Trematodes in Mediterranean coastal habitats: Transmission, life cycles and detection Methods

1. Introducción general Los metazoos trematodos (Platyhelminthes) son componentes ubicuos de los ecosistemas naturales entando temporal o permanentemente presentes en más de la mitad de las especies animales (Bush y col. 2001, Prietrock & Marcogliese 2003). Los parásitos trematodos pueden encontrarse en un amplio rango de condiciones y hábitats, teniendo un gran impacto en los procesos ecológicos: mediante la regulación de las poblaciones de hospedadores (Hudson y col. 2006) y afectando a la estructura de las comunidades y redes tróficas (ej. Mouritsen & Poulin 2002, Thompson y col. 2005, Lafferty y col. 2006, 2008). Son sobre todo, los parásitos que son transmitidos a través de la cadena trófica los que afectan a un gran número de especies de hospedadores, condicionan la estabilidad de las redes tróficas, sus interacciones, longitud y flujo de energía (Thompson y col. 2005, Lafferty y col. 2008). .En el Mediterráneo Occidental existe una gran riqueza de especies, encontrándose la mayor diversidad de peces e invertebrados en aguas de la plataforma continental. Las masas de agua de la plataforma continental constituyen el 20% del Mar Mediterráneo, por lo que tienen un papel importante en los procesos ecológicos (Bartoli & Gibson 2007, Coll y col. 2008). Los platelmintos constituyen el 6,7% del total de la diversidad de especies del Mediterráneo, siendo sin embargo poco conocidos, con menos del 50% descritas (Coll y col. 2008). Bartoli & Gibson (2007) aumentaron en gran medida nuestro conocimiento sobre platelmintos trematodos lagunares, al recopilar información sobre 72 especies nominales de lagunas del Mediterráneo Occidental, de las cuales aportaron el ciclo vital completo de 56. Los trematodos son los parásitos más comunes en hábitats intermareales de sedimento blando (Sousa 1991, Mouritsen & Poulin 2002, Poulin & Mouritsen 2006), siendo además de gran importancia en lagunas (Bartoli & Boudouresque 2007). El hábitat intermareal se caracteriza por fluctuaciones extremas de los factores abióticos (Palacín y col. 1991, Koutsoubas y col. 2000), con pequeños cambios en el nivel del agua que, por la evaporación, pueden exponer a los moluscos a altas temperaturas y salinidades elevadas (6°C a 30°C y de 21‰ a 38‰, respectivamente, Solé y col. 2009). Los moluscos, que constituyen del 15 al 25% de la macrofauna bentónica (Coll y col. 2008), son hospedadores de una gran variedad de parásitos, normalmente estados larvales de trematodos digeneos (Lauckner 1980). Las lagunas suelen ser utilizadas como zonas de alimentación y cría de aves y peces, por lo que la transmisión de los estados vitales de los trematodos entre los diferentes hospedadores podría verse facilitada gracias a su proximidad (Bartoli & Prévot 1986, Bouchereau & Guelorget 1998¸ Koutsoubas y col. 2000, Soppelsa y col. 2007). Durante el siglo pasado, las actividades pesqueras han evolucionado desde la producción a pequeña escala a la explotación industrializada y extensiva. Esta evolución de las pesquerías también ha sido evidente en el Mediterráneo. Por otra parte se sabe que tanto las costas marinas como la biodiversidad del Mediterráneo se ven amenazadas por el impacto antropogénico, como el cambio climático o la sobreexplotación (IPCC 2001, Coll y col. 2008). Debido a la mortalidad de organismos intermareales a causa de cambios extremos de temperatura (Harley y col. 2006) y su efecto sobre la abundancia y distribución de estos organismos (Harley y col. 2006, Helmuth y col. 2006), estos hábitats han sido propuestos como sistemas tempranos de alerta para la detección del cambio climático. Además, la alta sensibilidad de los parásitos a los cambios de temperatura y la contaminación también podrían ayudar a monitorizar el impacto ecológico del cambio climático (Marcogliese 2001, Poulin & Mouritsen 2006). Además, los descartes de las pesquerías facilitan el acceso de las aves marinas a grandes cantidades de comida, particularmente peces demersales que de manera habitual serían inaccesibles (Tasker y col. 2000, Oro & Ruiz 1997). Por lo tanto, aunque se conoce el impacto de estas prácticas sobre las poblaciones de hospedadores (ej. en láridos, Oro 1996, Oro y col. 1995, 1996), los efectos sobre la transmisión de los parásitos no se ha estudiado en profundidad. La subclase Digenea (Trematoda) comprende alrededor de 18.000 especies nominales (Cribb y col. 2001, Bartoli & Gibson 2007), lo que representa el mayor número de endoparásitos presentes en todas las clases de vertebrados (Bush y col 2001). La mayoría de los trematodos digeneos tienen un ciclo vital complejo que involucra tres hospedadores y diferentes estados de desarrollo (Galaktionov & Dobrovolskij 2003).Los hospedadores definitivos son por lo general vertebrados (aves o peces). Los huevos maduros se liberan al agua, normalmente a través de las heces, emergiendo una larva ciliada, el miracidio, que infecta al primer hospedador intermediario, por lo general un gasterópodo. Dentro del gasterópodo, los trematodos se reproducen de manera asexual en un esporocisto o redia, dando lugar a un gran número de cercarias que son liberadas al medio una vez maduras. Estos estados de vida libre no se alimentan, y parasitan al segundo hospedador intermediario, generalmente otro molusco o un pez, en un corto período de tiempo (menos de 24 horas). Después de la penetración en el segundo