Protein encapsulation in liposomes: efficiency depends on interactions between protein and phospholipid bilayer.

BACKGROUND: We investigated the encapsulation mechanism of enzymes into liposomes. The existing protocols to achieve high encapsulation efficiencies are basically optimized for chemically stable molecules. Enzymes, however, are fragile and encapsulation requires in addition the preservation of their functionality. Using acetylcholinesterase as a model, we found that most protocols lead to a rapid denaturation of the enzyme with loss in the functionality and therefore inappropriate for such an application. The most appropriate method is based on lipid film hydration but had a very low efficiency. RESULTS: To improve it and to propose a standard procedure for enzyme encapsulation, we separate each step and we studied the effect of each parameter on encapsulation: lipid and buffer composition and effect of the different physical treatment as freeze-thaw cycle or liposomes extrusion. We found that by increasing the lipid concentration, increasing the number of freeze-thaw cycles and enhancing the interactions of the enzyme with the liposome lipid surface more than 40% of the initial total activity can be encapsulated. CONCLUSION: We propose here an optimized procedure to encapsulate fragile enzymes into liposomes. Optimal encapsulation is achieved by induction of a specific interaction between the enzyme and the lipid surface

Three-dimensional view of ultrafast dynamics in photoexcited bacteriorhodopsin

Bacteriorhodopsin (bR) is a light-driven proton pump. The primary photochemical event upon light absorption is isomerization of the retinal chromophore. Here we used time-resolved crystallography at an X-ray free-electron laser to follow the structural changes in multiphoton-excited bR from 250 femtoseconds to 10 picoseconds. Quantum chemistry and ultrafast spectroscopy were used to identify a sequential two-photon absorption process, leading to excitation of a tryptophan residue flanking the retinal chromophore, as a first manifestation of multiphoton effects. We resolve distinct stages in the structural dynamics of the all-trans retinal in photoexcited bR to a highly twisted 13-cis conformation. Other active site sub-picosecond rearrangements include correlated vibrational motions of the electronically excited retinal chromophore, the surrounding amino acids and water molecules as well as their hydrogen bonding network. These results show that this extended photo-active network forms an electronically and vibrationally coupled system in bR, and most likely in all retinal proteins

Sampling the conformational energy landscape of a hyperthermophilic protein by engineering key substitutions

Proteins exist as a dynamic ensemble of interconverting substates, which defines their conformational energy landscapes. Recent work has indicated that mutations that shift the balance between conformational substates (CSs) are one of the main mechanisms by which proteins evolve new functions. In the present study, we probe this assertion by examining phenotypic protein adaptation to extreme conditions, using the allosteric tetrameric lactate dehydrogenase (LDH) from the hyperthermophilic bacterium Thermus thermophilus (Tt) as a model enzyme. In the presence of fructose 1, 6 bis-phosphate (FBP), allosteric LDHs catalyze the conversion of pyruvate to lactate with concomitant oxidation of nicotinamide adenine dinucleotide, reduced form (NADH). The catalysis involves a structural transition between a low-affinity inactive 'T-state' and a high-affinity active 'R-state' with bound FBP. During this structural transition, two important residues undergo changes in their side chain conformations. These are R171 and H188, which are involved in substrate and FBP binding, respectively. We designed two mutants of Tt-LDH with one ('1-Mut') and five ('5-Mut') mutations distant from the active site and characterized their catalytic, dynamical, and structural properties. In 1-Mut Tt-LDH, without FBP, the KmPyr is reduced compared with that of the wild type, which is consistent with a complete shifting of the CS equilibrium of H188 to that observed in the R-state. By contrast, the CS populations of R171, kcat and protein stability are little changed. In 5-Mut Tt-LDH, without FBP, KmPyr approaches the values it has with FBP and becomes almost temperature independent, kcat increases substantially, and the CS populations of R171 shift toward those of the R-state. These changes are accompanied by a decrease in protein stability at higher temperature, which is consistent with an increased flexibility at lower temperature. Together, these results show that the thermal properties of an enzyme can be strongly modified by only a few or even a single mutation, which serve to alter the equilibrium and, hence, the relative populations of functionally important native-state CSs, without changing the nature of the CSs themselves. They also provide insights into the types of mutational pathways by which protein adaptation to temperature is achieved.</p

Temperature-dependent macromolecular X-ray crystallography

The dynamical behaviour of crystalline macromolecules and their surrounding solvent as a function of cryo-temperature is reviewed

