Double-edged sword behaviour of gallic acid and its interaction with peroxidases in human microvascular endothelial cell culture (HMEC-1). Antioxidant and pro-oxidant effects*

A previous report from our group had shown in vitro a direct interaction between peroxidases and dietary antioxidants at physiological concentrations, where in the absence of H2O2, the antioxidants could serve as oxidizing substrates for the peroxidases. However, the physiological relevance of those findings had not been evaluated. The main objective of this study was to determine whether the oxidizing products produced in the interaction between peroxidase and gallic acid at a physiological concentration of 1 μM may promote cell death or survival in a human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). Our findings suggested that gallic acid may show a double-edged sword behaviour, since in the absence of H2O2 it may have a pro-oxidant effect which may promote cell injury (evidenced by LDH, Crystal Violet and calcein AM viability/citotoxicity assays), while in the presence of H2O2, gallic acid may act as an antioxidant inhibiting oxidative species produced in the peroxidase cycle of peroxidases. These observations were confirmed with several oxidative stress biomarkers and the evaluation of the activation of cell survival pathways like AKT and MAPK/ERK.This study was supported by grants from the Spanish Ministry of Science and Innovation (CENIT METDEV- FUN) to M. Portero-Otín, the Spanish Instituto de Salud Carlos III (FIS PI081238) to J. Boada and (FIS PI081843) to M. Portero-Otin and by the COST action B35

Early and gender-specific differences in spinal cord mitochondrial function and oxidative stress markers in a mouse model of ALS

Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a motor neuron disease with a gender bias towards major prevalence in male individuals. Several data suggest the involvement of oxidative stress and mitochondrial dysfunction in its pathogenesis, though differences between genders have not been evaluated. For this reason, we analysed features of mitochondrial oxidative metabolism, as well as mitochondrial chain complex enzyme activities and protein expression, lipid profile, and protein oxidative stress markers, in the Cu,Zn superoxide dismutase with the G93A mutation (hSOD1-G93A)- transgenic mice and Neuro2A(N2A) cells overexpressing hSOD1-G93A. Results and Conclusions: Our results show that overexpression of hSOD1-G93A in transgenic mice decreased efficiency of mitochondrial oxidative phosphorylation, located at complex I, revealing a temporal delay in females with respect to males associated with a parallel increase in selected markers of protein oxidative damage. Further, females exhibit a fatty acid profile with higher levels of docosahexaenoic acid at 30 days. Mechanistic studies showed that hSOD1-G93A overexpression in N2A cells reduced complex I function, a defect prevented by 17β- estradiol pretreatment. In conclusion, ALS-associated SOD1 mutation leads to delayed mitochondrial dysfunction in female mice in comparison with males, in part attributable to the higher oestrogen levels of the former. This study is important in the effort to further understanding of whether different degrees of spinal cord mitochondrial dysfunction could be disease modifiers in ALS. Keywords: Motor neuron, Complex I, Respirometry, Fatty acid composition, Oxidative damage, EstrogensThis study was funded by the Spanish Ministry of Health, Institute Carlos III: FIS grants PI14/00757, PI14/00328, PI 14/01115. Financed by the European Union, program European Regional Development Fund “A way to build Europe”. Supported by the Generalitat de Catalunya (2014SGR168 and predoctoral fellows for OR-N and PT), by FUNDELA (C100013), “RedELA Investigación” platform and by the Fundació Miquel Valls (Jack Van den Hoek donation for ALS research

Polyunsaturated fatty acids in amyotrophic lateral sclerosis: role of DHA, peroxidative modifications and sexual dimorphism

