Assessing gut precursors asymmetric cell behaviours in the zebrafish embryo

Tese de mestrado em Biologia Evolutiva e do Desenvolvimento, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, em 2018Externamente, o corpo dos vertebrados é simétrico bilateralmente, no entanto, órgãos como o coração, intestino, pâncreas e fígado, pulmões e a vasculatura apresentam uma assimetria relativamente ao eixo Esquerda-Direita (ED), no que diz respeito ao seu posicionamento e/ou morfologia, numa disposição conservada denominada de situs solitus. O estabelecimento do eixo ED ocorre durante a embriogénese num processo coordenado após o estabelecimento dos eixos Antero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV). Quando ocorrem anomalias durante o estabelecimento do eixo ED, vários quadros clínicos afetando a posição e morfologia destes órgãos podem surgir. Tais casos incluem situs inversus, que corresponde a uma completa inversão na disposição dos mesmos, ou heterotaxia, um espectro descrito por vários possíveis desarranjos no posicionamento, em que alguns órgãos podem apresentar normal assimetria ED e outros não. Nos vertebrados, a assimetria é estabelecida com a expressão assimétrica de Nodal, uma proteína da família TGFb, do lado esquerdo da placa mesodérmica lateral (PML). O conhecimento atual demonstra que esta quebra na simetria, na maioria dos vertebrados, ocorre numa estrutura chamada de organizador ED, dotada de cílios móveis que promovem um fluxo assimétrico do fluido que enche esta cavidade, impulsando a quebra da simetria. No peixe-zebra, este organizador é a vesícula de Kupffer (KV), formada a partir de um grupo de células localizadas numa zona adjacente ao escudo embrionário, as dorsal forerunner cells. Durante o processo de formação, esta estrutura sofre vários rearranjos, apresentando no final uma distribuição dos cílios assimétrica, com uma maior densidade na região antero-dorsal. Esta arquitetura produz um fluxo no sentido anti-horário que promove o aumento de Ca2+ intracelular nas células mais à esquerda na KV, via mecanismos envolvendo o complexo Pkd1l1-Pkd2 e a CaMK-II. Em peixe zebra há três ligandos Nodal, Cyclops, Squint e Southpaw. Southpaw (Spaw) é o ligando Nodal envolvido na quebra e transmissão de assimetria ED no peixe-zebra. A expressão de southpaw (spaw) apresenta uma forma bilateralmente simétrica em torno da KV aos 4-6 sómitos (ss). Por volta dos 10-12 ss, a expressão de spaw torna-se assimétrica na PML do lado esquerdo. Pensa-se que Dand5, uma proteína da família DAN, possa estar ativamente envolvida na formação da assimetria de spaw na PML. Aos 8 ss, dand5 apresenta uma expressão assimétrica, dependente do fluxo, mais forte do lado direito, sendo o primeiro gene assimétrico na KV. Como antagonista de Spaw, Dand5 liga-se a Spaw alegadamente mais no lado direito da KV, postulando-se que promove assim que Spaw difunda da região perto da KV em direção ao lado esquerdo da PML para lá estimular a expressão de spaw mRNA. Através de um feedback positivo, a sua expressão é amplificada na PML até aos 22 ss. Spaw também estimula a expressão de pitx2 no lado esquerdo da PML por volta dos 13 ss, e embora a sua expressão seja dependente da sinalização Nodal, em peixe zebra foi demonstrado que Pitx2 não é necessário para normal lateralização do coração e órgãos digestivos como no ratinho e outros vertebrados. Foi então sugerido que um outro gene, elovl6, expresso também no lado esquerdo da PML poderá estar envolvido no estabelecimento da assimetria dos referidos órgãos em peixe zebra. Adicionalmente, Spaw também vai levar à ativação dos seus próprios reguladores negativos, os genes lefty1 e lefty2, ficando estes restringidos à linha mediana e lado esquerdo do campo do coração, respetivamente. Adicionalmente à mesoderme, o ligando Nodal também afeta o processo de especificação e desenvolvimento da endoderme. Este envolve uma complexa e sucessiva interação de vias de sinalização e fatores de transcrição. A endoderme sofre complexos processos morfogenéticos, primeiro após a gastrulação, converge em torno da linha mediana cobrindo todo o eixo AP. O primórdio do tubo digestivo é formado pelo rearranjo das células precursoras, que polarizam e formam um lúmen por volta das 20 horas pós-fertilização (hpf) que se estende até às 42 hpf. Este tubo dará origem aos órgãos como o fígado, pâncreas e bexiga natatória. Um processo, chamado de looping do tubo digestivo, ocorre entre 26-30 hpf, no qual porções do mesmo são deslocadas da linha mediana para a esquerda da mesma. A PML foi envolvida neste processo devido às suas assimetrias migratórias que impõem o deslocamento da endoderme. O primeiro primórdio pancreático emerge também por volta das 24 hpf, o primórdio dorsal, que dará apenas origem ao tecido endócrino. O segundo primórdio, aparece bastante mais tarde, por volta das 40 hpf, o primórdio ventral que dá origem tanto a tecido endócrino como exócrino, assim como os ductos pancreáticos. O primórdio do fígado emerge entre as 24 e 28 hpf, estendendo-se da linha axial para a esquerda sobre o saco vitelínico. Tendo em conta que Nodal afeta a taxa de migração das células, nomeadamente as da endoderme e que a expressão assimétrica de dand5 muito provavelmente é responsável pela expressão assimétrica de spaw nas células da PML, neste projeto de tese, propusemos que as células migratórias da endoderme e precursoras do tubo digestivo possam ser afetadas pela sinalização Nodal (Spaw). Consequentemente, estas células podem migrar mais rápido no lado esquerdo que no lado direito, onde Spaw é supostamente inibido por Dand5. Sabendo que estas células apresentam um comportamento migratório antes da difusão da expressão assimétrica de spaw e elovl6, propomos um papel ativo para estas células. Sugerimos testar se os sinais ED, imediatamente após a quebra da simetria na KV podem afetar a padronização ED das células migratórias da endoderme. Também propomos a hipótese destas células integrarem o tubo digestivo, em formação durante estes estadios, e poderem