Unveiling the clinical relevance of low density neutrophils in Breast Cancer patients

Neutrophils are prominent immune components of solid tumors, which can protect against the onset of cancer (N1) or have protumor activity (N2). Circulating neutrophils, divided into high density neutrophils (HDN) and low density neutrophils (LDN), functionally mirror those N1 and N2 cells, respectively. LDN, practically absent in non-pathological conditions, have been extensively studied in cancer, due to their increased frequency in this disease and their protumor phenotype. However, this has been mainly demonstrated in animal models and proper validation in humans is an urgent need. In this thesis, we enlightened the clinical impact of LDN in breast cancer (BC) patients. We observed that LDN were practically absent in healthy donors’ blood, while significantly increased in the blood of BC patients, particularly with metastatic disease. Within the population of non metastatic patients, LDN were more prevalent in patients with poor response to neoadjuvant chemotherapy than in patients with good response. The association of a higher incidence of circulating LDN and the worse prognosis of BC patients could be explained by the protumor features exhibited by these cells. Namely, there are more LDN expressing the immunosuppressive markers PD-L1 and CCR4, than HDN. Additionally, LDN also showed increased expression of activation markers; robust formation of neutrophil extracellular traps; augmented phagocytic activity and higher capacity to release reactive oxygen species, which altogether contribute for tumor development and metastization. Moreover, the percentage of LDN in BC patients’ blood was positively correlated with the immunosuppressive CCR4+ regulatory T cells and negatively correlated with activated cytotoxic T lymphocytes, corroborating the impairment on the antitumor immune responses by LDN, which was further demonstrated ex vivo. Hence, this thesis reveals the potential of LDN as a clinical meaningful biomarker of BC response to treatment and opens new avenues for developing targeted immunotherapies

Financial statement fraud in Europe

In recent years, more and more fraud cases have been detected in large companies, which undermined the confidence of the markets. However, although this is a reality, the study of the subject in Europe continues to be quite scarce. Therefore, despite an increase in regulatory capacity, a greater focus on the subject in recent years and a growing awareness of the effects of this type of action, there are still few effective prevention tools at the community level. In addition, there are few guiding traits for agents with a central role not in their identification but prevention, the financial auditors. The purpose of this dissertation is to fill this gap in the research on fraud in Europe. Through the study of cases of accounting fraud duly identified by the various European agencies for having incurred in misleading accounting, the indicators that best explain the fraud event in Europe were identified, reaching a total explained variance of 90.5%. In sum, the identified indicators are financial ratios such as the proportion of firm liabilities to total assets, a measure of the days that the entity needs to meet its debts with third parties, a measure of changes in net income, and the size of the auditor firm. Thus, the most significant variables that explain the phenomenon of Financial Statement Fraud in Europe are measures of financial leverage, performance, and financial riskNos últimos anos são cada vez mais os casos de fraude detetados em grandes empresas o que tem vindo a abalar a confiança dos mercados. No entanto, apesar de esta ser uma realidade, o estudo da temática na europa continua a ser bastante escasso. Assim sendo, apesar de um aumento na capacidade de regulação, do maior enfoque na temática nos últimos anos e de haver uma crescente consciencialização para os efeitos que advêm deste tipo de atos, são ainda poucas as ferramentas efetivas de prevenção a nível comunitário. Além disso, são poucos os traços diretores para os agentes com um papel fulcral não na sua identificação mas prevenção, os auditores financeiros. O objetivo da presente dissertação é de preencher esta lacuna existente na investigação sobre fraude na europa. Através do estudo de casos de fraude contabilística devidamente identificados pelas diversas agências europeias por terem incorrido em ilegalidades a nível de contabilidade enganosa, foram identificados os indicadores que melhor explicam o evento de fraude na europa, atingindo um total de variância explicada de 90,5%. Em suma, os indicadores identificados são rácios financeiros como a proporção dos passivos da empresa relativamente aos ativos da mesma, uma medida dos dias que a entidade necessita para fazer face às suas dividas a terceiros, uma medida de mudanças no rendimento liquido e, ainda, o tamanho da empresa auditora da respetiva entidade. Assim sendo, as variáveis mais significativas que explicam o fenómeno de Fraude Contabilística na Europa são medidas de alavancagem financeira, desempenho, e risco financeiro

Determination of cell shape in Staphylococcus aureus

"Cell size and morphology are two extremely important characteristics in the adaptation of bacteria to the external environment and are often associated to bacterial survival and growth. In Staphylococcus aureus, a common colonizer of human skin and mucus membranes, the small spherical shape of cells may be an advantage during colonization, helping this pathogen to evade host immune system. The fact that cell shape is maintained over consecutive generations evidences the existence of tightly regulated underlying mechanisms. Bacterial shape is maintained by the existence of an external cell wall mainly composed of peptidoglycan (PGN), a mesh-like molecule made by glycan chains cross-linked by short peptide bridges. Localization of PGN synthesis is dependent on the action of cytoskeletal proteins, which direct the activity of proteins involved in this synthesis, including Penicillin-Binding Proteins (PBPs) and proteins from the shape, elongation, division and sporulation (SEDS) family, to specific regions of the cells. T(...)

