T cell polarization influences the development of IBD-associated neoplasia

Inflammatory bowel disease (IBD) is characterized by chronic relapsing inflammation of the gastrointestinal tract. It is an example of the widespread concept that chronic inflammation is a cancer risk factor since patients have an increased risk of colorectal cancer. Classically, this association has been explained by the establishment of an inflammatory environment that favors cell proliferation, angiogenesis and, ultimately, neoplastic risk. We hypothesize that, besides inflammation itself, the polarization of T helper (Th) cells towards branches that are pro- or anti-tumourigenic is an important cancer risk factor in chronic inflammation, namely IBD, and that Th1 cells are anti while Th17 cells are pro-tumourigenic in this setting. To recapitulate tumour development in the context of chronic inflammation we used the azoxymethane and dextran sulphate sodium (AOM+DSS) chemical carcinogenesis mouse model. Cytokines produced by each of the cell subsets - IFN-γ for Th1 cells or IL-17F for Th17 cells - were administered to AOM+DSS treated C57BL/6 mice to polarize inflammation into the two different types of response. Mice were euthanized after two (early-endpoint experiment) or three (late-endpoint) DSS cycles. Tumour number and area were quantified macroscopically and tissue was collected for histological analysis and for immunohistochemistry with the lymphocytic lineage markers CD4, CD8 and Rorγt. Macroscopically, IL-17F treated mice had more lesions than IFN-γ treated mice in both experiments, though only statistically significantly in the late-endpoint experiment. Histologically, IFN-γ treated mice in the late-endpoint experiment had fewer neoplastic lesions than the control group and the IL-17F group, although not significantly. No major differences were observed in the tumour CD4+, CD8+ and Rorγt+ cell densities between the groups for both experiments. The cytokine treatment influenced malignancy development: mice treated with IFN-γ, which mimics a Th1 cell response, developed less neoplastic lesions than mice treated with IL-17F, which mimics a Th17 cell response