contribuir para a formação dos órgãos assimétricos como o fígado e pâncreas. Assim, o nosso objetivo secundário, foi estudar o destino destas células da endoderme com comportamento migratório. Utilizando uma linha repórter Tg(sox17:GFP), procedemos ao estudo do comportamento migratório das células endodérmicas com captação de imagens ao vivo e análise paralela de embriões fixados. Sox17 é um marcador da endoderme permitindo visualizar as células que queremos estudar assim como a KV, o tubo digestivo e órgãos derivados do mesmo. Reportamos então neste estudo a formação de um agregado de células sox17:GFP+, não reportado anteriormente, o qual chamámos de ‘cluster’, localizado numa região posterior à KV aos 10 ss. Observámos que é a partir deste agregado que as células sox17:GFP+ começam a migrar em direção ao lado anterior do embrião aquando da passagem da KV sobre o mesmo devido ao crescimento da cauda. Este resultado levanta a questão de porque é que estas células formam este agregado posterior e não se intercalam formando o tubo digestivo como as outras sox17:GFP+. Os estudos de captação de imagens ao vivo não produziram resultados com diferenças significativas entre a ED. A falta de significância estatística foi justificada pelo tamanho sub-ótimo da amostra. Por outro lado, os estudos com embriões fixados, foram robustos em número de embriões e permitiram uma resolução excelente em profundidade. Observámos assim diferenças significativas entre ED, nomeadamente no número de células migratórias, maior no lado esquerdo aos 13 e 14 ss, assim como denotamos uma maior dispersão e distância à KV aos 14 ss. Para averiguar o destino destas células de posicionamento assimétrico, realizámos um estudo com Kaede, uma proteína fotoconvertível por UV, pelo que fotoconvertemos as células do agregado a 8ss bem como os dois grupos de células migratórias de cada lado da KV a 14 ss. No entanto, após varias tentativas os resultados obtidos não nos permitiram concluir se as células alvo incorporam o tubo digestivo. Pensamos que a proliferação celular dilui a Kaede fotoconvertida, não permitindo esta observação. Em conclusão, conseguimos caracterizar o padrão de migração das células sox17:GFP+, tendo sido observadas algumas assimetrias ED em análises temporais. Desta forma, este trabalho valida a nossa hipótese inicial em que a migração das células endodérmicas seria afetada assimetricamente em relação ao eixo ED. Propomos então um mecanismo alternativo no qual sinais ED assimétricos, ocorrentes nas células da KV podem estar a afetar o comportamento migratório da endoderme. Para tal, o próximo passo é a manipulação destes sinais assimétricos para testar se o comportamento das células sox17:GFP+ observado é alterado. Também sugerimos a continuação de estudos complementares de captação de imagens ao vivo com vista a determinar o destino das células alvo.The establishment of the left-right (LR) axis is fundamental for the correct position of visceral organs. In vertebrates, asymmetry is established with the expression of nodal, southpaw (spaw) in zebrafish, only in the left Lateral Plate Mesoderm (LPM). Current knowledge shows that in most vertebrates the symmetry breaking event occurs in a specialized structure called the LR organizer (LRO), where biophysical interactions determine the first asymmetric clues. In zebrafish, the LRO is called Kupffer’s vesicle (KV), a transient fluid-filled, monociliated organ, which appears during the early segmentation period at the posterior end of the notochord. In zebrafish, spaw expression is bilaterally symmetric in the cells surrounding the KV at 4-6 ss becoming asymmetrical in the left LPM around 10–12 ss. Motile cilia inside the KV ensure a counter-clockwise fluid flow that is important to establish the first asymmetric gene expression of dand5 at 8 ss. Dand5 is a secreted protein shown to be a potent Nodal inhibitor. The exclusive left sided southpaw (spaw) expression at the lateral plate mesoderm is thought to be the result of the earlier Dand5-Spaw inhibition near the KV. Previous data have shown a possible migration of endodermal gut precursor cells very close to the KV and other studies have demonstrated that Nodal affects cell migratory speed, namely in endodermal cells. So, we hypothesized that endodermal cells on the left side of the KV being exposed to more Spaw will migrate faster than the ones on the right side where Spaw is inhibited by Dand5. To characterize the migratory behaviour of these gut precursor cells we used the Tg(sox17:GFP) reporter line using two photon live-imaging as well as complementary time-course fixed samples. We observed that endodermal cells form a cluster at the posterior midline that is disassembled by cell migration triggered by the KV passing over it. Additionally, even though live studies did not show significant differences in measurements such as migration speed and track displacement, perhaps due to our small sample size, differences in the pattern of cell migration on the Left versus Right sides were observed in fixed embryos. These included differences in several parameters, such as the number of cells, distance to KV centroid, distance between cells. To understand if the migratory sox17:GFP+ cells were indeed incorporating the gut tube and where, we performed photoconversion experiments using Kaede. However, the results did not allow us to take such conclusions, mainly due to the fact that cell proliferation dilutes photoconverted Kaede. Still, in this study we showed that there is asymmetric positioning of migratory endodermal cells in a LR manner. We thus propose an alternative mechanism in which LR asymmetric cues that take place in the KV cells can affect endodermal migratory behaviours. Therefore, the next step will be to manipulate LR signals within the KV in order to test if the observed asymmetries are indeed originated from R>L dand5 asymmetric expression. We also suggest performing more live imaging studies in order to determine the fate of the migratory endodermal cells