hospedador intermediario, la cercaria se enquista y se transforma en un metacercaria. De manera general, el hospedador definitivo adquiere las metacercarias infectivas a través de la cadena trófica. Cada etapa del ciclo vital del parásito muestra una estrategia de transmisión diferente y específica para completar con éxito el ciclo vital (Combes y col. 2002). Las etapas de vida libre de trematodos, es decir, los huevos, miracidios y cercarias, dependen de sus propios recursos energéticos y están directamente expuestos a los cambios ambientales, lo que condiciona la interacción entre los parásitos y sus potenciales hospedadores. Por lo tanto, los factores ambientales abióticos y bióticos influyen en el éxito de transmisión de los estados larvales de vida libre, en especial de las cercarias durante la búsqueda del siguiente hospedador, alterando su supervivencia o infectividad (Fingerut y col. 2003, Pietrock & Marcogliese 2003, Thieltges y col. 2008). Cabe destacar que los hábitats lagunares están caracterizados por grandes cambios ambientales y una alta heterogeneidad interna. La comprensión de los efectos de estos factores ambientales sobre la emergencia de cercarias es importante para estimar el impacto de las condiciones cambiantes en la transmisión y el ciclo vital de un parásito. Las instalaciones de acuicultura y los descartes provocan que diferentes grupos de hospedadores (peces, Bozzano & Sarda 2002; aves, Oro & Ruiz 1997 y gasterópodos, Morton & Yuen 2000) se concentren en la misma zona, por lo que la transmisión del parásito se ve facilitada. La atracción hacia instalaciones de acuicultura de potenciales hospedadores definitivos, como aves piscívoras (Witt y col. 1981, Arcos y col. 2001, Christel y col. 2012), puede, por lo tanto, intensificar la transmisión de parásitos. El impacto ambiental de las actividades pesqueras e instalaciones de acuicultura hacen que sea primordial estudiar posibles ciclos vitales que podrían verse favorecidos bajo estas condiciones. La coexistencia de dos organismos en un sistema parásito-hospedador se caracteriza por la obtención de beneficios por parte del parásito (ej. energía o espacio) a expensas del hospedador, por lo que un parásito, por definición, afectará a su hospedador de diferentes maneras (Lauckner 1980, 1983, Price 1980). Por lo general, el tamaño del hospedador es un factor importante para los trematodos, existiendo un compromiso entre el número de cercarias que emergen de un gasterópodo y su tamaño, proveyendo más espacio y nutrientes aquellos hospedadores más grandes (Loker 1983, McCarthy y col. 2002, Poulin & Morand 2004). Asimismo, se ha observado en varias especies la existencia de un efecto acumulativo de parásitos relacionado con el tamaño del hospedador (ej. Thomas y col. 1995, Karvonen y col. 2003, Osset y col. 2005). La mortalidad inducida por la acumulación de parásitos, por la cual los individuos más infectados son eliminados de la población (Rousset y col. 1996, Poulin 2001), se ha descrito tanto en peces como en invertebrados. Dada la corta vida de las cercarias, la sincronización de la emergencia tiene que estar optimizada para facilitar la transmisión al siguiente hospedador intermediario (Combes y col. 1994). La distribución de los hospedadores es igualmente importante, existiendo incluso parásitos que manipulan el comportamiento del hospedador en el que se encuentran para aumentar las probabilidades de alcanzar al siguiente hospedador (Poulin 2007). En cualquier sistema, la combinación de varios factores influye en la emergencia del parásito, así como a su transmisión y ciclo vital, teniendo que tener en cuenta la interdependencia de los factores a la hora de estudiar un sistema. La combinación de diferentes técnicas, como el empleo de herramientas moleculares, el desarrollo de experimentos y la implementación de técnicas nuevas para la detección de infecciones, es necesaria para obtener una visión holística del sistema parásito-hospedador estudiado. 2 Justificación y objetivos La presente tesis tiene cuatro propósitos generales: (i) describir un sistema parásito-hospedador común en lagunas del Mediterráneo que se ajusta a las condiciones en el hábitat intertidal, (ii) aumentar el conocimiento sobre los factores que juegan un papel importante en la emergencia, transmisión y desarrollo de las diferentes etapas larvales, (iii) proporcionar nuevas evidencias sobre la mayor precisión de los métodos moleculares para detectar infecciones en gasterópodos, teniendo también en cuenta sus desventajas, y (iv) ampliar nuestro conocimiento sobre el rango de hospedadores y la transmisión de las fases del ciclo vital de Cardiocephaloides longicollis, un parásito digeneo que está altamente presente en el Mediterráneo y que está integrado en sus redes tróficas. Los objetivos específicos a desarrollar son los siguientes: I.- Identificación morfológica y molecular de dos morfotipos diferentes de cercarias emergidas del caracol Gibbula adansonii, común en el hábitat intermareal de la laguna del Delta del Ebro, determinando las tasas de infección, así como su relación filogenética con especies de trematodos cercanas. II.- Evaluación experimental del efecto de los cambios en la temperatura, la salinidad, el fotoperiodo y el nivel de agua sobre la emergencia de larvas de Cainocreadium labracis y Macvicaria obovata, desde su primer hospedador intermediario G. adansonii, mediante técnicas in vitro, en el contexto de sus estrategias de encuentro del siguiente hospedador intermediario. III.