In the present work we focus into the potential relevance of PUFAs in some models and human samples from patients suffering amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Due to its pathological implication, oxidative stress was our first goal. We started from simple oxidative methodology screening to search for an antioxidant substance (among 21 different candidates) available in a Mediterranean diet. The results demonstrated high heterogeneity in carbonyl (measured by DNP) accumulation, regarding the oxidative source, substrate suffering it and the antioxidant structure. Further, thanks to GC/MS and LCQTOF, we detailed the protection over specific accrual of protein and lipid peroxidation markers as well as lipid profile modifications (as % of total fatty acids -FA) in oxLDL thanks to those dietary compounds. Moreover, we demonstrated its in vitro relevance, in terms of survival, when two cell lines (HMEC-1, HepG2) were treated with this oxidized (and protected) compounds, and finally address in vivo importance of those findings, demonstrating decreased carbonyl and oxidative accumulation in hamsters under an atherogenic diet supplemented with antioxidants. Once described the protective effect of antioxidants and specific signatures found regarding lipid oxidation markers, we extend the study focusing in different ALS samples. From previous work, we demonstrated an altered docosohexaenoic acid (DHA) composition in different location for patients suffering sporadic ALS. Hence, we though necessary to define whether the enzymatic machinery aimed to synthesize DHA from its precursors, are affected in sALS. Interestingly, we found a tissue specific variation (spinal cord vs cortex), compatible with our previous FA results. Further, thanks to inmunohistochemistry, differential involvement was unveiled for motor neurons (MN) and surrounding glia. Therefore, trying to depict cellular contribution, we switch to a neuronal model (N2A under oxidative stressors and/or aggregation-prone-TDP-43) and a tissular one (OT). There, we showed decreased desaturase (Δ6) and drebrin expression as well as increased DHA synthesis and an unreported inverse correlation of drebrin loss and aberrant p-TDP-43 expression under oxidative conditions in the cell culture. In the OT model, lipidomic analysis showed specific accretion of 8-iso-PGF2α and NPD1 as well as increased DHA (and dramatically decreased precursors) and reduced AA concentrations (GC measured). Analysis of slice O2 consumption showed decreased O2 levels under excitotoxic treatment and alleviation by antioxidant (tocopherol) addition. Treatment of OT slices with Ω-3 precursors (better than final products) and DHA plus tocopherol ameliorated MNs number. Finally, we wanted to disclose PUFA’s implication and phenothype of an animal model (SODG93A) under a dietary intervention with opposed FA unsaturation levels. Not surprisingly, FA profile was difficult to be altered in nervous system, although subtle specific variations were found. More importantly, differences in survival and clinical manifestations, UPR (Ubiquitin inclusions), mt-DNA (8- oxo-dG) and protein oxidative modifications revealed sex as a relevant factor in lipid handling for this model. Hence, whereas male under a low PUFA diet showed increased survival, females lack this beneficial outcome. Last but not least, we wanted to dig deeper regarding this sexual dimorphism. For this purpose, we focused in mitochondria and analyzed spinal cord oxygen consumption, oxidative damage to proteins and lipid profile along disease progression and also in a neuronal model (N2A overexpressing SODG93A, treated with 17β-estradiol).We could demonstrate a clear sexual implication, with females having late onset clinical symptoms concomitant to an upgraded mitochondrial function and lower protein and mitochondrial damaged proteins compared with males. Finally, to further confirmed steroid potential as a protective element in disease progression, in vitro estradiol pretreatmet of N2A showed increased oxygen consumption, with no relation with the mitochondrial complex expression.En el trabajo que aquí se presenta se ha profundizado en la relevancia que los ácidos grasos poliinsaturados (PUFA) puedan tener en el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica (ALS). Dada su implicación en el desarrollo de la patología, el estudio del estrés oxidativo asociado fue uno de nuestros primeros objetivos. Para ello hemos empezado por un cribado metodológico simplista, tratando