Dand5 is involved in zebrafish tailbud cell movement

Funding Information: This work was supported by the Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT-ANR/BEX-BID/0153/2012 research grant and by the Project LysoCil funded by the European Union Horizon 2020 research and innovation under grant agreement No. 811087. SSL was funded by an FCT CEEC contract for Principal Investigator reference 2018CEECIND/02170/2018 and CB was funded by a FCT SFRH/BD/141034/2018 PhD fellowship. NMS and IGC Fish Facilities were supported from the research infrastructure Congento, co-financed by Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa 2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF) and FCT under the project LISBOA-01-0145-FEDER-022170. Publisher Copyright: Copyright © 2023 Bota, Martins and Lopes.During vertebrate development, symmetry breaking occurs in the left-right organizer (LRO). The transfer of asymmetric molecular information to the lateral plate mesoderm is essential for the precise patterning of asymmetric internal organs, such as the heart. However, at the same developmental time, it is crucial to maintain symmetry at the somite level for correct musculature and vertebrae specification. We demonstrate how left-right signals affect the behavior of zebrafish somite cell precursors by using live imaging and fate mapping studies in dand5 homozygous mutants compared to wildtype embryos. We describe a population of cells in the vicinity of the LRO, named Non-KV Sox17:GFP+ Tailbud Cells (NKSTCs), which migrate anteriorly and contribute to future somites. We show that NKSTCs originate in a cluster of cells aligned with the midline, posterior to the LRO, and leave that cluster in a left-right alternating manner, primarily from the left side. Fate mapping revealed that more NKSTCs integrated somites on the left side of the embryo. We then abolished the asymmetric cues from the LRO using dand5−/− mutant embryos and verified that NKSTCs no longer displayed asymmetric patterns. Cell exit from the posterior cluster became bilaterally synchronous in dand5−/− mutants. Our study revealed a new link between somite specification and Dand5 function. The gene dand5 is well known as the first asymmetric gene involved in vertebrate LR development. This study revealed a new link for Dand5 as a player in cell exit from the maturation zone into the presomitic mesoderm, affecting the expression patterns of myogenic factors and tail size.publishersversionpublishe