- Comparación de métodos tradicionales de detección de infecciones en el primer hospedador intermediario, por emergencia y herramientas moleculares, con una PCR dúplex específicamente diseñada para la detección de estados larvales en gasterópodos, tanto en infecciones simples como dobles. Se utilizarán dos sistemas de parásito-hospedador presentes en el hábitat intermareal: i) dos especies de trematodo, C. labracis y M. obovata, que co-habitan en gasterópodo G. adansonii, desarrollándose en esporocistos y cuya interacción interespecífica no se ha estudiado, y ii) dos especies de trematodo, Maritrema novaezealandensis y Philophthalmus sp. , que co-habitan en el gasterópodo Zeacumantus subcarinatus, desarrollándose en esporocistos y redias, respectivamente, del cual se conoce su competencia interespecífica. IV.- Diferenciación morfológica y cuantificación de los estados larvales de desarrollo en esporocistos, y subsecuente descripción de los patrones de maduración en esporocistos de C. labracis y M. obovata infectando a G. adansonii durante los meses de primavera, cuando este gasterópodo se encuentra en el hábitat intermareal de la laguna del Delta del Ebro. Se determinará si existe un vínculo entre la maduración de las larvas y la migración del gasterópodo. V.- Detección a gran escala de potenciales hospedadores (moluscos, peces y aves) para documentar el espectro de hospedadores y la carga parásita de C. longicollis en el Mediterráneo, determinando también el microhábitat marino al que se dirigen las cercarias, comparando los niveles de infección en peces de diferentes hábitats. VI.- Cuantificación de las metacercarias de C. longicollis en los encéfalos de espáridos para analizar el efecto del tamaño de los peces en su acumulación a lo largo del tiempo, y explorar el papel de los factores antropogénicos como la pesca y la acuicultura, que puedan intensificar la transmisión de metacercarias al hospedador final. 3. Materiales y métodos generales En este resumen los materiales y métodos se describen por separado para cada una de las secciones correspondientes. A continuación se resumen los estudios realizados, estructurados por capítulos. 4. Identificación molecular y morfológica de opecoélidos larvales (Digenea: Opecoelidae) parasitando caracoles prosobranquios en una laguna del Mediterráneo Occidental 4. 1. Introducción Las hábitats costeros de las lagunas mediterráneas son áreas donde se lleva a cabo la reproducción y crecimiento de muchas especies de peces (Franco y col. 2006, 2011, Ribeiro y col. 2006, Verdiell-Cubedo y col. 2007). Además, los parásitos trematodos representan una parte importante de las comunidades marinas de los hábitats intermareales, ya que la naturaleza confinada de las lagunas permite que existan las condiciones propicias para la transmisión de los parásitos con ciclos vitales complejos, es decir, con dos o más hospedadores intermediarios. A pesar de que Bartoli y Gibson (2007) dilucidaron, en su revisión bibliográfica sobre digeneos del Mediterráneo Occidental, el ciclo vital de un total de 56 especies de trematodos, entre las referencias empleadas no existen muchos datos sobre los rasgos morfológicos que podrían ayudar a la identificación de las larvas en futuros estudios. Opecoelidae es una familia de parásitos cosmopolita, con al menos 25 especies parasitando peces marinos en el Mediterráneo Occidental (Bartoli y col. 2005). Sin embargo, sólo se conoce el ciclo vital completo de cuatro de ellas, probablemente por la falta de empleo de técnicas moleculares. Entre los ciclos conocidos se encuentra el de la especie Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) (Maillard 1971, 1974, 1976). En un estudio sobre los digeneos en moluscos de la laguna de “Els Alfacs” en el Delta del Ebro (España), se encontraron infecciones en dos moluscos: Gibbula adansonii (Payraudeau, 1826) (Prosobranchia, Trochidae), que contenía esporocistos con dos morfotipos de cercarias cotilocercas, y Cyclope neritea (L., 1758) (Prosobranchia, Nassariidae), que albergaba metacercarias. Durante el presente trabajo presentamos evidencias moleculares y morfológicas para la identificación de los estados larvales de dos especies de opecoélidos encontrados en dos moluscos. 4. 2. Materiales y métodos Se recogieron un total de 514 G. adansonii y 129 C. neritea en la laguna de “Els Alfacs” (Delta del Ebro, España) desde marzo a julio de los años 2010 y 2011. Después de recoger manualmente los caracoles del sedimento fangoso y sobre las hojas de Zostera noltii Hornemann, 1832, se transportaron al laboratorio en agua marina aireada. Para la extracción de ADN se utilizaron de dos a cuatro cercarias de cada morfotipo y dos metacercarias, fijadas en etanol 100% y disueltas en 300µl de tampón de extracción TNES-urea. Estas muestras se disolvieron durante la noche a 55ºC en 100µg ml-1 de proteinasa K, siguiendo después un protocolo fenol-cloroformo para extracción de ADN (Holzer y col. 2004). El ADN se resuspendió y disolvió en 40µl de agua nanopura durante la noche. Las amplificación del ADN por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se llevó a cabo con un termociclador en un volumen final de 30µl, conteniendo ≈0.5 unidades de polimerasa ThermoPrime Plus DNA y el correspondiente tampón (10x), que contiene 1.5mM MgCl2 (ABgene), 0.2 mM de cada dNTP, 0.5µM de cada primer, y aproximadamente 100ng de la muestra de