Novel affinity chromatography processes for the purification of plasmid DNA using small aromatic molecules

Molecular therapies are gaining importance as an effective therapeutic approach for various types of diseases. The most efficient vectors used to introduce the therapeutic genes are of viral origin however, non-viral vectors based on pDNA are gaining popularity due to their superior safety and easy of production. These factors have increased the demand for high quantities of pharmaceutical grade plasmid DNA (pDNA). Therefore, the research for more efficient pDNA purification protocols has also increased. Moreover, the final pDNA product must meet stringent quality criteria established by the regulatory agencies. Liquid chromatography is the method of choice for the purification of pDNA, since it is simple, robust, versatile and high reproducible. The most important features of a chromatographic procedure are the use of suitable stationary phases and ligands. As conventional purification protocols are being replaced by more sophisticated and selective procedures, the focus changes towards designing and selecting ligands of high affinity and specificity. In fact, the chemical composition of the chromatographic supports determines the interactions established with the target molecules, allowing their preferential retention over the undesirable ones. With these facts in mind, the aim of this work was to develop new chromatographic methods for the purification of pharmaceutical grade pDNA, with the purpose of improving the overall procedures to more effective, simple, economic and environmental-friendly ones. The minor groove binder berenil and the intercalator 3,8-diamino-6-phenylphenanthridine (DAPP) where chosen to be used as ligands in pDNA chromatographic purification studies. They were immobilized to an epoxy-activated Sepharose matrix using a relatively mild curing method, without a catalyst and with quite small ligand:Sepharose weight ratios. Berenil binds pDNA preferentially through hydrophobic interactions but other types of interaction contributions cannot be neglected. It was shown to be quite effective at separating and purifying pDNA from clarified and non-clarified cell lysates, using three different approaches, although isoform resolution was not obtained in either case. Using mild amounts of ammonium sulphate in the eluent, berenil-Sepharose support was able to purify distinct pDNA of two different sizes from clarified cell lysates. Moreover, the ability was continual when the clarification process was replaced by a second chromatographic run. In all cases plasmid solutions were in accordance to the specifications of a pharmaceutical product, however the yields were quite different: two consecutive chromatographic runs lead to lower recoveries (33%) and smaller pDNA molecules have higher recoveries using one run through the column (85% vs 45%). A negative chromatography approach was also performed with berenil-Sepharose, showing some advantages in terms of salt usage as well as procedure time. In this case the recovery yield was quite good (87%) and although pDNA solutions had a comparable purity to that obtained with the other approaches, the gDNA reduction was not so effective. DAPP is slightly A-T specific and binds DNA through non-covalent, reversible stacking interactions of the condensed aromatic moiety into two successive base pairs, while the phenyl residue gets inserted into the minor groove. In addition, protonated DAPP molecules bind to DNA much strongly due to the generation of strong electrostatic interactions. Plasmid DNA binding to DAPP-Sepharose varies with pH and is affected by the presence of salt in the eluent. In fact, total retention of clarified lysate components was only possible with a pH below DAPP's free state pKa (5.8) and the presence of salt destabilizes that same retention. So, the elution of bound species was simply performed by adding small amounts of sodium chloride to the buffers. These features were successfully applied for purification of sc pDNA with two distinct sizes that were obtained according to the regulatory agencies specifications. Once more, the recovery yield of the smaller pDNA molecule was higher than the one obtained for the largest one (94% vs 65%). In conclusion, DAPP-Sepharose showed exceptional characteristics to be used as an affinity support for the purification of pharmaceutical grade sc pDNA. In comparison with berenil- Sepharose, it uses much smaller amounts of salt, with less economic and environmental impact, while improving the quality and yield of the obtained plasmid fractions. Moreover, it is able to separate sc pDNA from linear and oc isoforms even in complex lysates. Moreover, combining DAPP-Sepharose chromatography with other optimized production, extraction and clarification procedures, can offer a number of advantages for pharmaceutical pDNA purification. Also, since the most significant disadvantage of this DAPP-Sepharose support is the relatively low capacity for pDNA, which in turn is strongly related to the solid matrix used, other more stable stationary phases with low pressure drops and interconnected macropores, that allow a high mass transfer of solutes, are quite fascinating alternatives.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