Zebrafish motile cilia as a model for primary ciliary dyskinesia

Funding Information: Funding: This work was a product of the Project LYSOCIL funded by the European Union Horizon 2020 research and innovation under grant agreement No 811087. It received funding from Fundação para a Ciencia e tecnologia, grant PTDC/BEX-BID/1411/2014; M.R. was funded by the fellowship PD/BD/136927/2018. P.S was funded by the fellowship SFRH/BD/111611/2015; C.B. was funded by the fellowship SFRH/BD/141034/2018; SSL was funded by FCT CEEC-IND 2018. Funding Information: Acknowledgments: The authors want to thank the Fish Facility from NMS. This work was developed with the support of the Fish Facility NMS|FCM that is part of CONGENTO, a Research Infrastructure co-financed by Lisboa Regional Operational Programme (Lisboa2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF) and Fundação para a Ciência e Tecnologia (Portugal) LISBOA-01-0145-FEDER-022170. A.P. wants to thank the Royal Brompton and Harefield hospital, part of the Guy’s and St Thomas’ foundation trust, London. Publisher Copyright: © 2021 by the authors. Licensee MDPI, Basel, Switzerland.Zebrafish is a vertebrate teleost widely used in many areas of research. As embryos, they develop quickly and provide unique opportunities for research studies owing to their transparency for at least 48 h post fertilization. Zebrafish have many ciliated organs that include primary cilia as well as motile cilia. Using zebrafish as an animal model helps to better understand human diseases such as Primary Ciliary Dyskinesia (PCD), an autosomal recessive disorder that affects cilia motility, currently associated with more than 50 genes. The aim of this study was to validate zebrafish motile cilia, both in mono and multiciliated cells, as organelles for PCD research. For this purpose, we obtained systematic high-resolution data in both the olfactory pit (OP) and the left–right organizer (LRO), a superficial organ and a deep organ embedded in the tail of the embryo, respectively. For the analysis of their axonemal ciliary structure, we used conventional transmission electron microscopy (TEM) and electron tomography (ET). We characterised the wild-type OP cilia and showed, for the first time in zebrafish, the presence of motile cilia (9 + 2) in the periphery of the pit and the presence of immotile cilia (still 9 + 2), with absent outer dynein arms, in the centre of the pit. In addition, we reported that a central pair of microtubules in the LRO motile cilia is common in zebrafish, contrary to mouse embryos, but it is not observed in all LRO cilia from the same embryo. We further showed that the outer dynein arms of the microtubular doublet of both the OP and LRO cilia are structurally similar in dimensions to the human respiratory cilia at the resolution of TEM and ET. We conclude that zebrafish is a good model organism for PCD research but investigators need to be aware of the specific physical differences to correctly interpret their results.publishersversionpublishe

Early mobilisation in critically ill COVID-19 patients: a subanalysis of the ESICM-initiated UNITE-COVID observational study