Analysis of signalling pathways required for hemocyte navigation in Drosphila

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011A migração celular é um fenómeno fundamental e altamente regulado, que desempenha um papel activo numa grande variedade de processos biológicos. Por exemplo, é essencial para os processos de gastrulação e organogénese durante o desenvolvimento embrionário e, também, para o estabelecimento e manutenção da homeostasia do organismo durante a vida adulta, onde participa na reparação de feridas e na migração de células imunitárias para locais de inflamação. Falhas nos mecanismos de migração celular podem originar diversas patologias, tais como inflamações crónicas, defeitos congénitos e metastização de tumores. Os processos que permitem a migração celular despertam, por isso, grande interesse do ponto de vista terapêutico. O mecanismo de migração celular direccionada, também designado por quimiotaxia, tem sido principalmente analisado através de estudos em cultura de células imunitárias de mamífero. Estes estudos identificaram vários estímulos quimiotácticos, receptores celulares e vias de sinalização essenciais para a migração celular. Alguns destes estímulos quimiotácticos são compostos por moléculas difusíveis designadas por quimiocinas. Estas moléculas são reconhecidas por receptores que se encontram à superfície dos leucócitos, e que fazem parte de uma vasta família de receptores celulares, os receptores associados a proteínas G ou “G-protein coupled receptors” (GPCRs). Estes promovem respostas por parte da célula através de proteínas a eles associadas, as proteínas G ou “G-proteins”. Outros tipos de estímulos quimiotácticos, tais como factores de crescimento, tem a capacidade de activar outra classe de receptores, os receptores tirosina-cinase ou “receptor tyrosine kinases” (RTKs), que são também importantes na promoção de migração celular. A activação destes receptores leva ao recrutamento de moléculas sinalizadoras, nomeadamente a cinase de fosfatidilinositol (PI3K), importante para o estabelecimento da polaridade celular necessária para a migração celular. Embora estes estudos em culturas celulares tenham contribuído bastante para o nosso conhecimento sobre os mecanismos moleculares da migração celular, pouco se sabe acerca da regulação destes mecanismos no contexto de um organismo. É, portanto, fundamental o recurso a um modelo animal simples, e ao mesmo tempo relevante, para analisar estes processos. As células imunitárias ou hemócitos de Drosophila melanogaster (mosca-da-fruta) partilham muitas características com os seus equivalentes nos mamíferos, tanto em termos de função (fagocitose de microrganismos invasores e de corpos apoptóticos, por exemplo), como no seu desenvolvimento hematopoiético (regulado por factores de transcrição das famílias GATA, RUNX, e friend-of-GATA). Em semelhança aos leucócitos, os hemócitos são expostos a uma elevada variedade de estímulos quimiotácticos que têm de ser integrados para definir a sua direcção de migração. Recentemente, os hemócitos embrionários têm sido utilizados como um excelente sistema para o estudo da migração celular e da inflamação in vivo. Estes estudos revelaram que os componentes moleculares que regulam a migração celular são muito semelhantes aos dos leucócitos. Em D. melanogaster existem receptores da familia dos GPCRs e RTKs que desempenham um papel na migração determinados tipos celulares. Um exemplo importante, é o receptor Pvr, um RTK, que é necessário à migração de hemócitos durante o desenvolvimento embrionário. Além disso, a utilização de D. melanogaster como modelo de estudo permite tirar partido de tecnologias bastante avançadas e úteis como a microscopia confocal, e de vastas bibliotecas de mutantes e transgénicos. Outra vantagem é a utilização do sistema GAL4/UAS, que permite determinar a função e localização de diferentes moléculas especificamente nos tecidos e células em estudo e no estádio de desenvolvimento relevante. Assim, o objectivo deste projecto foi analisar o papel da cinase PI3K, dos GPCRs e dos RTKs no recrutamento de hemócitos para localizações específicas, durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Neste estádio do desenvolvimento, uma parte dos hemócitos encontra-se associada a vários tecidos, nomeadamente, à região anterior do intestino designada “proventriculus” (PV) e ao epitélio dorsal, onde estas células se distribuem por grupos sésseis ao longo do eixo antero-posterior da larva, os “sessile patches” (SP). Em primeiro lugar, estudou-se a função da cinase PI3K através da expressão nos hemócitos de uma forma Dominante Negativa (DN) e de uma forma Constitutivamente Activa (CA) desta proteína. Enquanto a primeira bloqueia a acção de PI3K, a segunda mantém-la constantemente activada. Quando se expressou a forma DN de PI3K especificamente nos hemócitos, observou-se um aumento na população de hemócitos no PV, ao passo que nos SP foi observada uma diminuição no número destas células. O efeito da forma DN de PI3K na população de hemócitos do PV é semelhante aos resultados recentemente obtidos em modelos de ratinho para colite, o que demonstra alguma semelhança entre estes dois modelos. Por outro lado, o fenómeno oposto foi detectado após a expressão da forma CA de PI3K. Isto é, quando constitutivamente activa, a cinase PI3K leva à diminuição do número de hemócitos no PV e ao seu aumento nos SP. Verificou-se ainda que as alterações no número de hemócitos são independentes de um potencial efeito da cinase PI3K na proliferação e apoptose destas células, confirmado através da utilização de imunomarcação com o anticorpo anti-fosfo histona H3 e da técnica de TUNEL. Estes resultados revelam que a cinase PI3K poderá ter um papel na regulação da migração de hemócitos em ambas regiões da larva mas a diferentes níveis. Para além