Aplicação de antibióticos como ligandos em cromatografia de afinidade para purificação de DNA plasmídico

As Terapias Moleculares, como a Terapia Génica e as Vacinas de DNA, estão a criar um aumento da procura de grandes quantidades de DNA plasmídico (pDNA) puro. Apesar de já estarem disponíveis vários métodos, baseados em protocolos da biologia molecular, para a purificação de plasmídeos, a grande maioria não são apropriados para o uso em larga escala. Para além disso, esses protocolos usam com frequência reagentes tóxicos, os quais impedem a sua utilização para a purificação de produtos terapêuticos. Já os métodos baseados na afinidade usados até agora, parecem ser bastante promissores, contudo a maior parte faz uso de macrobiomoléculas de preços elevados, que impedem a sua utilização extensiva. Sabe-se que são várias as moléculas que ligam ao DNA com uma especificidade elevada, como certos antibióticos e agentes anticancerigenos. É o caso das moléculas focadas neste estudo: a neomicina e a berberina. Desta forma, estes ligandos representam uma boa alternativa para a aplicação a protocolos de purificação por afinidade. Tendo esse objectivo em mente, as afinidades de ligação entre as moléculas acima mencionadas e um pDNA modelo (pVax1LacZ), foram avaliadas, recorrendo à técnica de titulação fluorimétrica desenvolvida por Strothkamp. A titulação do pDNA com brometo de etídio (BrEt) foi seguida através da intensidade de fluorescência, na ausência e presença de diferentes concentrações dos ligandos em estudo. Aos dados obtidos foi aplicado o método de Scatchard, para assim se determinar o efeito de cada um dos compostos na ligação do BrEt ao pDNA. As constantes de ligação de cada composto foram depois calculadas para diferentes concentrações de cloreto de sódio. Os resultados obtidos mostram que o antibiótico que apresenta a constante de afinidade mais elevada é a berberina, a uma concentração de cloreto de sódio 1,0 M, podendo assim ser um ligando promissor para a purificação de pDNA por afinidade. O suporte escolhido para os ensaios de cromatografia de afinidade foi o Epóxi – (CH2)4 – Sepharose™, contudo a berberina não contém grupos hidroxílicos funcionais para poder ser directamente imobilizada. Desta forma, foram realizados estudos visando a clivagem do seu grupo metilenodióxido para a obtenção de um catecol, alcançando-se os melhores resultados através do uso de tricloreto de alumínio, como activador. Porém, em vez de um único composto, foi obtida uma mistura de quatro produtos, derivados da hidrólise dos grupos metóxido. Ainda assim, procedeu-se à imobilização da mistura ao suporte e analisou-se a interacção do gel obtido com o pDNA. Estudou-se também a influência da concentração de sal no perfil cromatográfico. Os resultados obtidos mostram que, para todas as concentrações de sal, a amostra foi imediatamente eluída após a injecção, sem qualquer retenção na coluna. Este pode ter sido consequência de uma possível baixa densidade de ligandos na coluna ou ao facto da constante de afinidade calculada não representar a verdadeira afinidade existente entre a berberina e o pDNA. O facto de a derivatização ter sido realizada com quatro compostos diferentes, pode também ter sido responsável pela má retenção. Uma vez que esta foi a primeira vez que um antibiótico foi usado como ligando para a purificação de pDNA, criou-se um campo de investigação promissor e pouco explorado, que poderá melhorar e simplificar os protocolos já existentes, para além de, num futuro próximo, poder ser usado para implementar esta abordagem cromatográfica à purificação, em larga escala, de vectores plasmídicos para serem usados nas terapias moleculares.Molecular therapies such as gene therapy and DNA vaccines are creating an increasing demand for high quantities of purified plasmids. Although several methods based on molecular biology protocols are available for the purification of plasmids, most of them are not suitable to use in large scale. In addition they frequently use toxic reagents, which prevent their utilization for the purification of therapeutic products. Affinity methods appear to be very promising but currently most of them use expensive macromolecular biomolecules which prevent their wide application. It is known that several molecules, like certain antibiotics and anticancer agents, bind DNA with high specificity, molecules like the ones focused on this study: neomycin and berberine. In this way, these ligands represent a good choice for the application on affinity purification procedures. For this purpose, the binding affinities of the aboved-described DNA interacting compounds, to a model plasmid DNA (pVax1LacZ), were evaluated using the fluorimetric titration technique developed by Strothkamp. Titration of pDNA with ethidium bromide was followed by fluorescence intensity in the absence and presence of different concentrations of the compounds under study. From this data the Scatchard plot was employed to determine the effect of each compound in ethidium bromide binding. Affinity constants for each compound were then calculated for diferent sodium chloride concentrations. The results showed that berberine has the highest pDNA binding constant, using 1,0 M sodium chloride concentration, thus being a promising ligand for pDNA affinity purification. The chosen support for the affinity chromatography assays was the Epóxi – (CH2)4 – Sepharose™, since berberine does not have any hidroxilic group to be directly immobilised. In this way, studies to cleave the metilenodioxy group of berberine were performed and a cathecol was obtained using aluminium chloride as a catalyzer. However, instead of a single compound, it was obtained a mixture of four different cathecols, were the metoxy groups of berberine were also hydrolysed. However, the immobilization of the mixture compounds was performed and the interation between pDNA and the obtained chromatographic gel was analysed. The influence of the mobile phase composition on the chromatographic behaviour was also studied. The experimental chromatographic results showed an immediate elution of the sample after injection, without any retention on the column, for all salt concentrations tested. This may be due to a possible low ligand density in the column or the affinity constant calculated doesn’t represent the real affinity between berberine and pDNA. The fact that de derivatization was made with four different molecules may also be responsible for the poor retention. Since it was the first time that an antibiotic was used for pDNA purification, it opened a promising unexplored field that could be able to improve and simplify currently available protocols and could, in the near future, be used to implement this chromatographic approach in the large scale purification of plasmids vectors for molecular therapies