Background Early mobilisation (EM) is an intervention that may improve the outcome of critically ill patients. There is limited data on EM in COVID-19 patients and its use during the first pandemic wave. Methods This is a pre-planned subanalysis of the ESICM UNITE-COVID, an international multicenter observational study involving critically ill COVID-19 patients in the ICU between February 15th and May 15th, 2020. We analysed variables associated with the initiation of EM (within 72 h of ICU admission) and explored the impact of EM on mortality, ICU and hospital length of stay, as well as discharge location. Statistical analyses were done using (generalised) linear mixed-effect models and ANOVAs. Results Mobilisation data from 4190 patients from 280 ICUs in 45 countries were analysed. 1114 (26.6%) of these patients received mobilisation within 72 h after ICU admission; 3076 (73.4%) did not. In our analysis of factors associated with EM, mechanical ventilation at admission (OR 0.29; 95% CI 0.25, 0.35; p = 0.001), higher age (OR 0.99; 95% CI 0.98, 1.00; p ≤ 0.001), pre-existing asthma (OR 0.84; 95% CI 0.73, 0.98; p = 0.028), and pre-existing kidney disease (OR 0.84; 95% CI 0.71, 0.99; p = 0.036) were negatively associated with the initiation of EM. EM was associated with a higher chance of being discharged home (OR 1.31; 95% CI 1.08, 1.58; p = 0.007) but was not associated with length of stay in ICU (adj. difference 0.91 days; 95% CI − 0.47, 1.37, p = 0.34) and hospital (adj. difference 1.4 days; 95% CI − 0.62, 2.35, p = 0.24) or mortality (OR 0.88; 95% CI 0.7, 1.09, p = 0.24) when adjusted for covariates. Conclusions Our findings demonstrate that a quarter of COVID-19 patients received EM. There was no association found between EM in COVID-19 patients' ICU and hospital length of stay or mortality. However, EM in COVID-19 patients was associated with increased odds of being discharged home rather than to a care facility. Trial registration ClinicalTrials.gov: NCT04836065 (retrospectively registered April 8th 2021)

Prevalence, associated factors and outcomes of pressure injuries in adult intensive care unit patients: the DecubICUs study

Funder: European Society of Intensive Care Medicine; doi: http://dx.doi.org/10.13039/501100013347Funder: Flemish Society for Critical Care NursesAbstract: Purpose: Intensive care unit (ICU) patients are particularly susceptible to developing pressure injuries. Epidemiologic data is however unavailable. We aimed to provide an international picture of the extent of pressure injuries and factors associated with ICU-acquired pressure injuries in adult ICU patients. Methods: International 1-day point-prevalence study; follow-up for outcome assessment until hospital discharge (maximum 12 weeks). Factors associated with ICU-acquired pressure injury and hospital mortality were assessed by generalised linear mixed-effects regression analysis. Results: Data from 13,254 patients in 1117 ICUs (90 countries) revealed 6747 pressure injuries; 3997 (59.2%) were ICU-acquired. Overall prevalence was 26.6% (95% confidence interval [CI] 25.9–27.3). ICU-acquired prevalence was 16.2% (95% CI 15.6–16.8). Sacrum (37%) and heels (19.5%) were most affected. Factors independently associated with ICU-acquired pressure injuries were older age, male sex, being underweight, emergency surgery, higher Simplified Acute Physiology Score II, Braden score 3 days, comorbidities (chronic obstructive pulmonary disease, immunodeficiency), organ support (renal replacement, mechanical ventilation on ICU admission), and being in a low or lower-middle income-economy. Gradually increasing associations with mortality were identified for increasing severity of pressure injury: stage I (odds ratio [OR] 1.5; 95% CI 1.2–1.8), stage II (OR 1.6; 95% CI 1.4–1.9), and stage III or worse (OR 2.8; 95% CI 2.3–3.3). Conclusion: Pressure injuries are common in adult ICU patients. ICU-acquired pressure injuries are associated with mainly intrinsic factors and mortality. Optimal care standards, increased awareness, appropriate resource allocation, and further research into optimal prevention are pivotal to tackle this important patient safety threat

Correction to: Prevalence, associated factors and outcomes of pressure injuries in adult intensive care unit patients: the DecubICUs study

The original version of this article unfortunately contained a mistake

Prevalence, associated factors and outcomes of pressure injuries in adult intensive care unit patients: the DecubICUs study