disso, verificou-se que a modulação dos níveis de activação de PI3K leva a alterações na morfologia e propriedades adesivas dos hemócitos, o que indica que PI3K também pode ter um papel na regulação das propriedades adesivas destas células. Resumindo, a cinase PI3K parece ser necessária para o controlo e manutenção do tamanho destas populações de hemócitos possivelmente através da regulação da sua migração e/ou adesão aos tecidos adjacentes. Para analisar o papel de receptores envolvidos no recrutamento e na manutenção destas populações de hemócitos, preferencialmente a montante da cinase PI3K, efectuou-se um rastreio genético baseado na utilização de RNAi para silenciar a expressão de potenciais candidatos. Uma vez que existem cerca de 270 GPCRs e 21 RTKs em D. melanogaster, optou-se por se estudar apenas RTKs e GPCRs (e suas proteínas G associadas) que se sabe serem expressos nos hemócitos. Através deste rastreio genético foi possível identificar vários genes com diferentes funções na migração e/ou manutenção das populações de hemócitos: GRHR, btl, Pvr, e GRHRII. GRHR é um GPCR que parece ser importante para a homeostasia dos hemócitos. Blt é um RTK que poderá ser necessário para a regulação negativa do número de hemócitos nos SP. Pvr é também um RTK que poderá desempenhar uma função homeostática, mas ao mesmo tempo ser necessário para a migração dos hemócitos para o PV e SP, uma vez que se observou uma diminuição no número de hemócitos em ambas as localizações quando silenciada a sua expressão. Finalmente, identificou-se o gene GRHRII, que poderá funcionar a montante da cinase PI3K, uma vez que a expressão de RNAi contra este receptor provocou um efeito semelhante ao observado através da expressão da forma DN de PI3K. Dos quatro candidatos identificados, Pvr e GHRHII parecem ser os receptores mais relevantes. Sendo estes resultados preliminares, a próxima etapa deste projecto será validar os fenótipos observados através de outros métodos de análise. Por exemplo, para confirmar a função destes genes pode recorrer-se à utilização de mutantes e a análises epistáticas para determinar se o gene GRHRII actua a montante da cinase PI3K. Em conclusão, estes resultados revelam o papel crucial de diferentes proteínas na regulação das populações de hemócitos durante a terceira fase larvar de D. melanogaster. Em particular a cinase PI3K, que poderá controlar o número de hemócitos através dois processos distintos: i) através da regulação da sua migração, e/ou ii) através da regulação das propriedades adesivas da célula. O rastreio genético realizado permitiu ainda identificar receptores que poderão estar envolvidos na regulação da migração dos hemócitos destas duas regiões, nomeadamente GRHRII e Pvr. De facto, GRHRII poderá funcionar a montante da cinase PI3K e ter um papel na regulação dos números de hemócitos do PV e dos SP. Estes resultados são especialmente interessantes. Se se confirmar o papel deste GPCR no recrutamento de hemócitos, esta será uma descoberta relevante em termos evolutivos, uma vez que demonstra, pela primeira vez, que, à semelhança do que ocorre em mamíferos, os GPCRs desempenham uma função na migração das células imunitárias em D. melanogaster. Estes resultados também apoiam a ideia de que estas células necessitam de integrar diferentes informações provenientes de regiões diferentes para definirem a sua direcção de migração. Desta forma, este estudo fornece novos conhecimentos acerca das vias de sinalização necessárias durante o recrutamento de hemócitos para regiões específicas durante a terceira fase larvar em D. melanogaster e de como estas populações são mantidas. Estes conhecimentos poderão representar um importante contributo para o estabelecimento dos hemócitos como modelos para o estudo de migração celular.Cell migration is an essential and highly regulated mechanism that plays a role in a wide variety of biological processes throughout an organism‟s life. The dysregulation of cell migration can lead to several pathologies such as chronic inflammatory diseases, congenital defects and tumour cell metastasis. Directed cell migration or chemotaxis has been intensively analyzed through cell culture studies, mainly utilizing mammalian immune cells. These models identified several guidance cues, receptors and signalling pathways important for migration of leukocytes to target tissues and to sites of inflammation and damaged epithelia. However, a simple but reliable in vivo system is needed to uncover the mechanisms underlying immune cell migration within the organism. Drosophila melanogaster hemocytes share many important similarities with their mammalian counterparts in terms of function and haematopoiesis. Embryonic hemocytes are an established model to study cell migration in vivo, due to their amenability to live imaging and the array of genetic techniques that allow for functional analysis of molecular processes in specific cell types. The aim of this project was to analyze the role of Phosphoinositide 3-kinase (PI3K), G Protein Coupled Receptors (GPCRs) and Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) in hemocyte recruitment to specific tissue targets in Drosophila third instar larvae, namely the intestine and dorsal epithelium. Here we show that PI3K is important for regulating the size and maintenance of these tissue-associated hemocyte populations, possibly by regulating hemocyte response to external signals and/or by modifying their adhesive properties possibly through Cadherin regulation. In addition, in a candidate screen we identified two receptors, a GPCR and an RTK, potentially required for the recruitment and/or maintenance of hemocytes at these locations. In the future, these results could help to better understand innate immune cell migration and to further establish hemocytes as models for in vivo cell migration