Estudo nas empresas portuguesas

A presente investigação visa identificar as barreiras à inovação que influenciam o processo inovador nas empresas industriais portuguesas e, consequentemente, a sua capacidade inovadora. É reconhecido que a inovação se trata de uma temática bastante importante, no que toca ao desenvolvimento das vantagens competitivas, seja de uma empresa, uma região, ou mesmo, um país. Na época de globalização e de forte competição em que se vive, surge cada vez mais, a necessidade de fazer algo que distinga dos concorrentes e a inovação é o caminho a seguir. O presente estudo tem como quadro teórico de referência diversas abordagens sobre inovação empresarial, nomeadamente a abordagem sistémica da inovação e a abordagem das redes e das relações inter-organizacionais. Considerando que a inovação empresarial é um processo não linear, evolucionário, complexo e interactivo entre a empresa e o seu meio envolvente, este estudo visa desenvolver um suporte teórico assente nas actuais abordagens de referência, corroborado por um suporte empírico, que visa, fundamentalmente, identificar e analisar os factores que condicionam a actividade e o desempenho inovador das empresas. No sentido de testar as hipóteses formuladas utilizam-se dados secundários facultados pelo “Observatório da Ciência e do Ensino Superior” (OCES), pertencentes ao 4º Inquérito Comunitário à Inovação – Community Innovation Survey (CIS 4). Este questionário foi implementado em vários países da Europa sob a supervisão do EUROSTAT. O método utilizado no teste é o modelo de regressão logística. Tendo em conta o conceito de capacidade inovadora empresarial, para efeitos do estudo, esta abarca quatro dimensões: inovação no produto, processo, marketing e organizacional. A nível global de análise da capacidade inovadora empresarial destaca-se, como barreira principal, o factor de âmbito económico: falta de financiamento de fontes externas, comum a todos os tipos de inovação, excepto para a inovação de marketing onde nenhuma barreira se demonstrou significativa. Outras barreiras confirmadas foram: englobada nos factores de mercado - a percepção do mercado dominado por empresas estabelecidas e englobada nas razões para não inovar - desnecessário pela inexistência de procura/mercado para inovações. É de destacar que não se conseguiram confirmar algumas barreiras devido a não serem estatisticamente significativas.This investigation aims to identify and analyze the barriers to innovation that influence the innovation capability of Portuguese firms. It is nowadays recognized that while talking about competitive advantages of a firm, a region or even a country, the innovation subject occupies an important place. We live in an age of globalization and strong competitiveness in which firms more frequently need to make the difference to their competitors, so innovation is the path to follow. The conceptual model that is proposed makes use of two innovation approaches: (i) the systemic; and (ii) the networks and inter-organizational relationships. The selection of these approaches is due to the adequacy they present for the study of the determinant factors of entrepreneurial innovative capability. In this research, the innovation concept is defined as a non-linear linear, evolutionary, complex and interactive process between the firm and its environment. Thus, it is intended with this essay to develop a theoretical support based on current reference approaches, corroborated by an empirical support which allows identifying and analysing the restraining factors of innovation activity and of entrepreneurial innovative capability. Nevertheless, it should be stressed that in the present study, the entrepreneurial innovative capability is associated both with product innovation and process innovation. The database is extracted from the Community Innovation Survey 4 (CIS 4). According to the data granted by the “Observatório da Ciência e do Ensino Superior” (OCES) that was conducted by EUROSTAT on distinct European countries. In order to identify the significant determinants of entrepreneurial innovative capability, a logistic regression is performed. For this study the innovation capability includes four dimensions: product innovation, process innovation, marketing innovation and organizational innovation. The most frequent barrier in almost all the dimensions of the innovation capability except in the marketing innovation is the economic factor: lack of external financial sources. Other confirmed barriers are: (1) market factors: the perception that the market is controlled by established firms and (2) reasons for not innovate: unnecessary because there isn’t market/demand for the innovation. Some barriers were not confirmed because they weren’t statistical significant

