Ispitivanje optimalnih uvjeta proizvodnje hidrolaza iz proklijalih zrna ječma i pšenice

The production of hydrolases from cereals has been examined in order to investigate food-derived enzymes as an alternative source to microbial enzymes for the use in food processes. For that, the influence of temperature on the pretreatment, imbibition and germination of barley and wheat grains was determined by measuring the β-glucosidase, β-galactosidase and lipase activities using a design of experiments. The evaluation of the statistical model showed an increase of the β-glucosidase activity with low imbibition and low germination temperature for barley grains and low imbibition and high germination temperature for wheat grains. The maximum β-glucosidase activity in wheat extracts was (585±151) nkat per g of dry mass (dm), while in barley extracts it was (109±15) nkat per g of dm. The maximum β-galactosidase activities in barley and wheat extracts were (34±12) and (63±23) nkat per g of dm, respectively. The maximum lipase activities of (6.7±0.1) and (4.6±4.4) nkat per g of dm in barley and wheat extracts, respectively, were rather low compared to the glycosidase activities. The extracts were also tested for other hydrolase activities (e.g. peptidase and α-amylase activities). The insights obtained enable the basis for the potential use of cereal hydrolases in food processing, which might be attractive to consumers.U radu je ispitana proizvodnja hidrolaza iz žitarica te mogućnost njihove primjene umjesto mikrobnih enzima u proizvodnji hrane. Istražen je utjecaj temperature na predobradu, namakanje te klijanje zrna ječma i pšenice radi praćenja aktivnosti β-glukozidaze, β-galaktozidaze i lipaze. Statistički je model pokazao da je aktivnost β-glukozidaze porasla pri niskim temperaturama namakanja i klijanja zrna ječma, te pri niskoj temperaturi namakanja i visokoj klijanja zrna pšenice. Maksimalna je aktivnost β-glukozidaze u ekstraktima pšenice bila (585±151) nkat/g, a u ekstraktima ječma (109±15) nkat/g suhe tvari, dok je najveća aktivnost β-galaktozidaze u ječmu bila (34±12) nkat/g, a u pšenici (63±23) nkat/g. U usporedbi s glikozidazom, maksimalna je aktivnost lipaze bila bitno manja i iznosila je (6,7±0,14) nkat/g suhe tvari ječma, i (4,6±4,4) nkat/g suhe tvari pšenice. Ispitane su i aktivnosti ostalih hidrolaza u ekstraktima, kao što su npr. peptidaza i α-amilaza. Rezultati ovog istraživanja čine osnovu moguće primjene hidrolaza iz žitarica u preradi hrane, što bi moglo privući pažnju kupaca

Immobilisierung der Penicillin G Acylase an funktionalisierte Trägerpartikel für biotechnologische Anwendungen