Rural regions as key locations for the circular bioeconomy: insights from the northern interior of Portugal

Rural areas have often been singled out as strategic locations for the implementation of the Circular Bioeconomy (CBE) concept. This study aims to carry out a detailed analysis of the northern interior of Portugal, focusing on its business dynamics within the CBE. Two representative case studies were selected and critically compared with successful cases from European Nordic countries. The results showed that, generally, waste is managed inefficiently and with little benefit. The cross-comparison with the Nordic CBE model revealed that there is a lack of synergies and collaboration between different stakeholders, from the most basic to the most advanced level. Also, investment in more applied education, as well as a culture based on trust and dialogue, would greatly contribute to the successful implementation of regional CBE policies. In short, innovation, not only in products and services, but mainly in partnerships is key to a sustainable economic growth in rural regions.This work has been developed in the context of the INTERREG POCTEP project "INBEC - Circular bio-economy. Promotion and development of a sustainable economy through innovation and business cooperation" (ref. 0627_INBEC_6_E); The authors are grateful to the Foundation for Science and Technology (FCT, Portugal) and FEDER under Programme PT2020 for financial support to CIMO (UIDB/00690/2020).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

On the societal impact of publicly funded Circular Bioeconomy research in Europe

Europe has taken a world leadership position in setting policy priorities for Circular Bioeconomy (CBE) as a key determinant of economic, social, and environmental sustainability. Consequently, European R&D investment in this area keeps growing along with the societal pressure to demonstrate the return of investment of publicly funded projects. Thus, this work presents a pioneering exploratory analysis of the extent to which projects funded at the European level incorporate the policy priorities for which they are being designed in the context of CBE, and how can the impact they are having on society be assessed. Thence, project impact evaluation is carried out in the short- and medium-term, and categorized under Industrial Competitiveness, Sustainable Development, and Community and Public Policies. For this purpose, secondary information was gathered from the European projects database Cordis, as well as primary information through a questionnaire survey of project coordinators. The empirical data collected suggest that European Framework Programmes have been fulfilling their purpose, as they are increasingly societal challenges-driven and market-oriented. This is evidenced by market-related topics addressed in the projects analysed and by the active participation of companies that outnumber academic institutions. As far as impact is concerned, scientific publications continue to be the main result of this type of project in the short-term, whereas in the medium-term social and economic benefits were also identified. Notably, the creation of scientific jobs in the industry, of industrial joint ventures, and the generation of documents to support the improvement of public and EU policies on biobased productsThis work was supported by the European Regional Development Fund [0627_INBEC_6_E to J. M. R. C. A. S.] and the Portuguese Science and Technology Foundation [UIDB/00690/2020]. The authors are grateful to the Foundation for Science and Technology (FCT, Portugal) for financial support through national funds FCT/MCTES (PIDDAC) to CIMO (UIDB/00690/2020 and UIDP/00690/2020) and SusTEC (LA/P/0007/2021).info:eu-repo/semantics/publishedVersio

O teletrabalho no contexto da pandemia Covid 19: vantagens e desvantagens na perspetiva dos trabalhadores

Antes de março de 2020, o teletrabalho não tinha expressão relevante em Portugal. De forma a diminuir a propagação da pandemia Covid-19 e a garantir a continuidade das atividades económicas, este regime foi adotado de forma súbita e massiva por milhares de portugueses, apresentando-se como uma experiência laboral que a maioria desconhecia e à qual teve de se adaptar. O presente estudo analisa a perceção dos trabalhadores relativamente às vantagens e desvantagens associadas ao teletrabalho, identifica fatores que a influenciam e verifica a intenção dos trabalhadores de manter ou adotar este regime pós-pandemia. A pesquisa é de natureza exploratória, a metodologia é de cariz quantitativo e conta com uma amostra de 341 inquiridos que experienciaram o regime de teletrabalho em contexto de pandemia. Os resultados obtidos, com recurso à análise descritiva e inferencial, mostram que, para a generalidade dos trabalhadores, esta experiência foi essencialmente positiva. Os fatores que se mostraram com mais impacto na influência da perceção dos trabalhadores quanto ao teletrabalho foram as condições oferecidas pela sua casa e o apoio prestado pela organização e pela chefia. A esmagadora maioria dos trabalhadores revelou que gostaria de manter-se em regime de teletrabalho, caso tal fosse possível. Este estudo contribui para o conhecimento da experiência de teletrabalho durante a pandemia Covid-19, centrando-se na perceção dos trabalhadores relativamente às vantagens e desvantagens associadas ao teletrabalho e nos fatores influenciadores da mesma. Tendo sido demonstrado que as organizações têm um papel fundamental neste processo, oferecemos recomendações para a implementação do teletrabalho.Before march 2020, telework had no relevant expression in Portugal. In order to reduce the spread of the Covid-19 pandemic and ensure the continuity of economic activities, this scheme was suddenly and massively adopted by thousands of Portuguese, presenting itself as a work experience that most were unaware of and had to adapt. This study analyzes the perception of workers regarding the advantages and disadvantages associated with telework, identifies factors that influence it, and verifies the intention of workers to maintain or adopt this scheme after the pandemic. The research is exploratory, the methodology is quantitative in nature and has a sample of 341 survey respondents who experienced the telework scheme in the context of a pandemic. The results obtained using descriptive and inferential analysis, show that for most workers, this experience was essentially positive. The factors that have been shown to have the most impact on influencing workers' perception as to telework were the conditions offered by their home and the support provided by the organization and their management. The vast majority of workers revealed that they would like to remain in teleworking scheme, if possible. This study contributes to the knowledge of the telework experience during the Covid-19 pandemic, focusing on the workers' perception of the advantages and disadvantages associated with telework and its influencing factors. Having demonstrated that organizations play a key role in this process, we offer recommendations for implementing telework