Mecanomodulação da diferenciação condrogénica de células estaminais mesenquimais

Mestrado em Bioquímica - Métodos BiomolecularesA cartilagem hialina, cujas células especializadas são os condrócitos, encontra-se maioritariamente presente nas articulações. A degeneração deste tecido está associada a envelhecimento e a diversas doenças como artrite reumatóide e osteoartrite. Recentemente, tem sido investigada a possibilidade de desenvolver terapias celulares para o tratamento destas patologias, utilizando células estaminais mesenquimais (MSCs). As MSCs têm capacidade para se diferenciar em várias linhagens, incluindo condrócitos, apresentando-se como um dos mais promissores tipos celulares em medicina regenerativa. Nos últimos anos as vias de sinalização iniciadas pelos estímulos mecânicos do meio envolvente – mecanotransdução - tem sido alvo de estudo. Apesar dos mecanismos de diferenciação condrogénica não serem completamente conhecidos, tem-se tornado evidente que a mecanotransdução desempenha um papel crucial neste processo. Foi recentemente demonstrado que as MSCs têm “memória mecânica” e que, se cultivadas por mais de 10 dias num substrato rígido perdem a multipotência. Vários estudos utilizando células primárias ou MSCs apontam a rigidez ótima para diferenciação condrogénica deste 1 kPa até 320 MPa, dependendo do tipo de células e plataforma utilizados. Este estudo propôs-se então a clarificar qual a rigidez ótima para diferenciação condrogénica de MSCs. No presente estudo, foram preparados vários substratos de PDMS e caracterizados por reologia, apresentando módulos de Young que variam entre 21 kPa e 0.9 kPa. A diminuição da área nuclear nos substratos menos rígidos permitiu validar que estes substratos são capazes de induzir um estímulo mecânico. Somente células de baixa passagem foram induzidas a diferenciar diminuir o impacto da memória mecânica. A coloração de Safranin O (SO) permitiu evidenciar que a formação de aglomerados celulares – típica da condrogénese – é favorecida pelo substrato de 1 kPa. Recorrendo à fluorescência deste corante, foi possível estabelecer um método semi-quantitativo para avaliar diferenciação condrogénica de MSCs. Este ensaio indica que o substrato de 1 kPa potencia a diferenciação condrogénica de MSCs. Apesar dos resultados de SO requererem uma validação mais exaustiva por RT-PCR, os resultados preliminares apontam o que a rigidez ótima para diferenciação condrogénica de MSCs é de 1 kPaHyaline cartilage is composed by specialized cells named chondrocytes. It is mainly present on joints. Its degeneration is associated not only with ageing, but also with diseases like osteoarthritis and rheumatoid arthritis. Cell therapy is an emerging concept for these diseases. Mesenchymal stem cells (MSCs) can differentiate into various cell lineages, including chondrocytes. Recent studies indicate the significance of how cells are capable of sensing mechanical stimuli and initiate signaling cascades – mechanotransduction. Although the mechanisms are not totally understood, it is known that mechanotransduction plays a significant role during chondrogenesis. “Mechanical memory” is an emerging concept: it has been demonstrated that cells lose their multipotency if cultured on stiff substrates for more than 10 days. Distinct studies using primary cells or MSCs indicate that optimal matrix stiffness for chondrogenic differentiation is between 1 kPa and 320 MPa, depending on cell type and platform used. On the present study, we aimed to elucidate the optimal stiffness for chondrogenic differentiation of MSCs. Various PDMS substrates were produced and characterized by rheology, presenting Young’s modulus between 21 kPa and 0.9 kPa. We verified a decreasing tendency on the nucleus area along with substrate softening, suggesting that MSCs were responding to substrate stiffness. To reduce the influence of “mechanical memory”, only naïve cells were induced to differentiate. Safranin O (SO) staining revealed that 1 kPa substrate favored cell agglomeration, typical of chondrogenesis. Using fluorescence of this dye, we established a semi-quantitative assay to evaluate chondrogenic differentiation of MSCs. This assay suggests that 1 kPa substrate potentiates chondrogenic differentiation of MSCs. Despite SO assay results need further validation by RT-PCR, preliminary data indicates 1 kPa as the optimal stiffness for chondrogenic differentiation