Etude des relations structure-dynamique-fonction au sein de l`acetylcholinesterase

Acetylcholinesterase is a very rapid enzyme, essential in the process of nerve impulse transmission at cholinergic synapses. It is the target of all currently approved anti-Alzheimer drugs and further progress in the modulation of its activity requires structural as well as dynamical information. Here we report three experimental approaches that allowed to gain structural insight into the dynamics of acetylcholinesterase. First, the structure of its complex with a putative secondgeneration anti-Alzheimer drug is presented. Next, a steady-state approach for determining atomic-resolution structures of enzyme/substrate complexes is detailed, which permitted to structurally follow the traffic of substrates within the active site of the acetylcholinesterase. Lastly, a new kinetic-crystallography strategy is described, in which UV-laser induced cleavage of a photolabile precursor of the enzymatic product is combined with temperaturecontrolled X-ray crystallography, in order to enable the molecular motions necessary for the expulsion of photolysis products to occur. Taken together, the results described herein permit a detailed description of the traffic of substrates and products within acetylcholinesterase, and provide insights into its conformational energy landscape.L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel

Etude des relations structure-dynamique-fonction au sein de l`acetylcholinesterase

Acetylcholinesterase is a very rapid enzyme, essential in the process of nerve impulse transmission at cholinergic synapses. It is the target of all currently approved anti-Alzheimer drugs and further progress in the modulation of its activity requires structural as well as dynamical information. Here we report three experimental approaches that allowed to gain structural insight into the dynamics of acetylcholinesterase. First, the structure of its complex with a putative secondgeneration anti-Alzheimer drug is presented. Next, a steady-state approach for determining atomic-resolution structures of enzyme/substrate complexes is detailed, which permitted to structurally follow the traffic of substrates within the active site of the acetylcholinesterase. Lastly, a new kinetic-crystallography strategy is described, in which UV-laser induced cleavage of a photolabile precursor of the enzymatic product is combined with temperaturecontrolled X-ray crystallography, in order to enable the molecular motions necessary for the expulsion of photolysis products to occur. Taken together, the results described herein permit a detailed description of the traffic of substrates and products within acetylcholinesterase, and provide insights into its conformational energy landscape.L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif médicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel

Etude des relations structure-dynamique-fonction au sein de l'acétylcholinestérase

L'acétylcholinestérase est une enzyme très rapide, essentielle à la neurotransmission cholinergique. Elle est la cible de toutes les molécules actuellement utilisées dans le traitement de la maladie d'Alzheimer, et les progrès à venir dans la modulation de son activité réclament une connaissance plus fine de sa structure et de sa dynamique. Dans cette thèse, nous décrivons trois approches expérimentales ayant permis d'obtenir des informations structurales sur la dynamique de l'acétylcholinestérase. Nous rapportons, dans un premier temps, la structure de cette enzyme en complexe avec un putatif me dicament anti-Alzheimer de seconde génération. Nous décrivons, par ailleurs, une approche de mise à l'équilibre réactionnel de complexes enzyme/substrat cristallins, grâce à laquelle. le trafic des substrats au sein de l'acétylcholinestérase a pu être suivi structuralement. Nous présentons, enfin, le développement d'une stratégie nouvelle en cristallographie cinétique des protéines, basée sur l'utilisation d'un précurseur photosensible du produit de réaction enzymatique, sa photolyse in-crystallo par le biais d'un laser, et l'application subséquente de profils de température adéquats afin de permettre la survenue des mouvements moléculaires nécessaires à l'expulsion des produits de photolyse. Prises conjointement, les différents résultats de cette thèse permettent une description détaillée du trafic des substrats et produits au sein de l'acétylcholinestérase, et fournissent un aperçu structural de son paysage conformationnel.GRENOBLE1-BU Sciences (384212103) / SudocSudocFranceF

Les porines : un rôle vital et un lien social au sein du biofilm de Providencia stuartii

International audienceNo abstract availabl

Extreme amyloid polymorphism in Staphylococcus aureus virulent PSMα peptides

The phenol-soluble modulin PSMα3 secreted by Staphylococcus aureus forms cross-α amyloid-like fibrils. Here the authors reveal the amyloid polymorphism of PSMs by presenting the cross-β amyloid fibril structures of the biofilm-associated PSMα1 and PSMα4 and showing that truncated PSMα3 antibacterial peptides form distinct out-of-register β-sheets and a polymorph with a hexameric architecture of β-sheets