ADN. Se amplificaron y purificaron dos fragmentos de ADN ribosomal: la secuencia completa de la región ITS (ITS1+5.8S+ITS2) y la secuencia parcial de la región 28S. Después de ensamblar las secuencias con Bioedit v7.0.5. (©1997–2005; Hall 1999), las secuencias resultantes de ITS se alinearon con secuencias de otros opecoélidos obtenidas en GenBank (Mafft v5.531 (Katoh y col. 2002), Gblocks v 2.0 (Castresana 2000)). Para estimar la posición de las secuencias generadas en relación a otros miembros de la familia Opecoelidae se llevaron a cabo análisis de Neighbour-joining (NJ) con MEGA5 (Tamura y col. 2011) e inferencia filogénica con máxima verosimilitud (ML) con RAxML (Stamatakis 2006). Se usó el programa FigTree v1.3.1 (Rambaut 2009) para la visualización de los árboles generados. Después de la emisión espontánea de cercarias de los caracoles G. adansonii, se estudió inicialmente la morfología de las cercarias con la tinción in vivo rojo neutro. Después, las muestras se fijaron en etanol al 70% y se tiñeron con carmín alumínico o acetocarmín férrico, se deshidrataron en series de etanol y se clarearon en dimetilftalato, para ser montados en una preparación con bálsamo de Canadá. Las metacercarias encontradas en C. nerita se sacaron del quiste y se estudiaron bajo el microscopio. Se tomaron fotografías con una cámara Leica DC300 acoplada a un microscopio DMR. Para el estudio de cercarias en el microscopio electrónico de barrido (SEM), se fijaron muestras en glutaraldehido al 2.5% o en etanol al 70%. Después de lavar los especímenes con tampón fosfatos 0.1M (pH 7.4), se deshidrataron en series de acetona, se secaron hasta punto crítico con CO2 y se revistieron por bombardeo iónico con oro. Las muestras se estudiaron con un voltaje de aceleración de 4kV (JEOL JSM 7401-F). 4. 3. Resultados Se obtuvieron secuencias completas de ITS ADNr y parciales de 28S ADNr de los dos morfotipos de cercarias emergidas de G. adansonii y de las metacercarias encontradas en C. neritea. Después del alineamiento de las 20 secuencias disponibles de ITS de otros opecoélidos, se seleccionaron las regiones no ambiguas para llevar a cabo el análisis filogenético (con NJ y ML). Los dos análisis revelaron la misma posición relativa de las secuencias nuevas respecto a las más cercanas filogenéticamente: las secuencias del morfotipo pequeño y de la metacercaria encontrada en C. neritea formaron un clado diferenciado, junto a muestras de Macvicaria obovata. El morfotipo grande también formó un clado monofilético separado, junto a secuencias de Cainocreadium labracis, siendo la divergencia en ambos casos inferior a la divergencia interespecífica de los géneros Macvicaria spp. (2,8–11,9%) y Cainocreadium spp. (5,3-9,4%). Se tomaron medidas para la descripción morfológica de los dos morfotipos de cercarias, así como las de los esporocistos que las contenían, y de la metacercaria encontrada en C. neritea. Además, se describió el comportamiento de las cercarias y su patrón de receptores sensoriales, utilizando fotografías con microscopía electrónica de barrido (SEM) para destacar algunos rasgos morfológicos de las dos cercarias, como por ejemplo las papilas que forman parte del sistema sensorial. Dependiendo del mes de muestreo, la prevalencia de C. labracis fue de 17,6-30,8%, mientras que la de M. obovata fue de 0,9-23,1%. Tanto los esporocistos como las cercarias de M. obovata resultaron tener un tamaño menor que los de C. labracis (M. obovata, longitud esporocitos (µm) 600-1650, longitud cercarias (µm) 196-296 (media 248); C. labracis, longitud esporocitos (µm) 900-2377, longitud cercarias (µm) 208-402 (media 294). Ambas cercarias, al tener una cola de tipo cotilocerco, se sujetaron al sustrato después de su emergencia desde G. adansonii, mostrando C. labracis movimientos laterales pendulares, más vigorosos en presencia de luz. Macviacria obovata, con movimientos más lentos, contraía y expandía el cuerpo, balanceándose en presencia de luz. 4. 4. Discusión La identificación de digeneos se suele basar en la morfología de los adultos, siendo la dilucidación de sus ciclos vitales una tarea difícil. Por lo tanto, el uso de herramientas moleculares es de gran ayuda para la identificación de estados larvales. Los estudios de Jousson y otros autores (Jousson y col. 1999, 2000, Jousson & Bartoli 2000, 2001, Bartoli & Jousson 2003) aportaron 17 secuencias de opecoélidos adultos encontrados en peces del Mediterráneo con los que comparar e identificar estados larvales de esta familia. La detallada descripción morfológica junto con los análisis moleculares que se han llevado a cabo, han permitido la identificación de dos opecoélidos que infectan al caracol G. adansonii como primer hospedador intermediario como Macvicaria obovata (Molin, 1859) (morfotipo pequeño) y Cainocreadium labracis (Dujardin, 1845) (morfotipo grande). Además, la metacercaria de C. neritea se identificó como M. obovata, por lo que también sabemos que este parásito especie utiliza a este gasterópodo como segundo hospedador intermediario. Se recopilaron datos de otras cercarias cotilocercas descritas en el Mediterráneo y las costas del Atlántico nororiental, para comparar las principales características. Las cercarias de C. labracis diferían del resto al presentar glándulas de penetración mucho mayores, coincidiendo además con la descripción de Maillard (1971) y Dufour & Maillard (1974). Aunque el número de glándulas de penetración de M. obovata coincide