"Let there be light"!! (Genesis 1.3)

A luz / [coordenação de] Victor Manuel Canedo Neves. - Lisboa : Universidade Lusíada, 2004. - P. 15-24.“And God saw the light, that it was good: and God divided the light from the darkness.” (Genesis 1.4). We could start this paper producing some outrageous statements; the sort of statements that in Middle Ages would call the attention and anger of Torquemada and would take us to open fire; and, as a matter of fact, some centuries latter Rudolf Carnap would probably do as much. The first would do so because of the statement itself; the latter because of its consequences. Indulge us for a while. The very first line of this paper, its title in fact and the weird formatting is not an accident or a misunderstanding of the rules of proper academic writing. They are part of the argument we are planning to deliver: in short, religion and science come together when it comes to light and basically light is, either way you look at it, the sacred essence of the universe. Today’s science considers the cosmological theory the best explanation for the universe

As obras de Carlos Gutkin como fator motivacional no ensino formal da Guitarra Clássica

O impacto da utilização das obras de Carlos Gutkin como fator motivacional no ensino formal da Guitarra Clássica é o objeto de estudo deste Projeto de Intervenção Pedagógica (PIP), que foi implementado no Conservatório d’Artes de Loures, durante o 2º e o 3º período do ano letivo de 2021/2022. Nesta investigação participaram 16 alunos, com idades compreendidas entre os 12 e os 20 anos. Como metodologia de investigação para o projeto foi utilizada a Investigação-Ação, de tipologia empírica, através da divisão dos participantes em dois grupos distintos - um grupo de experiência e um grupo de controlo - durante a primeira fase do projeto (2º período). Estes papéis foram invertidos numa segunda fase (3º período), de modo a consolidar os resultados obtidos. Ambos os grupos trabalharam a mesma quantidade de peças durante cada período, com a diferença de o grupo experimental ter incluído uma peça de Carlos Gutkin no seu repertório. As técnicas e os instrumentos de recolha e produção de dados empregados foram: questionários realizados aos alunos, grelhas de observação, notas de campo, avaliação contínua e periódica. Foi ainda incluída uma breve referência a uma peça de Gutkin e uma entrevista ao compositor. Os resultados indiciam que a inclusão destas obras no repertório dos alunos lhes terá proporcionado um acréscimo de motivação. Desta forma, o trabalho que aqui se apresenta pretende ser um contributo para uma melhor compreensão da relação entre a escolha de repertório e a motivação dos alunos.The impact of using Carlos Gutkin’s works as a motivational factor in the formal teaching of the classical guitar is the object of study of this Projeto de Intervenção Pedagógica (PIP), that was implemented at the Conservatório d’Artes de Loures, during the 2nd and 3rd terms of the academic year of 2021/2022. For this investigation, 16 students participated, aged between 12 and 20 years old. As a research methodology for this project, Investigation-Action was used, of empirical typology, by dividing the participants into two distinct groups – an experience group and a control group – during both phases of the project (the first phase took place during the 2nd term, and the second phase took place during the 3rd term). To consolidate the obtained results, the group roles were reversed from the first to the second phase. Both groups worked the same amount of repertoire during each term, with the difference that the experimental group worked a Carlos Gutkin piece, while the control group worked mainly traditional repertoire. The techniques and instruments used to collect and produce data were questionnaire surveys carried out with the students, and observation and assessment grids. A brief reference to one of Gutkin’s pieces and an interview with the composer were also included. The results indicate that the inclusion of these works in the students’ repertoire might have provided an increase in motivation. This way, the work presented here intends to be a contribution to a better understanding of the relationship between the choice of repertoire and the students' motivation