Mechanisms of osteoblast reprogramming and differentiation during zebrafish caudal fin regeneration

Regeneration is an impressive biological process that allows the replacement of lost body parts due to damage or injury, restoring both tissue architecture and function. It is well documented that while mammals have a limited capacity to regenerate lost tissues, other vertebrates, such as amphibians and teleost fish, exhibit a remarkable capacity to regenerate organs, like the heart and the retina, and large sections of the body, such as the limb and the fin. Zebrafish has become an important model system to study vertebrate regeneration and the adult caudal fin is one of the most used tissues to comprehend how tissues are restored. This structure is easily accessible to surgery, amenable to live imaging, its amputation does not compromise survival and regeneration is particularly fast, occurring over the course of two weeks. Fin regeneration is an epimorphic process since it relies on a specialized structure called blastema, which is composed of a proliferative heterogeneous population of dedifferentiated cells with restrictive lineage potential. After caudal fin amputation, a regenerative program is activated and occurs in three sequential phases: wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth. These events comprise a tight coordination between proliferation, patterning and differentiation to reconstitute the architecture and the size of the original tissue. The adult caudal fin is composed of multiple tissues, including blood vessels, nerves, mesenchyme and the structural support, the bony-rays (skeletal elements). Each bony-ray is surrounded and maintained by an outer and inner monolayer of bone secreting cells, the osteoblasts. Many studies have focused on bone regeneration since the zebrafish caudal fin provides a unique model to understand bone formation and osteoblast dynamics upon tissue damage and regeneration. After caudal fin amputation, formation of the new bone elements depends greatly on tissue plasticity (changes in cellular identity). This is achieved through the activation of two complementary processes that enable the assembly of an osteoblast progenitor pool during blastema formation: dedifferentiation of resident mature osteoblasts and commitment of joint-associated osteoblast progenitors. Complex regulatory mechanisms subsequently maintain and expand the osteoblast progenitor pool and promote their redifferentiation into mature osteoblasts to restore the skeletal tissue. Therefore, both osteoblast progenitor assembly and redifferentiation are critical aspects of caudal fin bony-ray regeneration. Interestingly, ablation of mature osteoblasts prior to caudal fin amputation does not affect normal bone regeneration, suggesting that de novo bone formation can rely solely on the commitment of joint-associated osteoblast precursors or on new osteoblast progenitors arising from alternative sources.In this PhD thesis, I aimed to unravel key aspects of caudal fin bone regeneration, focusing on new regulators of osteoblast dedifferentiation and redifferentiation and alternative sources for de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted fins. To investigate novel regulators of osteoblast dedifferentiation, we performed a genome-wide gene expression analysis of osteoblasts undergoing dedifferentiation. With this analysis, we concluded that this process occurs much earlier in the regenerative process than what was previously thought. Furthermore, we characterized the molecular basis of osteoblast dedifferentiation regarding epigenetic modulation, signal transduction, cell adhesion reorganization, epithelial to mesenchymal transition and acquisition of migratory behaviour and proliferation. Particularly, we observed that osteoblasts change their metabolic signature upon injury. This was predicted based on the upregulation of several glycolytic and lactate producing enzymes, which is followed by an increase in the expression of oxidative phosphorylation electron transport chain components. We hypothesize that osteoblast dedifferentiation relies on a bivalent metabolism that uses both glycolysis and oxidative phosphorylation, which may reflect an adaption to the energetic demands of regeneration. Since the link between metabolic adaptation and regeneration remains poorly understood, we decided to address it by inhibiting the glycolytic influx. We observed major defects in the regenerative process, including impaired assembly of the wound epidermis, a major signalling centre during regeneration, and fewer cells re-entering the cell cycle. In addition, we showed that several osteoblast markers were downregulated and that osteoblast populations became disorganized. This suggests that metabolic adaptation plays an important role in regeneration, in particular during osteoblast dedifferentiation. In addition to the transcriptional analysis, we followed a targeted approach. We examined the role of the Hippo signalling pathway as a potential regulator of osteoblast dedifferentiation, by inhibiting Yap (Hippo pathway effector). This prevented mature osteoblasts to migrate, re-enter the cell cycle and to assemble the osteoblast progenitor pool. In parallel, we evaluated the role of this pathway in mediating osteoblast redifferentiation during regenerative outgrowth. We