Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.Para o melhor aproveitamento da biomassa na produção de etanol lignocelulósico, a xilose, principal açúcar que compõe a hemicelulose, poderia ser fermentada juntamente com a glicose. No processo fermentativo, o micro-organismo mais utilizado é a levedura Saccharomyces cerevisiae, uma excelente produtora de etanol. Contudo, esta levedura não é capaz de fermentar pentoses, como a xilose. Embora já tenham sido desenvolvidas linhagens recombinantes que são capazes de metabolizar xilose, o processo ainda não é eficiente, sendo uma das limitações o transporte deste açúcar, que é realizado por meio de transportadores de hexose. Para analisar o influxo de xilose e assim verificar a afinidade de transportadores capazes de realizar a internalização deste açúcar, foi construído um nanosensor baseado na proteína periplasmática XBP (Xylose Binding Protein) e em proteínas fluorescentes. Assim, a XBP foi fusionada e flanqueada por duas variantes da GFP (Green Fluorescent Protein), a eCFP (Cyan Fluorescent Protein) e a Vênus (Yellow Fluorescent Protein), cujos espectros de emissão e excitação, respectivamente, são sobrepostos, permitindo assim a ocorrência do FRET. Alterações neste fenômeno podem ser mensuradas, permitindo o monitoramento de moléculas com resolução espacial e temporal in vivo e de mudanças conformacionais de proteínas associadas à interação de um ligante. Além disso, foi construída uma versão truncada do nanosensor, portando uma deleção na XBP para monitorar o processo de ligação do açúcar à proteína, mediante uma alteração mais expressiva do FRET. Primeiramente foram realizados estudos de modelagem a fim de verificar se o nanosensor apresentaria uma estrutura que favoreceria o FRET. Com a sequência definida, o gene foi sintetizado e posteriormente, foi realizada uma deleção de 69 pb no domínio de ligação à xilose por meio de PCR. Os dois genes codantes para o nanosensor intacto e truncado foram expressos em Escherichia coli. Após a purificação de ambas as proteínas por meio de cromatografia de afinidade, verificou-se ocorrência do FRET por ensaios de fluorimetria para os dois nanosensores. O nanosensor intacto exibiu uma Kd por xilose de aproximadante 3,41 μM a 25 ºC enquanto que o nanosensor truncado apresentou uma Kd de aproximadamente 0,97 μM na mesma temperatura, possuindo este maior afinidade pelo açúcar que o nanosensor intacto. Para este também foram calculados os parâmetros termodinâmicos da interação, a qual exibiu um H de aproximadamente 13 kcal/mol, S de 68 cal/mol.K e G de -7 kcal/mol. Estes valores indicam que a interação é espontânea, entropicamente guiada e favorecida por interações hidrofóbicas. Ensaios de especificidade do nanosensor intacto demonstraram que este também possui afinidade pelos açúcares xilulose (Kd de 0,24 μM) e xilitol (Kd de 0,31 μM). A expressão do nanosensor intacto em Saccharomyces cerevisiae revelou que os fluoróforos encontram-se funcionais no citoplasma da célula, porém não foi verificada a ocorrência do FRET, sendo necessária a otimização do ensaio in vivo. _______________________________________________________________________ ABSTRACTXylose, a highly abundant pentose present in hemicellulose, can be fermented along with glucose to improve harnessing of biomass to produce lignocellulosic ethanol. The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used in fermentative processes but is unable to use pentoses. Although strains that metabolize xylose had already been developed, the process remains inefficient. One bottleneck is the uptake of this sugar, since this is carried out by hexose transporters. Hence, studies on xylose transport are of utmost interest. In order to analyze the xylose uptake and therefore evaluate the affinity of sugar transporters, a nanosensor was built based on XBP (Xylose Binding Protein) fused to two variants of GFP (Green Fluorescent Protein), the eCFP and the eYFP, whose emission and excitation spectra, respectively, are overlapped, allowing the occurrence of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Modifications in this phenomenon can be measured, which enables molecules monitoring of conformational changes in proteins, which is associated with a binding event. Besides, a new version of the nanosensor was constructed by PCR, which contains a deletion in XBP in order to evaluate if there is an increase in FRET efficiency. First of all, modelling studies were performed to verify if the nanosensor would present a tridimensional structure that enables the FRET occurrence. Then, the encoding genes for both nanosensors were expressed in Escherichia coli. Following the protein purification of both nanosensors by affinity chromatography, the occurrence of FRET was checked by fluorimetric assays. The intact nanosensor exhibited a Kd of 3,41 μM at 25 ºC, while the truncated nanosensor exhibited 0,97 μM for Kd at the same temperature, demonstrating that the last one has more affinity for xylose than the intact nanosensor. For this, the thermodynamics parameters of the interaction were calculated, which exhibited a H of 13 kcal/mol, S of 68 cal/mol and a G of -7 kcal/mol. These values indicated that the interaction is spontaneous, driving by entropy and favored by hydrophobic interactions. Also, specificity assays for intact nanosensor showed that it has affinity for xylulose (Kd of 0,24 μM) and xylitol (Kd of 0,31 μM). The expression of the intact nanosensor in Saccharomyces cerevisiae showed that the fluorophores are functional, but occurrence of FRET was not observed, being necessary the optimization of the in vivo assay