Method for Isolation‬ ‪of Myxozoan proliferative stages‬ ‪from fish at high yield and purity:‬ ‪An essential prerequisite for in vitro,‬ ‪in vivo and genomics-based‬ ‪research developments.

Myxozoans are a diverse group of microscopic cnidarian parasites and some representatives are associated with important diseases in fish, in both marine and freshwater aquaculture systems. Research on myxozoans has been largely hampered by the inability to isolate myxozoan parasites from their host tissues. In this study, we developed and optimized a method to isolate the myxozoan proliferative stages of different size and cellularity from fish blood, using DEAE-cellulose ion exchange chromatography. We optimized several parameters and obtained 99–100% parasite purity, as well as high survival and infectivity. Using polyclonal pan-carp blood cell-specific antibodies, we further developed a rapid cytometric assay for quantification of the proliferative stages, not only in highly concentrated DEAE-C isolates but also in dilute conditions in full blood. Early developmental stages of myxozoans are key to parasite proliferation, establishment, and pathology in their hosts. The isolation of these stages not only opens new possibilities for in vivo and in vitro studies, but also for obtaining purified DNA and protein extracts for downstream analyses. Hence, we provide a long-desired tool that will advance the functional research into the mechanisms of host exploitation and immune stimulation/evasion in this group, which could contribute greatly to the development of therapeutic strategies against myxozoans