Biological relevance of mucoid vs. nonmucoid morphotype variation by Burkholderia cepacia complex

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012O género Burkholderia é constituído por um grupo de bactérias gram-negativas que apresentam uma elevada diversidade metabólica e que podem ser encontradas em diversos nichos ecológicos tais como o solo e a água, em associação com plantas ou como agentes infeciosos de animais e humanos. Estudos fenotípicos e genotípicos mostraram que algumas destas bactérias apresentavam uma elevada semelhança entre si e foram portanto agrupadas num complexo denominado “Burkholderia cepacia complex” (Bcc). Apesar das bactérias deste complexo serem praticamente inofensivas para indivíduos saudáveis podem infetar pacientes com doenças pulmonares crónicas como a fibrose quística, bem como indivíduos com o sistema imunitário debilitado. A fibrose quística é causada por mutações no gene codificante de uma proteína transportadora do ião cloreto, conduzindo a uma desregulação da produção de muco nos pulmões, a uma maior dificuldade na sua remoção e, consequentemente, a uma maior probabilidade de serem colonizados por microrganismos patogénicos e patogénicos oportunistas. A presença nos pulmões dos pacientes com fibrose quística de bactérias do complexo Bcc multi-resistentes a antibióticos contribui para o estabelecimento de infeções pulmonares crónicas com declínio da função pulmonar que, nos casos mais severos, podem resultar em septicémias e muitas vezes na morte do paciente. A patogenicidade das bactérias do complexo Bcc está relacionada com diversos fatores de virulência, entre os quais o exopolissacárido (EPS) cepaciano. O cepaciano é comumente produzido dentro do género Burkholderia e confere às bactérias um morfotipo mucóide. As funções do EPS variam consoante o organismo podendo estar relacionadas com a patogenicidade da bactéria e com a sua capacidade de adaptação a diferentes ambientes. Durante as infeções prolongadas com bactérias do complexo Bcc pode acontecer uma variação de morfotipo que se caracteriza maioritariamente pela conversão de células mucóides em não-mucóides e que se pensa ser bastante importante para a virulência e adaptação destas ao ambiente pulmonar. Trabalhos anteriores compararam dois isolados clonais da espécie B. multivorans isolados sequencialmente de um paciente com fibrose quística em que o primeiro é mucóide e o segundo é não-mucóide. A caracterização desses dois isolados permitiu observar que as células mucóides e não-mucóides apresentaram diferenças fenotípicas e de expressão génica relacionadas com a motilidade, a formação de biofilmes e a resistência aos antibióticos. O isolado não-mucóide revelou-se também menos virulento do que o isolado mucóide quando se usaram larvas do insecto Galleria mellonella como modelo de infeção. Foi ainda observado que o isolado mucóide tinha a capacidade de originar variantes nãomucóides quando era exposto a diversas condições de stress, incluindo a limitação de nutrientes, a presença de antibióticos, a elevada concentração de sal e de compostos indutores de stress oxidativo, a temperaturas sub- e supra-ótimas, entre outros. Surgiu então a hipótese desta possível variação de morfotipo também ocorrer noutras espécies de Burkolderia pertencentes ou não ao complexo Bcc e provenientes de diferentes nichos ecológicos. Neste trabalho estudou-se então a variação do morfotipo mucóide a não-mucóide de diferentes espécies do género Burkholderia quando estas são sujeitas a limitação de nutrientes e à presença do antibiótico ciprofloxacina. Foram estudadas 16 estirpes de Burkholderia incluindo 9 isolados clínicos pertencentes ao complexo Bcc (B. multivorans D2095; B. cepacia IST408; B. cenocepacia J415; B. stabilis LMG18888; B. vietnamiensis PC259; B. ambifaria CEP0958; B. dolosa CEP0743; e B. anthina FC0974 e FC0967), 5 isolados ambientais também pertencentes ao complexo Bcc (B. multivorans ATCC 17616; B. cepacia ATCC 17759; B. stabilis LMG14086; B. ambifaria AMMD; e B. anthina J2552) e dois isolados ambientais não pertencentes ao complexo Bcc (B. phymatum STM815 e B. xenovorans LB400). Observou-se que tanto as estirpes clínicas como as ambientais do complexo Bcc ou não-Bcc tinham a capacidade de originar variantes não-mucóides em resposta às condições de stress testadas. A infeção de G. mellonella com as estirpes mucóides e respetivas variantes não-mucóides revelou que algumas destas variantes apresentaram uma virulência atenuada relativamente aos respetivos isolados mucosos, enquanto outras mantiveram um grau de virulência semelhante. Do ponto de vista da caracterização fenotípica compararam-se células mucóides com as variantes não-mucóides obtidas a partir da incubação com limitação de nutrientes de quatro estirpes pertencentes a três espécies do complexo Bcc. A comparação englobou a motilidade “swimming” e “swarming”, a formação de biofilmes e a produção de sideróforos. Avaliou-se também a suscetibilidade ao detergente SDS e compararam-se os padrões de LPS, para estudar possíveis alterações membranares. Foi ainda estudada a resistência a agentes causadores de stress oxidativo (hidroperóxido de cumeno e peróxido de hidrogénio) e a antimicrobianos