Evaluation of different rotary devices on bone repair in rabbits

In oral surgery, the quality of bone repair may be influenced by several factors that can increase the morbidity of the procedure. The type of equipment used for ostectomy can directly affect bone healing. The aim of this study was to evaluate bone repair of mandible bone defects prepared in rabbits using three different rotary devices. Fifteen New Zealand rabbits were randomly assigned to 3 groups (n=5) according to type of rotary device used to create bone defects: I - pneumatic low-speed rotation engine, II - pneumatic high-speed rotation engine, and III - electric low-speed rotation engine. The anatomic pieces were surgically obtained after 2, 7 and 30 days and submitted to histological and morphometric analysis. The morphometric results were expressed as the total area of bone remodeling matrix using an image analysis system. Increases in the bone remodeling matrix were noticed with time along the course of the experiment. No statistically significant differences (p>0.05) were observed among the groups at the three sacrificing time points considering the total area of bone mineralized matrix, although the histological analysis showed a slightly advanced bone repair in group III compared to the other two groups. The findings of the present study suggest that the type of rotary device used in oral and maxillofacial surgery does not interfere with the bone repair process.A ostectomia é uma manobra cirúrgica fundamental que pode afetar a reparação tecidual de modo a aumentar a morbidade do procedimento. O tipo de equipamento e/ou instrumental utilizado para a ostectomia pode influenciar diretamente no reparo ósseo. O objetivo deste trabalho foi analisar o processo de reparação óssea em defeitos realizados em mandíbula de coelho com três diferentes equipamentos. Quinze coelhos foram aleatoriamente divididos em 3 grupos (n=5) de acordo com o equipamento usado para preparacão de 3 cavidades ósseas com brocas padronizadas: I) motor de baixa rotação pneumático, II) motor de alta rotação pneumático e III) motor de baixa rotação elétrico, todos com refrigeração constante. Após os períodos experimentais de 2, 7e 30 dias, as peças anatômicas foram removidas e submetidas a análises microscópica e histomorfométrica. Não houve diferença estatisticamente significante (p>0,05) entre os grupos nos 3 períodos experimentais, considerando-se a área total de matriz óssea mineralizada, embora a análise microscópica tenha revelado uma tendência a um processo de reparação óssea um pouco mais adiantado no grupo III, quando comparado aos demais grupos. Os resultados deste estudo sugerem que o tipo de equipamento rotatório utilizado em cirurgia bucomaxilofacial não interfere no reparo ósseo.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)Sacred Heart University Department of Oral SurgeryFederal University of São Paulo Department of Health SciencesUNIFESP, Department of Health SciencesSciEL

A monopolização do território camponês no município de Igrapiúna/BA e o agronegócio da borracha natural