de encontrar una sustancia antioxidante (entre 21), biodisponible en una dieta Mediterránea equilibrada y que fuese capaz de reducir un daño oxidativo generado desde diversos frentes (medido como acumulación de carbonilos) y sobre diferentes substratos. Los resultados demostraron una alta heterogeneidad, dificultando así la elección de un único antioxidante. Aún así, gracias a la GCMS y la LCQTOF pudimos detallar la acumulación específica diferenciada de marcadores de daño oxidativo proteico y daño lipoxidativo producido cuando partículas de lipoproteínas de baja densidad (LDL) son oxidadas bajo la acción de diversos compuestos. Además se pudo objetivar el cambio en la composición lipídica de estas LDL (medida como % del total presente) y su relevancia biológica in vitro, medida en términos de supervivencia, cuando se exponen a dos líneas celulares (HMEC-1, HepG2). Por último se demostró la importancia in vivo, puesto que se pudo observar una menor acumulación de productos carbonílicos en hámsters alimentados con una dieta aterogénica, pero suplementada con antioxidantes. Una vez se demostró el papel jugado por estos antioxidantes en la acumulación diferenciada de productos de oxidación, extendimos el estudio a muestras y modelos de ALS. En trabajos previos habíamos evidenciado una composición tisular diferenciada en diversas localizaciones del sistema nervioso en pacientes diagnosticados de ALS. Por ello consideramos interesante el estudio de la expresión de la maquinaria enzimática necesaria para la síntesis lipídica. De un modo destacado, pudimos ver de nuevo una variación tisular, compatible con niveles reducidos de docosohexaenoico (DHA), y gracias a la inmunohistoquímica también se observaron diferencias entre las motoneuronas (MNs) y la glia circundante. Así pues, para poder revelar las aportaciones diferenciales de los distintos tipos celulares, utilizamos una línea celular (N2A) a la que sometíamos a diferentes estresores (daño oxidativo y sobreexpresión de una versión de TPD-43 que causa agregados) y a un cultivo tisular de médula espinal (OT), dónde se produce una muerta progresiva y selectiva de las MNs. Tras estos experimentos, observamos un descenso tanto en la expresión de la Δ6 desaturasa como de drebrin (marcador presináptico) tras la sobreexpresión de TDP-43, así como una mayor síntesis de DHA y una correlación inversa entre la pérdida de drebrina y la expresión de pTDP- 43 bajo condiciones de estrés oxidativo. Por otro lado, en el modelo OT, el análisis lipidómico reveló la acumulación especifica de 8-iso-PGF2α y NDPD1 (posiblemente en respuesta a un incremento del daño oxidativo) así como el aumento en la concentración de DHA (con un descenso muy marcado de sus precursores) y el descenso de araquidónico. Quisimos analizar también el consumo de oxígeno, tanto en tejido intacto como permeabilizado, pudiendo observar como la excitoxicidad reducía considerablemente su capacidad y como ésta era, en parte, rescatada con el uso de tocoferol. Además, el tratamiento del OT con precursores Ω-3 mejoró también el número de MNs. Por último, quisimos caracterizar la implicación que los PUFA dietarios podrían tener en un modelo animal bien conocido (SODG93A). No fue sorprendente encontrar que el perfil lipídico en el sistema nervioso fue muy difícil de alterar. Aún así, se observaron diferencias en supervivencia, en el devenir clínico, la respuesta UPR (con acumulaciones de Ub), el daño al DNA mitocondrial (8-oxo-dG) y modificaciones oxidativas en las proteínas y cómo éstas tenían un grado de afectación diferencial cuando considerábamos el sexo de los animales. Esto es, mientras que los machos sometidos a una dieta baja en PUFAs de cadena larga demostraron una mayor supervivencia, en las hembras no se apreció mejoría. Por último, pero no menos importante, quisimos profundizar más respecto a este dimorfismo. Centrándonos en la mitocondria, pudimos hacer un seguimiento del consumo de oxígeno a lo largo de la enfermedad, el daño oxidativo a proteínas y el perfil lipídico. Por lo tanto pudimos demostrar una clara implicación sexual, siendo las hembras las que más tarde comienzan su manifestación clínica, con mejores funciones mitocondriales asociadas a un menor daño oxidativo. Finalmente, la relevancia del papel protector de los estrógenos se pudo comprobar in vitro, mediante el pretratamiento con 17β-estradiol en la línea N2A que sobreexpresa SOD1G93A, relacionado con la ALS familiar, proponiéndose el estradiol como un nuevo elemento que juega