das famílias dos beta-lactâmicos (piperacilina/tazobactam, ceftazidima, imipenemo, aztreonam), aminoglicósidos (amicacina) e quinolonas (ciprofloxacina). No geral a motilidade “swimming” e a formação de biofilmes apresentou-se sempre alterada entre as células mucóides e não-mucóides apesar de não ser possível estabelecer nenhuma tendência. Por outro lado, algumas variantes não-mucóides apresentaram uma maior produção de sideróforos e maior suscetibilidade aos antibióticos quando comparadas com as células mucóides. Com o objetivo de identificar os possíveis mecanismos que conduzem à variação de morfotipo, analisou-se a expressão génica de células mucóides e não-mucóides da estirpe B. multivorans ATCC17616 através de uma experiência de microarrays onde foram comparados os respetivos transcritos. Os resultados mostraram uma diminuição da expressão de genes codificantes de proteínas do sistema de secreção de tipo VI nas variantes não-mucóides, o que pode estar relacionado com uma diminuição da virulência. Os genes codificantes de proteínas constituintes das fimbrias estavam também sub-expressos nas células não-mucóides, enquanto os genes codificantes de proteínas envolvidas na síntese flagelar e na quimiotaxia tinham a sua expressão aumentada. Estes resultados estão em concordância com o aumento da motilidade “swimming” e a diminuição da formação de biofilmes observadas nas células nãomucóides da estirpe B. multivorans ATCC17616. No conjunto de dados de expressão génica observaram-se também alterações na expressão de genes codificantes de vários reguladores de transcrição e de proteínas envolvidas na transdução de sinal. Entre os possíveis reguladores de transcrição inclui-se o gene Bmul_2557 que codifica uma proteína da família LysR. Pensa-se que esta família de reguladores possa estar envolvida em processos celulares como a resistência a antibióticos e a síntese de fatores de virulência. Iniciou-se então uma estratégia de clonagem para eliminar esse gene do genoma da estirpe B. multivorans ATCC17616. Esta estratégia consistiu na amplificação das regiões a montante e a jusante do gene e na sua introdução num vector de clonagem não replicativo para Burkholderia, juntamente com uma cassete que confere resistência a trimetoprim, a qual irá substituir o gene-alvo após dupla recombinação do plasmídeo com o genoma. A obtenção deste mutante é crucial para entender o papel deste regulador de Burkholderia na conversão de células mucóides em não-mucóides. Em conclusão, a variação de morfotipo em espécies do complexo Bcc poderá estar relacionada com alterações fenotípicas e de expressão génica que parecem ser induzidas por exposição das células mucóides a diferentes stresses. A variação de morfotipo é um fenómeno relevante no decorrer das infeções crónicas com bactérias do complexo Bcc em doentes com fibrose quística e a compreensão dos possíveis mecanismos celulares por detrás deste processo representa uma área-chave para estudos futuros.The genus Burkholderia comprises a group of metabolically diverse gram-negative β- proteobacteria that can colonize a wide variety of environments including soil, water, plants, animals and humans. Particularly, bacteria from Burkholderia cepacia complex (Bcc) are well-known opportunistic pathogens infecting cystic fibrosis (CF) and immunocompromised patients. Since CF is caused by mutations in a gene encoding a chloride channel, thus affecting mucus clearance in lungs, infection with antibiotic multi-resistant Bcc bacteria can lead to chronic lung inflammation and in some cases septicemia. Bcc pathogenicity is related to several virulence factors, including the exopolysaccharide (EPS) cepacian which is also a common feature within the genus Burkholderia conferring these bacteria a mucoid phenotype. Mucoid-to-nonmucoid conversion occurs in Bcc long-term infections of CF patients’ airways and it is thought to be highly important in bacterial virulence and adaptation. This study assessed mucoid-to-nonmucoid morphotype variation of different Burkholderia species upon nutrient starvation and ciprofloxacin treatment. It was shown that clinical and environmental Bcc and non-Bcc mucoid strains could originate nonmucoid variants in response to the stress conditions tested. Several of these nonmucoid variants had an attenuated virulence in Galleria mellonella model of infection, while others remained similar to the mucoid parental strains. Phenotypic characterization of mucoid isolates and nonmucoid variants obtained under nutrient starvation was performed. In general, swimming motility and biofilm formation did always differ between mucoid and nonmucoid cells although no tendency was established. On the other hand, some nonmucoid variants showed higher siderophore production and antibiotic susceptibility when compared to the mucoid isolates. Also, mucoid and nonmucoid cells evidenced differences in their gene expression profile, as microarray analysis revealed the altered expression of genes encoding type VI secretion system proteins, fimbrial proteins and proteins involved in flagellar biosynthesis and chemotaxis. Understanding morphotype variation signals and mechanisms represents a key area for future studies