Selection of suitable reference genes for gene expression studies in myxosporean (Myxozoa, Cnidaria) parasites

Myxozoans (Cnidaria: Myxozoa) are an extremely diversified group of endoparasites some of which are causative agents of serious diseases in fish. New methods involving gene expression studies have emerged over the last years to better understand and control myxozoan diseases. Quantitative RT-PCR is the most extensively used approach for gene expression studies. However, the accuracy of the results depends on the normalization of the data to reference genes. We studied the expression of eight commonly used reference genes, adenosylhomocysteinase (AHC1), beta actin (ACTB), eukaryotic translation elongation factor 2 (EF2), glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1), DNA-directed RNA polymerase II (RPB2), 18S ribosomal RNA (18S), 28S ribosomal RNA (28S) across different developmental stages of three myxozoan species, Sphaerospora molnari, Myxobolus cerebralis and Ceratonova shasta, representing the three major myxozoan linages from the largest class Myxosporea. The stable reference genes were identified using four algorithms: geNorm, NormFinder, Bestkeeper and ΔCq method. Additionally, we analyzed transcriptomic data from S. molnari proliferative and spore-forming stages to compare the relative amount of expressed transcripts with the most stable reference genes suggested by RT-qPCR. Our results revealed that GAPDH and EF2 are the most uniformly expressed genes across the different developmental stages of the studied myxozoan species.Fil: Kosakyan, Anush. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República ChecaFil: Alama Bermejo, Gema. Universidad Nacional del Comahue. Centro de Investigación Aplicada y Transferencia Tecnológica en Recursos Marinos "Almirante Storni". - Provincia de Río Negro. Ministerio de Agricultura, Ganadería y Pesca. Centro de Investigación Aplicada y Transferencia Tecnológica en Recursos Marinos "Almirante Storni". Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet Centro Nacional Patagónico. Centro de Investigación Aplicada y Transferencia Tecnológica en Recursos Marinos "Almirante Storni"; Argentina. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República Checa. State University of Oregon; Estados UnidosFil: Bartošová-Sojková, Pavla. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República ChecaFil: Born-Torrijos, Ana. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República ChecaFil: Šíma, Radek. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República ChecaFil: Nenarokova, Anna. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República Checa. University of South Bohemia; República ChecaFil: Eszterbauer, Edit. Hungarian Academy Of Sciences; HungríaFil: Bartholomew, Jerri. State University of Oregon; Estados UnidosFil: Holzer, Astrid Sybylle. Academy of Sciences of the Czech Republic. Biology Centre. Institute of Parasitology; República Chec

Cercarial behaviour alters the consumer functional response of three-spined sticklebacks