Specific berenil–DNA interactions: an approach for separation of plasmid isoforms by pseudo–affinity chromatography

Small molecules, like some antibiotics and anticancer agents that bind DNA with high specificity can represent a relevant alternative as ligands in affinity processes for plasmid DNA (pDNA) purification. In the present study, pDNA binding affinities of berberine, berenil, kanamycin and neomycin were evaluated by a competitive displacement assay with ethidium bromide using a fluorimetric titration technique. The binding between pDNA and ethidium bromide was tested in different buffer conditions varying the type and the salt concentration, and was performed both in absence and in presence of the studied compounds. The results showed that the minor groove binder berenil has the higher pDNA binding constant. Chromatographic experiments using a derivatized column with berenil as ligand, showed a total retention of pDNA using 1.3 M ammonium sulphate in eluent buffer. A selective separation of supercoiled and open circular isoforms was achieved by further decreasing salt concentration to 0.6 M and then to 0 M. These results suggest a promising application of berenil as ligand for specific pDNA supercoiled (sc) isoform purification by pseudo-affinity chromatography.C. Caramelo-Nunes acknowledges a fellowship (SFRH/BD/64918/2009) from the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT)

Tecnologias de informação e comunicação versus isolamento social/individual : causa ou consequência - questões antigas e novas realidades

Globalização / [coordenação de] Victor Manuel Canedo Neves. - Lisboa : Universidade Lusíada, 2002. - P. 11-21.A expressão "isolamento social" é um tema cuja definição não é fácil de encontrar. Há muito que a autora desenvolve investigação sobre o impacto das tecnologias de informação e comunicação (TI C) nos novos métodos de trabalho e modos de vivência. Nesta matéria, a generalidade dos autores apresenta o "isolamento social" como uma desvantagem ou impacto negativo das tecnologias de informação e comunicação (TIC). Esta associação não aparece, no entanto cientificamente fundamentada, facto que por si só justifica uma investigação mais detalhada. As TI C, designadamente a Internet, podem ser utilizadas para trabalhar, investigar, aceder a serviços públicos e a actividades humanitárias e até como meio de socialização e lazer. Esta última utilização como que fundamenta a afirmação de alguns autores que referem que a introdução das TIC nos locais de trabalho é um agente de diminuição do contacto presencial. A disponibilidade da mesma tecnologia na habitação aumenta, segundo os mesmos autores, a possibilidade de desenvolver uma personalidade isolada e "workaholic"

Dissertação de mestrado: a ansiedade, relações interpessoais e motivação na aprendizagem da música - percussão