Funder: European Society of Intensive Care Medicine; doi: http://dx.doi.org/10.13039/501100013347Funder: Flemish Society for Critical Care NursesAbstract: Purpose: Intensive care unit (ICU) patients are particularly susceptible to developing pressure injuries. Epidemiologic data is however unavailable. We aimed to provide an international picture of the extent of pressure injuries and factors associated with ICU-acquired pressure injuries in adult ICU patients. Methods: International 1-day point-prevalence study; follow-up for outcome assessment until hospital discharge (maximum 12 weeks). Factors associated with ICU-acquired pressure injury and hospital mortality were assessed by generalised linear mixed-effects regression analysis. Results: Data from 13,254 patients in 1117 ICUs (90 countries) revealed 6747 pressure injuries; 3997 (59.2%) were ICU-acquired. Overall prevalence was 26.6% (95% confidence interval [CI] 25.9–27.3). ICU-acquired prevalence was 16.2% (95% CI 15.6–16.8). Sacrum (37%) and heels (19.5%) were most affected. Factors independently associated with ICU-acquired pressure injuries were older age, male sex, being underweight, emergency surgery, higher Simplified Acute Physiology Score II, Braden score 3 days, comorbidities (chronic obstructive pulmonary disease, immunodeficiency), organ support (renal replacement, mechanical ventilation on ICU admission), and being in a low or lower-middle income-economy. Gradually increasing associations with mortality were identified for increasing severity of pressure injury: stage I (odds ratio [OR] 1.5; 95% CI 1.2–1.8), stage II (OR 1.6; 95% CI 1.4–1.9), and stage III or worse (OR 2.8; 95% CI 2.3–3.3). Conclusion: Pressure injuries are common in adult ICU patients. ICU-acquired pressure injuries are associated with mainly intrinsic factors and mortality. Optimal care standards, increased awareness, appropriate resource allocation, and further research into optimal prevention are pivotal to tackle this important patient safety threat

Testing the role of asymmetric migratory behaviors found in a novel population of mesendodermal cells