noticed that Yap inhibition leads to a decrease in the number of differentiating osteoblasts and to the misregulation of key signalling pathways, such as Bmp and Wnt signalling. We provide evidence that Yap not only promotes osteoblast differentiation through activation of Bmp signalling via bmp2a expression but also restricts the osteoblast progenitor pool by inhibiting Wnt signalling to the differentiation front by regulating dkk1a. Altogether, these results lead us to propose that the Hippo/Yap signalling pathway regulates osteoblast dedifferentiation as well as redifferentiation. This reveals a previously unknown duality if the Hippo/Yap pathway in controlling two different aspects of osteoblast biology during caudal fin regeneration. Lastly, we provide evidence into the cellular and molecular mechanisms that regulate de novo osteoblast formation in osteoblast-depleted caudal fins. We identified an additional osteoblast progenitor population that arises at the outer and inner bone surfaces adjacent to the epidermal and mesenchymal compartments, respectively. These cells are not part of a uniform population but seem to form two distinct osteoblast progenitor populations with different origins or expression profiles. Lineage tracing experiments revealed that mesenchymal cells within the intraray compartment, but not epidermal cells, contribute to generate new osteoblasts in osteoblast-depleted caudal fins. This provides new evidence of an additional source of osteoblasts for regeneration. Moreover, we showed that both Retinoic Acid and Bmp signalling pathways are activated in this osteoblast progenitor population and are important to induce their commitment and recruitment during caudal fin regeneration. Thus, we elucidate potentially dormant regenerative mechanisms that emerge to ensure correct bone formation in caudal fins lacking mature osteoblasts. Taken together, this PhD thesis provides novel insights into new regulators of bone formation and alternative cells that can contribute to correct bone regeneration upon injury. We expect that defining the mechanisms regulating tissue plasticity, reprogramming and fate specification during bone reconstitution have major implications not only to understand the basic mechanisms that regulate tissue regeneration but also to the field of regenerative medicine and bone cancer biology.A regeneração é um processo biológico notável que permite a restituição de tecidos após lesão ou amputação, que incluí a recuperação da função, forma e tamanho do tecido original. Enquanto que os mamíferos possuem uma capacidade limitada de regenerar tecidos, outros vertebrados, como anfíbios e alguns peixes teleósteos, são dotados de uma capacidade extraordinária de regenerar órgãos, como o coração e a retina, e grandes superfícies corporais, como membros e barbatanas. O peixe-zebra (Danio rerio) é utilizado como modelo para o estudo de processos regenerativos em vertebrados. A barbatana caudal do peixe-zebra surgiu como uma das estruturas mais utilizadas para estudar regeneração. Esta estrutura é de fácil acesso à cirurgia de amputação, passível ao uso de técnicas de microscopia, não comprometendo a sobrevivência do animal, sendo que o seu processo regenerativo é consideravelmente rápido. A regeneração da cauda é um processo epimórfico, uma vez que depende da formação de uma estrutura especializada designada blastema. Esta estrutura é composta por uma população heterogénea de células com capacidade proliferativa. Após amputação da cauda, o programa regenerativo é caracterizado por três fases sequenciais: fecho da ferida, formação do blastema e, por fim, crescimento e diferenciação. Durante o processo regenerativo, a coordenação entre proliferação e diferenciação é de grande importância para assegurar e alcançar a estrutura e tamanho iniciais. A barbatana caudal é constituída por vários tecidos, incluindo vasos sanguíneos, nervos, tecido mesenquimal e tecido ósseo, este último sendo constituído por raios ósseos que providenciam estabilidade à cauda. Cada um destes raios ósseos é revestido externa e internamente por uma monocamada de células produtoras de osso, os osteoblastos. Muitos estudos têm-se focado na regeneração destes elementos ósseos presentes na barbatana caudal, uma vez que este sistema possibilita a compreensão do processo regenerativo do osso e a dinâmica dos osteoblastos neste contexto. Após amputação da cauda, a formação do novo tecido ósseo depende consideravelmente da plasticidade celular (alterações na identidade celular). Isto é alcançado durante a formação do blastema, através da ativação de dois processos complementares que permitem a formação de um conjunto de progenitores de osteoblastos: desdiferenciação de osteoblastos maduros presentes no tecido não danificado e diferenciação de progenitores presentes na zona da articulação. Posteriormente, mecanismos regulatórios mantêm e expandem o grupo de progenitores e promovem a sua diferenciação em osteoblastos completamente diferenciados, capazes de produzir matriz óssea e de reconstituir o tecido ósseo. Desta forma, a formação dos progenitores de osteoblastos assim como a sua correta diferenciação são essenciais para promover a regeneração dos raios ósseos da barbatana caudal. Curiosamente, a ablação de osteoblastos maduros antes do início do processo regenerativo não afeta a regeneração