un papel relevante en el desarrollo de la enfermedad.En aquest treball s’ha intentat profunditzar en la possible rellevància dels àcids grassos poliinsaturats (PUFA) en el tractament de l’esclerosi lateral amiotròfica (ELA). Atesa la seva implicació en el desenvolupament de la patologia, l’estudi de l’estrès oxidatiu associat fou un dels primers objectius. Per això, es va començar amb un cribratge metodològic simplista, intentant trobar una substància antioxidant biodisponible en una dieta mediterrània equilibrada i que fos capaç de reduir el dany oxidatiu generat des de diferents fronts i sobre diferents substrats. Els resultats van demostrar una alta heterogeneïtat, dificultant així l’elecció d’un únic antioxidant. Malgrat això, mercès a tècniques de GC-MS i LC-QTOF, es va poder detallar l’acumulació específica diferenciada de marcadors de dany oxidatiu proteic i dany lipoxidatiu produït quan partícules de lipoproteïna de baixa densitat (LDL) s’oxiden per l’acció de diversos compostos. A més, es va poder objectivar el canvi en la composició lipídica d’aquestes LDL i la seva rellevància in vitro, mesurada en termes de supervivència, quan es cocultiven amb les línies cel·lulars. Per últim, es va demostrar la importància in vivo, atès que es va observar una menor acumulació de productes carbonílics en hàmsters alimentats amb una dieta aterogènica suplementada amb antioxidants. Un cop es va demostrar el paper d’aquests antioxidants en l’acumulació diferenciada de productes d’oxidació, es va estendre l’estudi a mostres i models d’ELA. En treballs previs s’havia evidenciat una composició tissular diferenciada en diverses localitzacions del sistema nerviós central en pacients d’ELA (respecte l’àcid docosahexaenoic (DHA), depleció en medul·la espinal i acumulació en còrtex). Per aquesta raó es va considerar interessant l’estudi de l’expressió de la maquinària enzimàtica necessària per la síntesi lipídica. D’una manera destacada, es va poder veure de nou una variació tissular, compatible amb nivells reduïts de DHA i, per tècniques d’immunohistoquímica, es van observar diferències entre les motoneurones i la glia circumdant. Per tant, per poder revelar les aportacions diferencials dels diferents tipus cel·lulars, es va utilitzar la línia cel·lular N2A, sotmesa a diferents estressos (dany oxidatiu i sobreexpressió d’una forma de TDP-43 que causa agregats) i un cultiu tissular de medul·la espinal, en el que es produeix una mort progressiva i selectiva de les motoneurones. Es va observar un descens en l’expressió de FADS2 i de drebrina, un marcador sinàptic, així com una major síntesi de DHA i una correlació inversa entre la pèrdua de drebrina i l’expressió de TDP-43 sota condicions d’estrès oxidatiu. Per altra banda, en el model organotípic, l’anàlisi lipidòmica va revelar l’acumulació específica de 8-isoPGF2α i NDPD1, així com l’augment de la concentració de DHA i el descens motl marcat del seus precursors a mes del àcid araquidònic. Es va mesurar també el metabolisme oxidatiu, observant-se que l’excitotoxicitat reduïa considerablement la seva capacitat i, en part, es rescatava amb l’ús de tocoferol. A més, el tractament dels cultius organotípics amb precursors d’àcids grassos n-3 va millorar el nombre de motoneurones. Per últim, es va caracteritzar la implicació dels PUFA dietaris en un model animal d’ELA. Malgrat que el perfil lipídic del sistema nerviós central era difícil d’alterar, es van observar diferències en supervivència, fenotip clínic, resposta al malplegament de proteïnes (UPR) amb acumulació d’ubiquitina, dany en el DNA mitocondrial i modificacions oxidatives en les proteïnes, amb un grau d’afectació diferencial quan es considerava el sexe dels animals. En aquest sentit, mentre que els mascles sotmesos a una dieta baixa en PUFA de cadena llarga van mostra una major supervivència, en les femelles nomes va apreciar cap efecte millora. Per profunditzar en el dimorfisme sexual en ELA, i especialment la disfunció mitocondrial, es va analitzar mitjançant respirometria d’alta resolució la medul·la espinal durant tot el desenvolupament de la malaltia. Es va revelar una clara diferència de gènere, amb una manifestació clínica més tardana en femelles que correlaciona amb una millor conservació de la funció mitocondrial i un menor dany oxidatiu. El possible paper protector dels estrògens es va demostrar in vitro mitjançant el pretractament amb estradiol de cèl·lules N2A que sobreexpressen una forma de SOD1 humana mutada associada a l’ELA familiar (G93A-SOD1)