Abstract During vertebrate development, symmetry breaking occurs in the left-right (LR) organizer (LRO). The transfer of asymmetric molecular information to the lateral plate mesoderm is essential for the precise patterning of asymmetric internal organs, such as the heart. However, it is also necessary to maintain symmetry at the somite level for correct musculature and vertebrae specification. In this study, we investigated the effects of LR signals on the behavior of zebrafish somite cell precursors. Here, we demonstrate how LR signals affect the behavior of zebrafish somite cell precursors. We describe a population of cells in the vicinity of the LRO, named Non-KV Sox17:GFP+ Tailbud Cells (NKSTCs), which migrate anteriorly and contribute to future somites. We showed that NKSTCs originate in a cluster of cells aligned with the midline, posterior to the LRO, and leave that cluster in an LR alternating manner, primarily from the left side. Fate mapping revealed that more NKSTCs integrated into somites on the left side of the embryo. To investigate the role of asymmetric cues from the LRO, we used dand5-/- mutant embryos and found that NKSTCs no longer displayed asymmetric patterns. Cell exit from the posterior cluster became bilaterally synchronous in dand5-/- embryos, revealing a new link between somite specification and Dand5 function. Moreover, we observed compromised anterior movement and reduced myoD expression in the absence of the KV, indicating its role in tailbud cell movement and somite specification. Our findings demonstrate the asymmetric behavior of somite precursor cells in response to LR signals in vivo, which requires Dand5, and suggest an additional role for the KV in tailbud cell movement and somite specification. Additionally, using single-molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH), we quantified the number of dand5 mRNA transcripts in 3D in the KV over time. We found that dand5 asymmetry is already established at 6 ss, which is one hour earlier than previously reported by less sensitive methods, and primarily occurs on the anterior side of the KV. Overall, our findings demonstrate the asymmetric behavior of somite precursor cells in response to LR signals in vivo, which requires Dand5, and suggest an additional role for the KV in tailbud cell movement and somite specification. This study provides new insights into dand5 asymmetric expression in zebrafish and sets the foundation for studying the involvement of other genes of the LR cascade in this context. Our results have implications for understanding the role of asymmetric cues in the formation of symmetric structures and provide insights into the mechanisms underlying embryonic development.Resumo Externamente, o corpo dos vertebrados é simétrico bilateralmente, no entanto, órgãos como o coração, intestino, pâncreas e fígado, pulmões e a vasculatura apresentam uma assimetria relativamente ao eixo Esquerda-Direita (ED), no que diz respeito ao seu posicionamento e/ou morfologia, numa disposição conservada denominada de situs solitus. O estabelecimento do eixo ED ocorre durante a embriogénese num processo coordenado após o estabelecimento dos eixos Antero-Posterior (AP) e Dorso-Ventral (DV). Esta assimetria é estabelecida durante o desenvolvimento embrionário por meio de um processo altamente regulado que envolve o organizador esquerda-direita (OED). O OED é responsável pela quebra da simetria bilateral através de um fluxo de fluido assimétrico que é gerado por cílios móveis. Este fluxo assimétrico leva a uma diminuição na expressão do mRNA de Dand5, um potente inibidor de sinalização Nodal, no lado esquerdo do OED, o que permite que Nodal, uma proteína envolvida no estabelecimento e transdução da assimetria ED, persista apenas no lado esquerdo da placa mesodérmica lateral (PML). Desta forma, uma cascata de eventos de expressão genética é desencadeada que resultam no desenvolvimento de órgãos internos com assimetria ED. No peixe-zebra, o OED é chamado de Vesícula de Kupffer (VK), esta é uma estrutura esférica e monociliada dentro da qual está presente um fluído e que se desenvolve durante os primeiros estadios de segmentação no final posterior da notocorda. A VK é derivada de um agregado de células superficiais localizadas perto do escudo embrionário, conhecidas como Células Percursoras Dorsais (CPD). As CPDs formam um padrão de roseta plana e circular, que depois coalesce numa estrutura tridimensional com uma cavidade central preenchida com fluido. À medida que a VK se forma, o influxo de fluido e a ciliogénese coincidem, resultando na expansão do lúmen e de cada célula da VK origina um único cílio que se estende para o lúmen. Subsequentemente, a VK passa por uma remodelação estrutural ao longo do eixo AP, levando a uma distribuição assimétrica das células ciliadas. Este processo depende de uma complexa interação de vários fatores, incluindo rearranjos no citoesqueleto induzidos pela notocorda, acúmulo de matriz extracelular, a função da Rho quinase Rock2b, Miosina não-muscular II e forças mecânicas de arrasto sobre a VK provocadas pelo movimento das células da cauda. A expressão do gene dand5 na VK é inicialmente simétrica, no entanto, no estadio de 8 sómitos (ss), a sua expressão passa a ser assimétrica, estando mais expresso no lado direito, num processo que é dependente do fluxo assimétrico no sentido anti-horário. O fluxo é gerado pelos cílios móveis e detetado pelo complexo de policistinas Pkd1l1 e Pkd2, no entanto o exato mecanismo de deteção do fluxo ainda não é completamente conhecido. Todavia, recentes descobertas sugerem que o Bicc1 tem um papel importante na desestabilização e inibição da tradução de dand5, tanto em ratos quanto em sapos, no lado esquerdo do OED, de uma maneira que é dependente do fluxo. Esse processo envolve a ação conjunta de Dicer1 e Pkd2, embora ainda não esteja claro se Bicc1 e Dicer cooperam na regulação de microRNAs para mediar a diminuição de dand5. Além disso, o mecanismo preciso pelo qual o Bicc1 interage com a região 3'-UTR de dand5 no peixe-zebra ainda não é conhecido, portanto, mais estudos são necessários.