Relatório de estágio - Mestrado em Ensino da MúsicaResumo 1 - Este estágio apresenta-se como uma componente não só importante mas decisiva do Mestrado em Ensino da Música na Escola Superior de Música de Lisboa, devido à possibilidade de observação de docentes com vários anos de experiência em cumprimento de funções. Este processo proporcionou diversos momentos de aprendizagem, formação e melhoria das capacidades até então adquiridas. Tendo por objetivo a aprendizagem guiada em contexto prático, foi acompanhado o ano letivo de três alunos da Escola de Música Nossa Senhora do Cabo, um de cada nível de aprendizagem: iniciante, intermédio e avançado. Através da observação e análise crítica dos seus tempos letivos semanais, pretendia-se compreender de que modo é possível resolver diversos problemas apresentados no dia-a-dia da aprendizagem musical, auxiliando os alunos a vencer as suas dificuldades. Recorrendo à análise dos resultados observados nas aulas, foi possível concluir que uma abordagem diferente dos conteúdos programáticos nas fases iniciais não só da aprendizagem (como, por exemplo, não trabalhar para uma prova no final de um período letivo, mas sim para a solidificação das bases da aprendizagem) têm um impacto significativo e positivo no desempenho dos alunos, os quais apresentam não só melhores bases e capacidades técnicas como uma compreensão mais rápida de novos exercícios propostos.Resumo 2 - O budismo, enquanto filosofia de vida, apresenta-se como um meio de atingir um estado de espírito completamente aberto e sereno, caracterizado pela paz e pelo equilíbrio interiores dos seus seguidores. Tendo em conta as barreiras apresentadas pelos alunos de percussão do ensino básico ao secundário, considerou-se de que modo a filosofia Zen, advinda do budismo, poderia ajudar os alunos a superar-se a si próprios e a vencer os seus próprios desafios. Para tal, foi acompanhado o ano letivo de seis alunos de percussão do Conservatório Regional de Castelo Branco, divididos irmãmente em dois grupos, de amostra e de controlo. No primeiro foram aplicadas as mudanças ao método habitual de ensino da percussão enquanto, no segundo, não foram levadas a cabo quaisquer alterações, de modo a poder haver uma comparação de resultados viável. Através da análise dos resultados obtidos, foi observável uma melhoria significativa no grupo sujeito às alterações propostas, relativamente a questões de ansiedade, postura em palco e aula e relações inter-pessoais, por oposição ao grupo de controlo que poucas diferenças, se não mesmo nenhumas, demonstraram nos aspetos apontados. Valida-se, deste modo, a hipótese original deste trabalho de investigação, a qual propunha que uma educação com uma abordagem influenciada pela filosofia Zen poderia oferecer melhorias significativas no plano curricular e crescimento pessoal dos alunos.Abstract 1 - This field report presents itself as a component not only important but critical of the Mestrado em Ensino da Música, due to the possibility of observation of teachers with several years of experience in teaching methods. This process, provided numerous moments of learning, experience and improvement of skills acquired up until then. Having as a goal guided learning in practical context, it was followed a school year of three students from Escola de Música Nossa Senhora do Cabo, one of each learning level: beginner, intermediate and advanced. Through the observation and critical analysis of their individual weekly classes, it was intended to understand in which way would it be possible to solve a wide range of problems shown by percussion students on a daily basis, helping them getting pass through their own walls. Using the analysis of results observed in each class, it was possible to conclude that a different approach of the usual curriculum in the early stages of learning (as, for example, building solid learning grounds instead of exame-oriented program) has a significant and positive impact on the performance of the students, who show not only better learning foundations and technical capabilities as well as a faster understanding of new purposed exercises.Abstract 2 - Not as much of a religion but as a philosophy, Buddhism presents itself as a way to reach a completely open and serene state of mind, marked by peace and by the internal balance of its followers. Having in mind all the walls shown by the percussions students from the early stages of learning to the later ones, it was considered how Zen philosophy and teaching, which came from Buddhism, could help those same students overcome themselves and their difficulties. As for that, a full school year of six percussion students of the Conservatório Regional de Castelo Branco was closely monitored, divided evenly into two groups, a sample one and a control one. On the first one, changes to the usual percussion teaching method were applied, as on the second one no modifications at all took place, with the purpose of having a solid and reliable comparison of results. Through the analysis of the results obtained, it was noticeable a significant improvement on the group subject to the purposed changes, concerning to questions like anxiety, stage and class attitude and stance, as well as inter-personal relationships, opposed to the control group who showed little or no differences at all, in the appointed subjects. By this, the initial hypothesis, which purposed that an education with an approach influenced by Zen philosophy could bring significant improvement to both the curriculum and personal growth of the students is validated.N/