dos elementos ósseos, o que sugere que, neste contexto, que a sua formação depende unicamente de progenitores associados à articulação ou de fontes celulares alternativas ainda por descobrir. Durante esta tese de doutoramento, procurei elucidar aspetos chave da regeneração do osso da barbatana caudal do peixe-zebra, nomeadamente os processos regulatórios que controlam o programa de desdiferenciação dos osteoblastos maduros bem como a sua posterior diferenciação, e as fontes alternativas de progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Com o intuito de investigar novos mecanismos regulatórios do processo de desdiferenciação, recorremos a uma análise global do transcriptoma dos osteoblastos nesta fase da regeneração. Esta análise revelou que o processo de desdiferenciação ocorre muito cedo durante o processo regenerativo. Para além disso, caracterizámos a base molecular do programa de desdiferenciação, no que diz respeito a mecanismos epigenéticos, metabolismo, vias de transdução de sinal, adesão celular, transição epitélio-mesênquima, migração e proliferação. Em particular, observámos que várias enzimas glicolíticas e produtoras de lactato exibem a sua expressão aumentada no início da desdiferenciação, seguidas de um aumento na expressão de componentes da cadeia transportadora de eletrões. Estes resultados demonstram que os osteoblastos alteram significativamente o seu metabolismo em resposta à amputação. Desta forma, propomos a hipótese de que a desdiferenciação dos osteoblastos depende da aquisição de um metabolismo bivalente no qual as vias glicolíticas e de fosforilação oxidativa são usadas para melhor adaptar os osteoblastos aos novos requisitos do processo regenerativo. Uma vez que a ligação entre adaptação metabólica e regeneração ainda está pouco explorada, decidimos investigar como é que o processo regenerativo é influenciado pela glicólise. Ao inibirmos o fluxo glicolítico, verificámos que o crescimento do tecido regenerativo é significativamente reduzido. Neste contexto, vários fenótipos foram observados: inibição da proliferação; desorganização da população de osteoblastos dentro do blastema; alterações na expressão de vários marcadores de osteoblastos; e deformação da epiderme especializada que se forma durante a regeneração, cuja função secretora de moléculas sinalizadoras é essencial para a desdiferenciação. Estes resultados sugerem que esta adaptação metabólica tem um papel importante durante a regeneração, em particular no processo de desdiferenciação. Para além da análise de transcriptoma, estudámos também uma via de sinalização em particular, a via Hippo, através da manipulação genética do seu efetor Yap. Descobrimos que a inibição de Yap durante a fase de desdiferenciação impede a migração e proliferação de osteoblastos maduros e a formação de novos progenitores. Para além disso, a inibição desta via durante a fase de rediferenciação leva a uma diminuição substancial dos osteoblastos em diferenciação e a uma alteração na expressão de componentes de vias de sinalização cruciais, bmp2 (via BMP) e dkk1 (via Wnt). Estes dados evidenciam que Yap promove a diferenciação dos osteoblastos através da ativação da via BMP e restringe o grupo de progenitores através da inibição da via Wnt. Estes resultados permitem-nos propor que a via de sinalização Hippo/Yap regula quer a desdiferenciação dos osteoblastos quer a sua subsequente rediferenciação, o que revela a dualidade do mecanismo de ação desta via em fases diferentes do processo regenerativo da barbatana caudal. Por último, revelamos a existência de mecanismos celulares e moleculares que regulam a formação de novos progenitores de osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Identificámos assim uma fonte adicional de progenitores que emerge na interface da matriz óssea com os tecidos adjacentes, nomeadamente a epiderme e o mesênquima. Estes progenitores não parecem formar uma população homogénea, mas sim duas populações distintas com diferentes origens ou com diferentes padrões de expressão. Recorrendo a técnicas de seguimento de linhagem, conseguimos identificar o mesênquima, mas não a epiderme, como uma fonte de novos osteoblastos em caudas desprovidas de osteoblastos maduros. Estes resultados põem em evidência uma origem adicional de osteoblastos que contribui para o processo regenerativo. Para além disso, demonstramos que as vias de sinalização do Ácido retinóico e Bmp estão ativas nesta população de progenitores e têm um papel crucial na formação e recrutamento desta fonte adicional de osteoblastos durante o processo regenerativo. Assim, este trabalho permite revelar que, em barbatanas caudais desprovidas de osteoblastos maduros, mecanismos regenerativos que se encontram normalmente inativos, são estimulados e asseguram a formação correta dos elementos ósseos neste contexto. De uma forma geral, esta tese de doutoramento identifica novos mecanismos de regulação da formação do tecido ósseo e fontes celulares alternativas que contribuem e garantem a correta regeneração do osso após lesão. Antevemos que o conhecimento dos mecanismos que regulam a plasticidade celular, reprogramação e especificação de linhagem durante a regeneração do osso possam ter implicações fulcrais não só para o conhecimento dos processos básicos que promovem regeneração, mas também no campo da medicina regenerativa e neoplasias