´ O gene nodal do peixe-zebra southpaw (spaw) desempenha um papel crucial no estabelecimento e transdução da assimetria ED. Inicialmente, spaw é expresso bilateralmente num padrão simétrico nas células adjacentes à VK por volta dos 4-6 ss. Por volta dos 10-12 ss, a expressão de spaw torna-se assimétrica no lado esquerdo da PML devido à remoção da inibição Dand5-Southpaw. Tal mecanismo permite que Spaw induza a expressão de seu mRNA, que subsequentemente se espalha da região posterior para a anterior do lado esquerdo da PML até aos 22 ss. O confinamento de Spaw no lado esquerdo é alcançado por meio de diferentes fatores secretados da família TGF-β. Lefty1 fornece uma barreira na linha média, Lefty2 cria uma barreira anterior no campo cardíaco esquerdo e a sinalização BMP forma uma barreira posterior. Juntos, estes processos coordenam o estabelecimento e a manutenção da assimetria ED no peixe-zebra que se traduz numa organogénese assimétrica posteriormente. Tão crucial como a quebra da simetria durante o desenvolvimento embrionário, é manter a simetria em estruturas como os sómitos que são a base para a musculatura simétrica, vertebras e inervação. Os sómitos formam-se de forma periódica e simétrica a partir da mesoderme pre somítica que não é segmentada num processo chamado de somitogénese. Este processo ocorre por meio de um mecanismo de clock de segmentação e frente de onda. O comprimento de cada somito é regulado por uma combinação do período do clock e da velocidade da frente de onda, regulado por gradientes morfogénicos de FGF, Wnt e ácido retinóico (RA). Embora a via de padronização ED instrua o desenvolvimento embrionário para a formação de padrões assimétricos, existem pistas moleculares compartilhadas para formar estruturas tanto simétricas quanto assimétricas. Nomeadamente, é sugerido que a sinalização por RA contraria os efeitos de dessincronização da via ED nos sómitos. No Capítulo 2, o nosso objetivo foi testar a presença de assimetrias in vivo no movimento das células precursoras durante a formação dos sómitos. Através da utilização de live imaging e da linha transgénica Tg(sox17:GFP), observámos que um grupo de células próximas à VK apresenta assimetrias ao adquirir posições cada vez mais anteriores sucessivamente no lado esquerdo, bem como em número. Ao seguir estas células até às 24 horas pós-fertilização, confirmámos que estas células integram os sómitos e de uma forma alternada, contudo mais proeminente no lado esquerdo. Confirmámos também que estas assimetrias são dependentes das pistas moleculares ED, pois embriões mutantes homozigotas para dand5 não apresentam assimetrias tanto na posição como no número de células e a sua integração nos sómitos é simétrica. Assim, os nossos resultados sugerem que as células precursoras dos sómitos exibem um comportamento assimétrico in vivo em resposta a sinais ED e que requerem a presença da proteína Dand5, secretada pelas células da VK. No Capítulo 3, investigámos o papel da VK nas células adjacentes. Descrevemos que a partir dos 10 ss, a presença da VK afeta uma população de células localizadas posteriormente à mesma. Observámos que essas células passam de um estado agregado para um estado migratório após entrarem em contato com a VK e migram em direção à região anterior, contribuindo para a formação dos sómitos. Para avaliar esta interação, examinámos o comportamento das células adjacentes no botão caudal em embriões sem VK, a fim de compreender melhor a sua função. Para isso, recorremos à ablação a laser das células precursoras da VK. Os nossos resultados mostraram que a ausência de VK comprometeu o movimento anterior e reduziu a expressão de myoD, sugerindo a sua importância no movimento das células do botão caudal e na especificação dos sómito. Estes resultados fornecem evidências preliminares de que a VK desempenha um papel crítico na especificação dos sómitos, tanto por meio de sinalização quanto possivelmente por um mecanismo mecânico. Portanto, descrevemos um papel adicional da VK no desenvolvimento embrionário do peixe-zebra. Por fim, o Capítulo 4 apresenta a implementação de um novo protocolo de hibridação in situ de fluorescência de single molecule (smFISH) em embriões wholemount de peixe-zebra com o objetivo de fornecer dados de maior resolução para uma melhor compreensão da dinâmica temporal e espacial da diminuição do lado esquerdo da expressão de dand5 durante a quebra de simetria. Este estudo identificou padrões de expressão assimétricos mais precoces de mRNA dand5 no polo anterior esquerdo da VK, sugerindo que as células anteriores do lado esquerdo são as primeiras a detetar o fluxo, e é nestas onde a maquinaria por trás da degradação do mRNA dand5 pode ser ativada. Assim, mostrámos que a assimetria do dand5 é estabelecida aos 6 ss, uma hora antes do que estava previamente descrito por métodos menos sensíveis. Os nossos resultados são congruentes com estudos prévios acerca da mecânica do fluxo na VK e da dinâmica de mRNA, contribuindo para uma melhor compreensão dos mecanismos subjacentes à quebra de simetria no peixe-zebra.Em conclusão, o nosso estudo relata a ligação entre o primeiro gene assimétrico no estabelecimento do eixo ED, dand5, e do OED nos movimentos da cauda de embriões de peixe zebra, estabelecendo assim a base para estudar o envolvimento de outros genes da cascata ED neste contexto. Os resultados apresentados nesta tese têm implicações para a compreensão do papel de sinais assimétricos na formação de estruturas simétricas e fornecem informações sobre os mecanismos subjacentes ao desenvolvimento embrionário. Além disso, esclarecemos o momento em que a assimetria de dand5 é estabelecida no peixe-zebra, proporcionando novas perspetivas para a compreensão do estabelecimento da assimetria ED em vertebrados

Onde viver é possível : reflexões teórico-práticas de arquitectura e arte

Dissertação de Mestrado Integrado em Arquitectura, apresentada ao Departamento de Arquitectura da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra

Do outro lado : fronteiras do global : uma aproximação a Tijuana

Prova final de Licenciatura em Arquitectura