This is the peer reviewed version of the following article: Born-Torrijos, A., Paterson, R., van Beest, G., Vyhlídalová, T., Henriksen, E.H., Knudsen, R., Kristoffersen, R., Amundsen, P.-A. & Soldánová, M. (2021). Cercarial behaviour alters the consumer functional response of three-spined sticklebacks. Journal of Animal Ecology, 90, 978-988, which has been published in final form at https://doi.org/10.1111/1365-2656.13427. This article may be used for non-commercial purposes in accordance with Wiley Terms and Conditions for Use of Self-Archived Versions. This article may not be enhanced, enriched or otherwise transformed into a derivative work, without express permission from Wiley or by statutory rights under applicable legislation. Copyright notices must not be removed, obscured or modified. The article must be linked to Wiley’s version of record on Wiley Online Library and any embedding, framing or otherwise making available the article or pages thereof by third parties from platforms, services and websites other than Wiley Online Library must be prohibited. Free-living parasite life stages may contribute substantially to ecosystem biomass and thus represent a significant source of energy flow when consumed by non-host organisms. However, ambient temperature and the predator's own infection status may modulate consumption rates towards parasite prey. We investigated the combined effects of temperature and predator infection status on the consumer functional response of three-spined sticklebacks towards the free-living cercariae stages of two common freshwater trematode parasites (Plagiorchis spp., Trichobilharzia franki). Our results revealed genera-specific functional responses and consumption rates towards each parasite prey: Type II for Plagiorchis spp. and Type III for T. franki, with an overall higher consumption rate on T. franki. Elevated temperature (13°C) increased the consumption rate on Plagiorchis spp. prey for sticklebacks with mild cestode infections ( High consumption of cercarial prey by sticklebacks may impact parasite population dynamics by severely reducing or even functionally eliminating free-living parasite life stages from the environment. This supports the potential role of fish as biocontrol agents for cercariae with similar dispersion strategies, in instances where functional response relationships have been established. Our study demonstrates how parasite consumption by non-host organisms may be shaped by traits inherent to parasite transmission and dispersal, and emphasises the need to consider free-living parasite life stages as integral energy resources in aquatic food webs. </ol

Method for Isolation of Myxozoan Proliferative Stages from Fish at High Yield and Purity: An Essential Prerequisite for In Vitro, In Vivo and Genomics-Based Research Developments

Myxozoans are a diverse group of microscopic cnidarian parasites and some representatives are associated with important diseases in fish, in both marine and freshwater aquaculture systems. Research on myxozoans has been largely hampered by the inability to isolate myxozoan parasites from their host tissues. In this study, we developed and optimized a method to isolate the myxozoan proliferative stages of different size and cellularity from fish blood, using DEAE-cellulose ion exchange chromatography. We optimized several parameters and obtained 99&ndash;100% parasite purity, as well as high survival and infectivity. Using polyclonal pan-carp blood cell-specific antibodies, we further developed a rapid cytometric assay for quantification of the proliferative stages, not only in highly concentrated DEAE-C isolates but also in dilute conditions in full blood. Early developmental stages of myxozoans are key to parasite proliferation, establishment, and pathology in their hosts. The isolation of these stages not only opens new possibilities for in vivo and in vitro studies, but also for obtaining purified DNA and protein extracts for downstream analyses. Hence, we provide a long-desired tool that will advance the functional research into the mechanisms of host exploitation and immune stimulation/evasion in this group, which could contribute greatly to the development of therapeutic strategies against myxozoans

RNAi-directed knockdown in the cnidarian fish blood parasite Sphaerospora molnari

Abstract RNA interference (RNAi) is an effective approach to suppress gene expression and monitor gene regulation. Despite its wide application, its use is limited in certain taxonomic groups, including cnidarians. Myxozoans are a unique group of cnidarian parasites that diverged from their free-living ancestors about 600 million years ago, with several species causing acute disease in farmed and wild fish populations. In this pioneering study we successfully applied RNAi in blood stages of the myxozoan Sphaerospora molnari, combining a dsRNA soaking approach, real-time PCR, confocal microscopy, and Western blotting. For proof of concept, we knocked down two unusual actins, one of which is known to play a critical role in S. molnari cell motility. We observed intracellular uptake of dsRNA after 30 min and accumulation in all cells of the typical myxozoan cell-in-cell structure. We successfully knocked down actin in S. molnari in vitro, with transient inhibition for 48 h. We observed the disruption of the cytoskeletal network within the primary cell and loss of the characteristic rotational cell motility. This RNAi workflow could significantly advance functional research within the Myxozoa, offering new prospects for investigating therapeutic targets and facilitating drug discovery against economically important fish parasites