Esto texto tuvo como objetivo analizar el proceso de monopolización de la tierra por el capital en los territorios campesinos en Igrapiúna-Bahía, teniendo en cuenta la inserción del Grupo Michelin en su espacio rural. Nuestro análisis tuvo como punto de partida la introducción de la Revolución Verde y sus desdoblamientos frente a la modernización técnica/científica y la integración agricultura-industria (los complejos agroindustriales) a través de políticas de subsidios, asistencia técnica y de crédito. Apuntamos la primacía de la actividad económica del caucho natural en Brasil, mediante la internacionalización del capital, en el primer momento en la región amazónica y posteriormente con la territorialización en escala nacional y mundial a través de los monopolios industriales. Se destaca que la actividad económica de la producción del caucho estableció una división social y territorial del trabajo. Esta investigación se fundamenta epistemológicamente en el método del materialismo histórico dialéctico, para la reflexión crítica de las contradicciones existentes en el espacio agrario. Como resultado se evidenció que en las últimas décadas ocurrió una intensa apropiación del territorio por el capital en las unidades de producción familiar campesina, mediante las intervenciones públicas y privadas con el incentivo de la expansión de la frontera agrícola del caucho natural en Bahía. Así, podemos destacar el Proyecto “Ouro Verde Bahia”, desarrollado por la multinacional Michelin y el Programa de Desarrollo del Sector del Caucho Natural (PRODEBON), creado por el Estado, con la finalidad de la expansión del agronegocio del caucho y subordinación de la producción en unidades de producción familiar campesina por medio del Sistema Agroforestal (SAF). Las actuales políticas de desarrollo para el agronegocio del caucho en el estado de Bahía son presentadas como sinónimo de desarrollo y mejora de las condiciones de vida de los sujetos del campo. Sin embargo, lo que tenemos apuntado es que la inserción de la industria en la agricultura objetiva la acumulación y producción del capital asegurando la extracción de pluvalía. Se constata que la producción de caucho está acoplada al circuito del capital: producción, circulación, distribución y consumo, en dimensión multiescalar, local/global. El rural brasileño viene siendo conducido a partir de políticas públicas/privadas que refuerzan el mantenimiento de la desigualdad, y de la expropiación y/o de la sujeción de los sujetos del campo.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPESA presente Dissertação teve como objetivo analisar o processo da monopolização da terra pelo capital nos territórios camponeses no município de Igrapiúna-Bahia a partir da inserção do Grupo Michelin no espaço rural desse município. Nossa análise teve como ponto de partida a introdução da Revolução Verde e os seus desdobramentos face à modernização técnica/científica e a integração agricultura – indústria (os complexos agroindustriais) via políticas de subsídios, assistência técnica e de crédito. Apontamos a primazia da atividade econômica da borracha no Brasil, mediante a internacionalização do capital, no primeiro momento na região amazônica e posteriormente com a territorialização em escala nacional e mundial através dos monopólios industriais. Destaca-se que a atividade econômica da produção da borracha estabeleceu uma divisão social e territorial do trabalho. Esta pesquisa fundamenta-se epistemologicamente no método do materialismo histórico dialético, para reflexão crítica das contradições existentes no espaço agrário. Como resultado evidenciou-se que nas últimas décadas, ocorreu uma intensa apropriação do território pelo capital nas unidades de produção familiar camponesa, mediante as intervenções públicas e privadas com o incentivo da expansão da fronteira agrícola da borracha natural no estado da Bahia. Neste contexto, podemos destacar o Projeto Ouro Verde Bahia, desenvolvido pela multinacional Michelin e o Programa de Desenvolvimento do Setor da Borracha Natural (PRODEBON), criado pelo Estado, com a finalidade da expansão do agronegócio da borracha e subordinação da produção em unidades de produção familiar camponesa por meio do Sistema Agroflorestal (SAF). As atuais políticas de desenvolvimento para o agronegócio da borracha no estado da Bahia são apresentadas como sinônimo de desenvolvimento e melhoria das condições de vida dos sujeitos do campo. Porém, o que se tem apontado é que a inserção da indústria na agricultura objetiva a acumulação e produção do capital assegurando a extração de mais-valor. Verifica-se que a produção de seringueiras está atrelada ao circuito do capital: produção, circulação, distribuição e consumo, em dimensão multiescalar, local/global. O campo brasileiro vem sendo conduzido a partir de políticas públicas/privadas que reforçam a manutenção da desigualdade, e da expropriação e/ou da sujeição dos sujeitos do campo.São Cristóvão, S

A importância da rede de cooperação para a implementação da Política Nacional de Segurança e Saúde do Trabalhador

Orientador : Marcelo Luiz CuradoMonografia (especialização) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Sociais Aplicadas, Curso de Especialização em Gestão PúblicaInclui referênciasO presente estudo tem como discussão central a importância de uma rede de cooperação para a implementação da Política Nacional de Segurança e Saúde do Trabalhador, e como objetivo, promover uma análise das possibilidades de implantação de uma rede de cooperação na área de saúde do trabalhador no município de Irati, a fim de contribuir para a resolução das demandas referentes ao tema, viabilizando o acesso dos trabalhadores aos direitos previdenciários, e para otimização dos serviços e competências da Previdência Social. Tem como foco a análise da realidade das ações desenvolvidas na área da saúde do trabalhador no Município de Irati, especificamente na Agência da Previdência Social. A problemática identificada refere-se à desarticulação dos órgãos internos da Previdência Social e a não estruturação dos serviços prestados com vistas ao atendimento integral ao trabalhador, bem como, a fragmentação das ações prestadas pelo diversos órgãos que atuam na questão saúde e trabalho. O método deste trabalho consistiu em levantamento de dados e pesquisas bibliográficas referentes à Política Nacional de Segurança e Saúde do Trabalhador, com o objetivo de estabelecer a base teórica da pesquisa, que serviram de suporte para cada assunto trabalhado no corpo deste projeto

