigated the HA homeostasis of normal human epidermal melanocytes, HT168 and WM35 human melanoma cell lines and melanoma metastases. HAS2 and HAS3 were detected in all the samples, while the expression of HAS1 was not detectable in any case. Malignant tissue samples and melanoma cell lines contained extra- and intracellular HA abundantly but not normal melanocytes. Applying HA as a chemoattractant facilitated the migration of melanoma cells in Boyden chamber. The amount of HA was reduced upon the inhibition of calcineurin with cyclosporine A (CsA), while the inhibition of ERK1/2 with PD098059 elevated it in both cell lines. The signals of Ser/Thr phosphoproteins at 57 kD were stronger after CsA treatment, while a markedly weaker signal was detected upon inhibition of the MAPK pathway. Our results suggest opposing effects of the two investigated enzymes on the HA homeostasis of melanoma cells. We propose that the dephosphorylation of HAS enzymes targeted by PP2B augments HA production, while their phosphorylation by the activity of MAPK pathway reduces HA synthesis. As the expression of the HA receptor RHAMM was also significantly enhanced by PD098059, the MAPK pathway exerted a complex attenuating effect on HA signalling in the investigated melanoma cells. This observation suggests that the application of MAPK-ERK pathway inhibitors requires a careful therapeutic design in melanoma treatment

Cathepsin D interacts with adenosine A2A receptors in mouse macrophages to modulate cell surface localization and inflammatory signaling

Adenosine A(2A) receptor (A(2A)R)-dependent signaling in macrophages plays a key role in the regulation of inflammation. However, the processes regulating A(2A)R targeting to the cell surface and degradation in macrophages are incompletely understood. For example, the C-terminal domain of the A(2A)R and proteins interacting with it are known to regulate receptor recycling, although it is unclear what role potential A(2A)R-interacting partners have in macrophages. Here, we aimed to identify A(2A)R-interacting partners in macrophages that may effect receptor trafficking and activity. To this end, we performed a yeast two-hybrid screen using the C-terminal tail of A(2A)R as the bait and a macrophage expression library as the prey. We found that the lysosomal protease cathepsin D (CtsD) was a robust hit. The A(2A)R-CtsD interaction was validated in vitro and in cellular models, including RAW 264.7 and mouse peritoneal macrophage (IPM) cells. We also demonstrated that the A(2A)R is a substrate of CtsD and that the blockade of CtsD activity increases the density and cell surface targeting of A(2A)R in macrophages. Conversely, we demonstrate that A(2A)R activation prompts the maturation and enzymatic activity of CtsD in macrophages. In summary, we conclude that CtsD is a novel A(2A)R-interacting partner and thus describe molecular and functional interplay that may be crucial for adenosine-mediated macrophage regulation in inflammatory processes

Jelfeldolgozás a sejtben: a kalpain és protein kináz rendszerek és kölcsönhatásaik = Intracellular signal processing: the calpain and protein kinase/phosphatase systems, and their interactions

1. Bizonyítottuk, hogy a kalpain B aktív és inaktív formája foszforilálható PKA, ERK1 és ERK2 kinázokkal, azonosítottuk az in vitro foszforilációs helyeket, és meghatároztuk a foszforilált fehérje megváltozott enzimológiai paramétereit. 2. Előállítottuk az összes Drosophila kalpain elleni antitestet. 3. Kidolgoztunk egy háromdimenziós elektroforetikus eljáráson alapuló, in vivo szubsztrát azonosításra használható módszert, amelynek segítségével számos kalpain szubsztrátot azonosítottunk. 4. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain szubsztrátot, amely a jelenleg ismert szubsztrátok közül a legérzékenyebb. 5. Kifejlesztettünk egy sejtpenetráns, szintetikus kalpain-aktiváló peptid párt, amely a kalpainok sejten belüli, calcium-mentes és specifikus aktiválására képes. 6. Kimutattuk, hogy patkány hippokampális agyszeletekben a kalpainok specifikus aktiválása az alap-ingerlékenység és az LTP szignifikáns növekedését idézi elő. 7. Kalpain A, kalpain B és kalpain A/B mutáns Drosophila vonalakat állítottunk elő. Elemeztük a fehérjék expresszióját vad és mutáns vonalakban, továbbá vizsgáltuk a fenotípusra gyakorolt hatásukat. A kalpain B fehérjéről megállapítottuk, hogy fontos szerepet játszik a határsejtek vándorlásában. 8. Drosophila kalpain interferencia vonalakat állítottunk elő: a kalpain B csendesített vonalak egyedei csökkent fertilitásúak voltak, a kettős mutánsok szintetikus szemiletalitást mutattak. A kalpain C hiánya letalitást okozott. | 1. We provided evidence that both the active and inactive forms of calpain B can be phosphorylated by PKA, ERK1 and ERK2. Phosphorylation sites were localized and the enzymological parameters of the modified enzymes were determined. 2. Antibodies have been generated against all forms of Drosophila calpain. 3. A new three-dimensional electrophoresis method has been developed to identify calpain substrates in vivo. Several novel substrates have been identified. 4. A synthetic, cell-permeable synthetic calpain susbtrate has been developed. This compound is more sensitive to the enzyme than any other known calpain substrate. 5. A peptide pair capable of calpain activation have also been developed. These sythetic peptides can penetrate cells and activate the enzyme in a calcium-independent manner. 6. It has been shown that specific activation of calpain(s) leads to a significantly incerased basal excitability and long-term potentiation (LTP) in rat hippocampal slices. 7. Drosophila lines mutant in calpain A, calpain B and calpain A/B have been generated. The effect of changes in calpain expression on phenotype was tested and it was found that calpain B plays a major role in regulating the migration of border cells. 8. Interference strains of Drosophila have also been generated. We found that silencing calpain B causes reduced fertility whereas double mutation causes synthetic semilethality. Calpain C deficit was found to be lethal