Cercariae of a Bird Schistosome Follow a Similar Emergence Pattern under Different Subarctic Conditions: First Experimental Study

The emergence of cercariae from infected mollusks is considered one of the most important adaptive strategies for maintaining the trematode life cycle. Short transmission opportunities of cercariae are often compensated by periodic daily rhythms in the cercarial release. However, there are virtually no data on the cercarial emergence of bird schistosomes from freshwater ecosystems in northern latitudes. We investigated the daily cercarial emergence rhythms of the bird schistosome Trichobilharzia sp. “peregra” from the snail host Radix balthica in a subarctic lake under both natural and laboratory seasonal conditions. We demonstrated a circadian rhythm with the highest emergence during the morning hours, being seasonally independent of the photo- and thermo-period regimes of subarctic summer and autumn, as well as relatively high production of cercariae at low temperatures typical of northern environments. These patterns were consistent under both field and laboratory conditions. While light intensity triggered and prolonged cercarial emergence, the temperature had little effect on cercarial rhythms but regulated seasonal output rates. This suggests an adaptive strategy of bird schistosomes to compensate for the narrow transmission window. Our results fill a gap in our knowledge of the transmission dynamics and success of bird schistosomes under high latitude conditions that may serve as a basis for elucidating future potential risks and implementing control measures related to the spread of cercarial dermatitis due to global warming

Temperature does not influence functional response of amphipods consuming different trematode prey

This is a post-peer-review, pre-copyedit version of an article published in Parasitology Research. The final authenticated version is available online at: http://dx.doi.org/https://doi.org/10.1007/s00436-020-06859-1.Direct consumption on free-living cercariae stages of trematodes by non-host organisms interferes with trematode transmission and leads to reduced infections in the next suitable hosts. Consumer functional responses provide a useful tool to examine relationships between consumption rates and ecologically relevant prey densities, whilst also accounting for abiotic factors that likely influence consumption rates. We investigated how temperature influences the consumer functional response of the amphipod Gammarus lacustris towards the cercariae of three freshwater trematodes (Diplostomum, Apatemon and Trichobilharzia). Amphipods displayed different functional responses towards the parasites, with Type II responses for Diplostomum and Type I responses for Apatemon prey. Temperature did not alter the consumption rate of the amphipod predator. Trichobilharzia was likely consumed at similar proportions as Diplostomum; however, this could not be fully evaluated due to low replication. Whilst Type II responses of invertebrate predators are common to various invertebrate prey types, this is the first time a non-filter feeding predator has been shown to exhibit Type I response towards cercarial prey. The prey-specific consumption patterns of amphipods were related to cercarial distribution in the water column rather than to the size of cercariae or temperature influence. The substantial energy flow into food webs by non-host consumer organisms highlights the importance of understanding the mechanisms that modulate functional responses and direct predation in the context of parasitic organisms

Data from: The joint evolution of the Myxozoa and their alternate hosts: a cnidarian recipe for success and vast biodiversity

The relationships between parasites and their hosts are intimate, dynamic and complex; the evolution of one is inevitably linked to the other. Despite multiple origins of parasitism in the Cnidaria, only parasites belonging to the Myxozoa are characterized by a complex life cycle, alternating between fish and invertebrate hosts, as well as by exceptionally high species diversity. This inspired us to examine the history of reciprocal interactions and adaptive radiations in myxozoans and their hosts by determining the degree of congruence between their phylogenies and by timing the emergence of myxozoan lineages in relation to their hosts. Recent genomic analyses suggested a common origin of Polypodium hydriforme, a cnidarian parasite of acipenseriform fishes, and the Myxozoa, and proposed fish as original hosts for both sister lineages. We clearly demonstrate that the Myxozoa emerged long before fish populated Earth and that phylogenetic congruence with their invertebrate hosts is evident down to the most basal branches of the tree, indicating bryozoans and annelids as original hosts and challenging previous hypothesis. We provide evidence that, following invertebrate invasion, fish hosts were acquired multiple times, leading to parallel cospeciation patterns in all major phylogenetic lineages. We identify the acquisition of vertebrate hosts that facilitate alternative transmission and dispersion strategies as reason for the distinct success of the Myxozoa, and identify massive host specification-linked parasite diversification events. The results of this study transform our understanding of the origins and evolution of parasitism in the most basal metazoan parasites known