In dieser Arbeit wurde die Immobilisierung des Modellenzyms Penicillin G Acylase (EC 3.5.1.11) von E.coli untersucht. Sowohl die Beladung als auch die spezifische Aktivität des Enzyms wurde durch Optimierungen verbessert. Durch Circulardichroismus-Messungen wurde die Sekundärstruktur des immobilisierten Enzyms bestimmt. Synthese der Polymerpartikel Es wurden nicht-poröse magnetische Polymerpartikel erhalten, die über eine hohe mechanische Stabilität verfügen und in organischen Lösungsmitteln, sowie wässrigen Systemen von pH 3.5 bis 12 stabil sind. Diese können in wässrigen Medien zwei Jahre lang gelagert werden. Sie weisen eine hohe magnetische Sättigung auf, die eine magnetische Separierung ermöglicht und stellen 500 µmol/g Oberflächengruppen für die Funktionalisierung durch Spacer zur Verfügung. Der mittlere Teilchendurchmesser lag unter 5 µm und die spezifische Oberfläche im Bereich von ~ 2 bis ~ 5 m2/g. Die Polymethylacrylat-Partikel verfügten über ein Zetapotential bei pH 7.5 von -28 mV und die Polyvinylacetat-Partikel von +3.4 mV. Daraus ergeben sich Träger, die hervorragend für die Immobilisierung geeignet sind, da sie preisgünstig (< 10 �/g), leicht separierbar und stabil sind, sowie eine hohe Beladung ermöglichen. Auf Grund der geringen Größe der Partikel entstehen keine hohen Diffusionslimitierungen. Funktionalisierung mit Spacern Die Polymerpartikel wurden mit Hexamethylendiamin aktiviert und mit zwei verschiedenen Spacern funktionalisiert. Der erste Spacer (Hexamethylendiamin-Glutardialdehyd-Spacer, HG-Spacer) besteht aus einer Abfolge von Hexamethylendiamin und Glutardialdehyd, der zweite Spacer (Aminosäurespacer, AS-Spacer) besteht aus Aminosäuren. Die Längenvariation (bezogen auf ideal linearisierte Spacermoleküle) des HG-Spacers umfasste einen weiten Bereich (14.6 nm). Die Verwendung von Spacern mit variablen Aminosäuren stellt einen neuartigen Ansatz dar, der auf Grund der Vielzahl von Aminosäuren mit unterschiedlicher Seitenkette eine hohe Variabilität der Struktur ermöglicht. Die verwendete Immobilisierungsmethode mittels Glutardialdehyd erlaubt Arbeiten in wässrigen Medien (kein Lösungsmittelaustausch), besaß eine hohe Ausbeute und ist preiswert. Diese Methode wurde zudem durch Variation der Reaktionsparameter weiter verbessert. Der HG-Spacer wurde in seiner Länge von 1.62 bis 16.2 nm variiert und das Enzym Penicillin G Acylase (EC 3.5.1.11 von E.coli) immobilisiert. Dabei ergab sich, dass eine maximale spezifische Aktivität von 42.2 U/mg (U = Unit [µmol/min], freies Enzym: 42.0 mg/g bei gleichem Aktivitätstest) bei einer Menge von 24.0 mg/g aktivem Enzym auf den Partikeln erreicht wurde. Der AS-Spacer wurde in seiner Länge von 2.9 bis 9.1 nm und durch die Verwendung von verschiedenen Aminosäuren (alpha-Aminobutylsäure, Asparaginsäure, Glycin, Lysin, Phenylalanin und Prolin) modifiziert. Die maximale Beladung wurde mittels des reinen Lysinspacers mit 60.5 mg/g erreicht (5.3 nm), während die maximale Menge an aktivem Enzym beim Phenylalaninspacer mit 19.1 U/mg bei 2.9 nm erreicht wurde. Aufklärung der Sekundärstruktur Die Penicillin G Acylase wurde durch eine 1D-Gelelektrophorese aufgetrennt und gereinigt, durch Trypsin in Peptidfragmente abgebaut und mittels Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS/MS) charakterisiert (Proteindatenbank-Eintrag 1h2g, molare Masse 86192 g/mol). Anschließend wurden die Partikel (Silica-Nanopartikel, Ludox®-HS40 von Grace Davison) mit Glutardialdehyd funktionalisiert und das Enzym kovalent daran gebunden. Dabei wurde die Beladung bis zur Sättigung (55.8 mg/g) erhöht, die Ausbeute sank dabei aber auf 14%. Die kovalente Immobilisierung des Enzyms auf diesen Silica-Nanopartikeln (12 nm Durchmesser, monodispers) änderte die Struktur des Enzyms nur sehr gering: Der mit Circulardichroismus-Messungen bestimmte Anteil an alpha-Helices stieg um 0.5%, der Anteil der beta-Faltblätter um 2.2%, dafür sank der Anteil der beta-Schleifen um 1.6% und der des ungeordnete Strukturanteils um 1.1%. Die spezifische Aktivität sank allerdings mit zunehmender Beladung rapide: Von 22.1 bis 9.17 U/mg. Screening-Methode für Immobilisierungen Es wurden vergleichende Messungen im µl-Maßstab zur Kinetik von Enzymimmobilisierungen an Oberflächen und erzielbare maximale Beladung erstmalig mit der Quarzkristallmikrowaagen-Technik durchgeführt. Die Methode stellt wegen der geringen benötigten Mengen eine ideale Screening-Methode im Vergleich zu klassischen Synthesemethoden und biochemischen Charakterisierungsverfahren (wie Hydrolyse eines Substrates) dar

Investigation of the Germination of Barley and Wheat Grains with a Design of Experiments for the Production of Hydrolases

The production of hydrolases from cereals has been examined in order to investigate food-derived enzymes as an alternative source to microbial enzymes for the use in food processes. For that, the influence of temperature on the pretreatment, imbibition and germination of barley and wheat grains was determined by measuring the β-glucosidase, β-galactosidase and lipase activities using a design of experiments. The evaluation of the statistical model showed an increase of the β-glucosidase activity with low imbibition and low germination temperature for barley grains and low imbibition and high germination temperature for wheat grains. The maximum β-glucosidase activity in wheat extracts was (585±151) nkat per g of dry mass (dm), while in barley extracts it was (109±15) nkat per g of dm. The maximum β-galactosidase activities in barley and wheat extracts were (34±12) and (63±23) nkat per g of dm, respectively. The maximum lipase activities of (6.7±0.1) and (4.6±4.4) nkat per g of dm in barley and wheat extracts, respectively, were rather low compared to the glycosidase activities. The extracts were also tested for other hydrolase activities (e.g. peptidase and α-amylase activities). The insights obtained enable the basis for the potential use of cereal hydrolases in food processing, which might be attractive to consumers

Comparison of Targeted (HPLC) and Nontargeted (GC-MS and NMR) Approaches for the Detection of Undeclared Addition of Protein Hydrolysates in Turkey Breast Muscle

The adulteration of fresh turkey meat by the undeclared addition of protein hydrolysates is of interest for fraudsters due to the increase of the economic gain by substituting meat with low cost ingredients. The aim of this study was to compare the suitability of three different analytical techniques such as GC-MS and 1H-NMR with HPLC-UV/VIS as a targeted method, for the detection of with protein hydrolysates adulterated turkey meat. For this, turkey breast muscles were treated with different plant- (e.g., wheat) and animal-based (e.g., gelatin, casein) protein hydrolysates with different hydrolyzation degrees (15&ndash;53%: partial; 100%: total), which were produced by enzymatic and acidic hydrolysis. A water- and a nontreated sample (REF) served as controls. The data analyses revealed that the hydrolysate-treated samples had significantly higher levels of amino acids (e.g., leucine, phenylalanine, lysine) compared with REF observed with all three techniques concordantly. Furthermore, the nontargeted metabolic profiling (GC-MS and NMR) showed that sugars (glucose, maltose) and/or by-products (build and released during acidic hydrolyses, e.g., levulinic acid) could be used for the differentiation between control and hydrolysates (type, degrees). The combination of amino acid profiling and additional compounds gives stronger evidence for the detection and classification of adulteration in turkey breast meat