Chemical treatment to unclogg dripper irrigation systems due to biological problems

Muitos produtores usam gotejadores para irrigação localizada em produção de flores no campo e em ambientes protegidos. Um problema freqüente neste tipo de irrigação é o entupimento dos gotejadores, que está diretamente relacionado à qualidade da água e à deficiência de filtração do sistema. Este trabalho teve como objetivo fazer uma investigação experimental para avaliar a eficiência da utilização de ácido nítrico e de hipoclorito de sódio na desobstrução de gotejadores entupidos, devido à utilização de águas com elevado teor de matéria de origem biológica. A avaliação foi realizada em seis estufas de 4216 m², sendo que cada estufa tem dois setores, composto de dez vãos ou linhas em cada setor, totalizando 12 setores de um sistema de irrigação por gotejamento, em propriedade produtora de rosas (Rosa sp.), sob estufa plástica, no município de Holambra, SP. Análises química, física e de contagem bacteriológica da água foram realizadas nas três fontes hídricas que abasteciam o sistema de irrigação, para verificar quais os fatores que estavam causando risco de entupimento. Foram feitas avaliações da uniformidade de distribuição de água em todos os setores antes e depois do tratamento químico com o intuito de avaliar a sua eficiência. Ocorreu melhora na uniformidade de distribuição de água e diminuição no coeficiente de variação de vazão (CV) dos gotejadores em todos os setores. Houve boa correlação entre o CV e o índice de uniformidade adotado nesta pesquisa. Portanto este é um excelente método para ser utilizado na desobstrução de gotejadores entupimentos devido a problemas de origem biológica.Many producers use drippers for trickle irrigation systems for flower production in the field and in protected environments. A frequent problem in this type of irrigation system is the clogging of drippers, which is directly related to water quality and filtering system efficiency. The objective of this study was to conduct an experimental investigation to evaluate the efficiency of using nitric acid and sodium hypochlorite to unclogg drippers due to the use of water with high algae content. The evaluation was conducted in six, 4216 m² greenhouses, each with two sectors comprised of ten spaces or lines, totaling 12 sectors of a dripper irrigation system in a rose producing property of Holambra, State of SP, Brazil. Chemical and physical analyses and the bacteriological count in water were carried out in the three water sources that supply the irrigation system to check the factors causing the clogging. Evaluations were carried out on water distribution uniformity in all sectors before and after chemical treatment in order to evaluate efficiency. The treatment improved water distribution uniformity and a lead to a reduction in the coefficient of variation (CV) for dripper flow in all sectors. There was a good correlation between CV and the water distribution uniformity index. Therefore, this is an excellent method to be used to unclogg drippers due to biological problems

Engenharia metabólica de zymomonas mobilis para a produção de ácidos orgânicos a partir de xilose