The Biological basis of the aging process

El procés biològic bàsic subjacent de l'envelliment va ésser avançat per la teoria de l'envelliment basada en els radicals lliures l'any 1954: la reacció dels radicals lliures actius, produïts fisiològicament en l'organisme, amb els constituents cel·lulars inicia els canvis associats a l'envelliment. La implicació dels radicals lliures en l'envelliment està relacionada amb el seu paper clau en l'origen i l'evolució de la vida. La informació disponible avui en dia ens mostra que la composició específica de les macromolècules cel·lulars (proteïnes, àcids nucleics, lípids i carbohidrats) en les espècies animals longeves tenen intrínsicament una resistència elevada a la modificació oxidativa, la qual cosa probablement contribueix a la longevitat superior d'aquestes espècies. Les espècies longeves també mostren unes taxes reduïdes de producció de radicals lliures i de lesió oxidativa. D'altra banda, la restricció dietària disminueix la producció de radicals lliures i la lesió molecular oxidativa. Aquests canvis estan directament associats a la reducció de la ingesta de proteïnes dels animals sotmesos a restricció, que alhora sembla que són deguts específicament a la reducció de la ingesta de metionina. En aquesta revisió s'emfatitza que una taxa baixa de generació de lesió endògena i una resistència intrínsecament elevada a la modificació de les macromolècules cel·lulars són trets clau de la longevitat de les espècies animals.The basic chemical process underlying aging was first put forward by the free radical theory of aging in 1956; the reaction of active free radicals (normally produced within an organism itself) with cellular constituents initiates the changes associated with aging. The involvement of free radicals in aging is related to their key role in the origin and evolution of life. The specific composition of tissue macromolecules (proteins, nucleic acids, lipids and carbohydrates) in long-lived animal species gives them an intrinsically high resistance to modification that probably contributes to the superior longevity of these species. Long-lived species also show low rates of reactive oxygen species (ROS) generation and oxidative damage to their mitochondria. Dietary restriction further decreases mitochondrial ROS production and oxidative molecular damage due to the decreased intake of dietary proteins. These effects of protein restriction seem to be specifically due to the lowered methionine intake of protein and dietary restricted animals. Both a low rate of generation of endogenous damage and an intrinsically high resistance to the modification of tissue macromolecules are key traits of animal longevity

Calpain activation and CaMKIV reduction in spinal cords from hSOD1G93A mouse model

Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), a severe neurodegenerative disease, affects the upper and lower motor neurons in the brain and spinal cord. In some studies, ALS disease progression has been associatedwith an increase in calcium-dependent degeneration processes.Motoneurons are specifically vulnerable to sustained membrane depolarization and excessive elevation of intracellular calcium concentration. The present study analyzed intracellular events in embryonic motoneurons and adult spinal cords of the hSOD1G93A ALS mouse model. We observed activation of calpain, a calcium-dependent cysteine protease that degrades a variety of substrates, and a reduction in calcium–calmodulin dependent protein kinase type IV (CaMKIV) levels in protein extracts fromspinal cords obtained at several time-points of hSOD1G93A mice disease progression. However, in cultured embryonic motoneurons these differences between controls and hSOD1G93A mutants are not evident. Our results support the hypothesis that age-dependent changes in calcium homeostasis and resulting events, e.g., calpain activation and CaMKIV processing, are involved in ALS pathogenesi

Formation of S-(carboxymethyl)-cysteine in rat liver mitochondrial proteins: effects of caloric and methionine restriction

Maillard reaction contributes to the chemical modification and cross-linking of proteins. This process plays a significant role in the aging process and determination of animal longevity. Oxidative conditions promote the Maillard reaction. Mitochondria are the primary site of oxidants due to the reactive molecular species production. Mitochondrial proteome cysteine residues are targets of oxidative attack due to their specific chemistry and localization. Their chemical, non-enzymatic modification leads to dysfunctional proteins, which entail cellular senescence and organismal aging. Previous studies have consistently shown that caloric and methionine restrictions, nutritional interventions that increase longevity, decrease the rate of mitochondrial oxidant production and the physiological steady-state levels of markers of oxidative damage to macromolecules. In this scenario, we have detected S-(carboxymethyl)-cysteine (CMC) as a new irreversible chemical modification in mitochondrial proteins. CMC content in mitochondrial proteins significantly correlated with that of the lysine-derived analog Ne-(carboxymethyl)- lysine. The concentration of CMC is, however, one order of magnitude lower compared with CML likely due in part to the lower content of cysteine with respect to lysine of the mitochondrial proteome. CMC concentrations decreases in liver mitochondrial proteins of rats subjected to 8.5 and 25 % caloric restriction, as well as in 40 and 80 % methionine restriction. This is associated with a concomitant and significant increase in the protein content of sulfhydryl groups. Data presented here evidence that CMC, a marker of Cys-AGE formation, could be candidate as a biomarker of mitochondrial damage during aging