Endogenous single-strand DNA breaks at RNA polymerase II promoters in <i>Saccharomyces cerevisiae</i>

K

Functional analysis of Novel Protein Phosphatases in Drosophilia Melanogaster

A PPY és PPN Drosophila specifikus, új típusú protein foszfatázok. Leírták az őket kódoló géneket és vannak adatok a génről átíródó fehérjékre vonatkozóan is, de biológiai szerepük eddig még ismeretlen. Nem ismerjük ezen új típusú protein foszfatázok kölcsönható fehérjéit sem, amelyek funkciójából következtetni lehetne az enzimek szerepére. Előkísérleteink során élesztő két-hibrid módszerrel azonosítottunk öt, a PPY-nal, és egy, a PPN-nel kölcsönható fehérjét. További vizsgálatainkban az egyik PPY-nal kölcsönható fehérjét, a PPYR1-et vizsgáltuk meg részletesebben. A PPY és a PPYR1 specifikus kapcsolódását több független módszerrel: immunprecipitációval, “pull-down” kísérlettel és felületi plazmon rezonanciával is alátámasztottuk. SDS-PAGE során mutatott anomáliás mozgékonysága, CD-spektruma, proteázok iránti érzékenysége és hőstabilitása arra utal, hogy a rekombináns PPYR1 az eredendően rendezetlen szerkezetű fehérjék közé tartozik. A PPYR1 aminosav sorrendje alapján 40% homológiát mutat a PAI-1 mRNS-kötő fehérjékkel. Kísérleteink igazolták a PPYR1 in vitro RNS-kötő képességét. A PPYR1 tartalmaz egy protein kináz A felismerő helyet az RNS-kötő régióban. Igazoltuk, hogy a protein kináz A in vitro körülmények között képes foszforilálni a rekombináns PPYR1-et. Azt találtuk, hogy sem a foszforilált, sem a nem foszforilált forma nem tekinthető a PPY foszfatáz hatékony gátlószerének. Biokémiai vizsgálataink alapján a PPYR1 feladata valószínűleg az lehet, hogy a PPY-t összekapcsolja más fehérjékkel, illetve RNS-sel. A PPYR1 mRNS-t a kifejlett ecetmuslica tesztiszében és ováriumában mutattuk ki. A PPYR1 fehérjét ezen kívül korai embriókban is megtaláltuk. Immunhisztokémiai módszerrel igazoltuk, hogy a PPYR1 az ováriumban a dajkasejtekből jut be a petesejtbe. Valószínűleg ez az anyai eredetű fehérje kerül az embriókba. Feltételezzük, hogy a PPYR1 RNS-hez kapcsolódva fejti ki hatását az embrionális fejlődés korai szakaszában. A Drosophila tesztiszében az anyai géntermékhez képest egy nagyobb méretű zigótikus fehérjét detektáltunk. A PPYR1 fehérjét a PPY-nal együtt megtaláltuk a tesztisz apikális részén elhelyezkedő csírasejtekben és az elsődleges spermatocitákban is. A két fehérje együttes előfordulása az azonos típusú sejtekben lehetőséget biztosít az in vivo kölcsönhatás kialakulására. Kísérleteink szerint tehát a PPYR1 anyai eredetű és zigotikus formái egymástól különböző szerepet játszhatnak a Drosophila sperma, illetve embrió fejlődésében. ----- PPY and PPN are two novel Drosophila specific protein phosphatases. Although the genes and gene products of the two phosphatases have been described their physiological role remained an open question. The lack of information on the interacting partners of the phosphatases, would suggest a physiological role for these enzymes. In our preliminary experiments we identified five proteins that interact with PPY and one interacting protein of PPN. In our subsequent work we selected one of the PPY interacting proteins, termed PPYR1, for more detailed investigation. The specific interaction between PPY and PPYR1 has been confirmed by several independent methods including immunoprecipitation, “pull-down” experiment, and surface plasmon resonance spectroscopy. Based on its abnormal mobility in SDS-PAGE, CD-spectrum, sensitivity to proteases, and heat stability we concluded that PPYR1 was an intrinsically unstructured protein. The primary structure of PPYR1 has 40 % homology with that of PAI-1, an mRNA-binding protein. We demonstrated the RNA-binding capacity of PPYR1 by in vitro experiments. We found a protein kinase A recognition site in the RNA-binding region. We confirmed that protein kinase A indeed phosphorylates recombinant PPYR1 under in vitro conditions. We found that neither the phosphorylated nore the dephosphorylated form of PPYR1 acted as an efficient inhibitor of the PPY phosphatase. According to its biochemical chemical properties PPYR1 can function as a scaffold for the organization of protein and RNA complexes with PPY. The mRNA of PPYR1 was detected in the testis and ovarium of the adult fruit flies. In addition, PPYR1 protein was found in the early Drosophila embryos. The transport of PPYR1 from the nurse cells to the oocyte in the egg chamber was proven by immunohystochemical methods. It is likely that the protein of maternal origin accumulates in the embryos. We suggest that RNA-bound PPYR1 is important in the early development of the embryo. In the testis of Drosophila we observed a zygotic form of PPYR1 that has a larger molecular mass than the maternal gene product. PPYR1 and PPY proteins were localized in the small germ cells and in the early spermatocytes at the apical tip of the testis. The colocalisation of the two proteins in the same cell types makes their in vivo interaction possible. According to our experimental results PPYR1 has two different forms; the maternal and zygotic proteins which play different roles in the development of sperm cells or the embryos