Integrated design concept in civil engineering education

The current difficulties in the Construction Industry have confirmed the urgent need for interdisciplinary between all thedesign disciplines, from engineering to architecture. The requirement for high levels of building eciency and theoptimization of the building process is making increasing demands on the accuracy of designs. The project is no longer asum of contributions, but a design methodology that combines the answers to all the diÄerent requisites of the building, anintegrated design project. This multidisciplinary approach to design problems is only possible if it is present in the designprocess from the outset. This implicit complicity is only possible if it starts in university education, searching for a uniquecommon language of construction. This article shows an example of the implementation of integrated project delivery(IPD) methodology to the project based learning in civil engineer education. Exploring the experience undertaken in lastyears in one of the courses of the Integrated Master in Civil Engineering (MIEC) of the Faculty of Engineering of theUniversity of Porto, the implementation of the IPD methodology along lectures and studio classes, proved to be a moreecient learning performance among students in what concerns to the understanding of the relation between the designprocess and the convergence of all engineering disciplines that have to work together with the architecture design practice.Therefore, the methodology implemented in the architecture course in the 2nd semester of the 2nd year (1st cycle) of theMIEC, described in chapter 3, allows students to learn the design methodology as an integrated disciplinary project and tobecome able to access the available work tools, from project design to construction process. As a result, the improvement inthe students ability to acquire knowledge was clearly visible in the increase of final grade average since the IPDmethodology was implemented in the course (2010/11). Also, students motivation for developing extra homework becamehigher due to their initiative and commitment

Toward a bioethical framework for antibiotic use, antimicrobial resistance and for empirically designing ethically robust strategies to protect human health: a research protocol

Introduction: Antimicrobial resistance (AMR) is a challenging global and public health issue, raising bioethical challenges, considerations and strategies. Objectives: This research protocol presents a conceptual model leading to formulating an empirically based bioethics framework for antibiotic use, AMR and designing ethically robust strategies to protect human health. Methods: Mixed methods research will be used and operationalized into five substudies. The bioethical framework will encompass and integrate two theoretical models: global bioethics and ethical decision-making. Results: Being a study protocol, this article reports on planned and ongoing research. Conclusions: Based on data collection, future findings and using a comprehensive, integrative, evidence-based approach, a step-by-step bioethical framework will be developed for (i) responsible use of antibiotics in healthcare and (ii) design of strategies to decrease AMR. This will entail the analysis and interpretation of approaches from several bioethical theories, including deontological and consequentialist approaches, and the implications of uncertainty to these approaches.info:eu-repo/semantics/publishedVersio