Tese (doutorado) — Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2021.Os ácidos orgânicos apresentam potencial de substituir produtos petroquímicos e oferecem grupamentos funcionais para a sua conversão em materiais de alto valor agregado. Exemplos incluem os ácidos itacônico e xilônico, que foram escolhidos dentre 30 blocos de construção selecionados por um relatório do NREL (National Resource Energy Laboratory), ambos apresentando importantes aplicações na indústria química. Organismos procarióticos já foram modificados para a produção destes dois ácidos orgânicos, demonstrando, assim, o potencial da sua produção por rota biotecnológica. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de linhagens de Zymomonas mobilis capazes de produzir ácido itacônico e xilônico a partir de xilose, cuja utilização é relevante para a valorização da biomassa lignocelulósica. Para a utilização da xilose como fonte de carbono para a produção de ácido itacônico, a integração dos genes de metabolização da xilose xylA, xylB, tktA e talB era necessária, contudo, isto não foi possível. Ainda, a expressão do gene CAD1, codificador da enzima chave na produção de ácido itacônico cis-aconitato descarboxilase, não levou à produção deste ácido por Z. mobilis. Em contrapartida, Z. mobilis foi capaz de produzir ácido xilônico. Primeiramente, foram avaliados sete genes codificadores da enzima XDH (xilose desidrogenase), tendo sido selecionado o gene correspondente de Paraburkholderia xenovorans, o qual levou a uma produtividade volumétrica de 1,85 ± 0,06 g L-1 h -1 , aproximadamente 93% maior do que aquela apresentada quando Z. mobilis expressou o gene de Caulobacter crescentus, o mais utilizado na literatura para a engenharia de linhagens produtoras de ácido xilônico. Após a deleção do gene da xilose redutase, Z. mobilis foi capaz de produzir 56,44 ± 1,93 g L-1 de ácido xilônico a partir de 54,27 ± 0,26 g L-1 de xilose em biorreator, com rendimento de 1,08 ± 0,02 gAX gX-1 , o que representa 97,3% do máximo teórico para este bioprocesso. Esta linhagem também foi avaliada na fermentação de hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar, o que resultou na produção de 11,13 g L-1 de ácido xilônico a partir de 10 g L-1 de xilose. Na tentativa de melhorar ainda mais este processo, foi expresso o gene xylE de Escherichia coli, codificador para um transportador de xilose. Contudo, as linhagens expressando este transportador tiveram seu crescimento prejudicado e uma menor produção de ácido xilônico. Os resultados aqui apresentados demostram que Z. mobilis pode ser considerada como uma potencial plataforma de produção de ácidos orgânicos utilizando a biomassa lignocelulósica como fonte de carbono, estando dentro do contexto de biorrefinarias.Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).Organic acids can replace petrochemical products and provide functional groups that can be used in its conversion into high value materials. Examples include itaconic and xylonic acids, which were chosen as the top 30 high value chemicals by a NREL report and both present important applications in chemical industry. Procaryotic organisms have already been engineered for the production of these two organic acids, thus showing the viability of the biotechnological route for their production. This way, the aim of this work was the development of Zymomonas mobilis strains capable of producing itaconic and xylonic acids from xylose, whose utilization is of utmost importance in lignocellulosic biomass valorization. In order to utilize xylose as carbon source for the production of itaconic acid, it was necessary to integrate the genes from xylose pathway (xylA, xylB, tktA, talB). However, this integration was not possible probably due to the large size of the integration cassettes. The expression of the CAD1 gene, coding for the key enzyme of itaconic acid production cis-aconitate decarboxylase, did not lead to the production of the aforementioned acid in Z. mobilis. In contrast, Z. mobilis was able to produce xylonic acid. Firstly, seven coding genes for the enzyme XDH (xylose dehydrogenase) were evaluated, and the corresponding gene from Paraburkholderia xenovorans was selected. The expression of this gene led to a volumetric productivity of 1.85 ± 0.06 g L-1 h -1 , an increasing of approximately 93% compared to the strain expressing XDH gene from Caulobacter crescentus, the most utilized enzyme for metabolic engineering of microorganisms for xylonic acid production. After the deletion of xylose reductase gene in Z. mobilis, the engineered strain was able to produce 56.44 ± 1.93 g L-1 xylonic acid from 54.27 ± 0.26 g L-1 xylose in bioreactor, reaching a yield of 1.08 ± 0.02 gAX gX -1 , which represents 97,3% of the theoretical maximum for this bioprocess. This strain was also evaluated in the fermentation of sugarcane bagasse hydrolysate, which resulted in the production of 11.13 g L-1 xylonic acid from 10 g L-1 xylose. In the attempt of further increasing the production of xylonic acid in this process, the coding gene for xylose transporter, xylE, from Escherichia coli was expressed in Z. mobilis. However, the strain expressing this transporter had its growth impaired and showed a smaller xylonic acid production compared to the strain without the transporter. The results of this work reveal that Z. mobilis can be regarded as a potential platform for the organic acid production using lignocellulosic biomass as a carbon source in the context of biorefineries

CARACTERIZAÇÃO DOS IMPACTOS AMBIENTAIS DE CAVERNAS DO MUNICÍPIO DE LARANJEIRAS, SERGIPE

Este artigo objetiva avaliar os impactos ambientais e suas possíveis causas presentes nas cavernas do município de Laranjeiras/Se, com o intuito de obter subsídios para a futura institucionalização de unidade de conservação na área. Para tanto, realizou-se avaliação dos impactos através de observação e com base na matriz de Leopoldo (1971) modificada. Com isso caracterizou-se, os principais causadores desses impactos e propôs-se um plano efetivo para a conservação dessas cavernas