Role of transcription factors in the functional development of gamma-delta T lymphocytes

Tese de mestrado em Bioquímica, apresentada à Universidade de Lisboa, através da Faculdade de Ciências, 2014O contacto contínuo com o exterior e a vasta exposição a patogéneos levou a que, durante a evolução, organismos superiores desenvolvessem mecanismos de protecção especializados. O sistema imunitário, constituído por um vasto número de células e tecidos especializados, pode ser subdividido em dois grupos – sistema imune inato ou adaptativo – de acordo com o tipo de resposta que é desenvolvido. As células do sistema imune inato, maioritariamente localizadas em locais de alto contacto com o exterior (p.e. o epitélio), caracterizam-se pela sua resposta não especializada – e portanto, inata – que permite um rápido controlo de infecções. As células T γδ, natural killer (NK) e macrófagos são exemplos de células pertencentes a este tipo de imunidade. Por outro lado, células do sistema imune adaptativo como as células T e células B, possuem a capacidade de desenvolver uma resposta mais duradora e especializada, que lhes permite não só combater mais eficazmente uma infecção mas também desenvolver uma memória imunitária. Uma característica funcional partilhada entre as células do sistema imune inato e adaptativo é a produção de citocinas. A sua produção e consequente secreção permitem uma melhor e mais eficaz resolução de uma infecção, através do recrutamento e activação de células do sistema imune para o local afectado. Os linfócitos T γδ em conjunto com os linfócitos T αβ CD4, produzem citocinas pro-inflamatórias como o IFN-γ e a IL-17A. Todavia, as células T γδ distinguem-se dos últimos pela sua rápida capacidade de resposta a estímulos externos, através da produção e secreção de citocinas na periferia. Esta característica advém da diferenciação dos seus progenitores em células T γδ especializadas na produção de IFN- γ (CD27+) ou de IL-17A (CD27-) no timo, ao passo que linfócitos T CD4 abandonam o timo sob a forma de linfócitos naïve, necessitando de estímulos prolongados para que se diferenciem em linfócitos T efectores. Os mecanismos moleculares que regulam os processos de diferenciação e produção de citocinas encontram-se extensamente estudados em linfócitos T αβ. O factor de transcrição T-bet, por exemplo, regula a diferenciação dos linfócitos T CD4 em linfócitos Th1 CD4 bem como a produção de IFN-γ. Contudo, pouco é conhecido relativamente aos reguladores da produção de citocinas nos linfócitos T αβ. Por esta razão propusemo-nos estudar o papel de alguns dos factores de transcrição na regulação da transcrição de citocinas como o IFN- γ e IL-17A. O paralelismo entre os linfócitos Th1 CD4 produtores de IFN- γ e os linfócitos T γδ 27+ e entre os linfócitos Th17 CD4 produtores de IL-17A e os linfócitos T γδ27- levou-nos a escolher como objecto de estudo vários factores de transcrição associados à produção destas citocinas nos linfócitos T CD4. Tendo isto, escolhemos o T-bet e o factor de transcrição Eomes, envolvido na produção de IFN-γ em linfócitos T CD8. Associados à diferenciação dos linfócitos T CD4 em Th17, vários factores de transcrição foram ainda associados à regulação da transcrição de IL-17A nestas mesmas células. De entre estes os factores de eleição para o nosso estudo foram o ROR-γt, BATF e o RORα. De modo a estudar o papel de cada factor de transcrição nos linfócitos Tγδ usámos ratinhos geneticamente modificados, nos quais cada um destes factores de transcrição se encontra deletado. Para o estudo do factor de transcrição Eomes, recorremos ao uso de ratinhos nos quais apenas células que expressam o gene RAG1 - células T e B - apresentam a deleção específica para o factor de transcrição Eomes, visto a deleção total ser letal durante a embriogénese. Através de estudos in vitro usando diversas condições de estimulação (citocinas e anticorpos monoclonais), foi-nos possível aferir quais destas permitem induzir a produção de IFN-γ em linfócitos T γδ27+ e de IL-17A em linfócitos T γδ27-. De forma a determinar o impacto que a ausência de cada factor de transcrição teria na produção de IFN-γ e IL-17A, optámos pelo o uso dos anticorpos monoclonais anti-CD3 e anti-CD28 no caso dos linfócitos T 27+ e das citocinas IL-1β mais IL-23 no caso dos linfócitos T γδ27-. É de salientar que na presença de IL-1β e IL-23 os linfócitos T γδ27-, como já anteriormente descrito pelo laboratório, demonstraram não só a capacidade de produzir outras citocinas em simultâneo – como a IL-17F e a IL-22 – mas também a capacidade de co-produzir IFN-γ e IL-17A. Os nossos resultados in vitro demonstraram que, na ausência de T-bet, os linfócitos T γδ 27+ possuem a mesma capacidade de produção de IFN-γ apesar de o número de linfócitos que produz esta citocina ser menor. Este resultado sugere que os linfócitos T γδ27+ possam depender parcialmente do T-bet. Por outro lado, a ausência do factor de transcrição Eomes não revelou diferenças na produção de IFN-γ, demonstrando que os linfócitos T γδ27+ não requerem Eomes para a produção de IFN- γ. Já a produção de IFN-g pelos linfócitos T γδ27- não sofreu quaisquer alterações na ausência tanto do factor de transcrição T-bet assim como na do Eomes. Estes resultados sugerem então que estes linfócitos apresentam um diferente mecanismo na regulação da transcrição do IFN-γ. Contudo, as experiências in vitro nem sempre replicam a realidade in vivo. Por esta razão e com o intuito de compreender os mecanismos de regulação da produção destas citocinas recorremos a dois modelos murinos – EAE e Listeria monocytogenes – nos quais foi demonstrada a presença de linfócitos T γδ27- produtores de IFN- γ. Contudo, o modelo experimental de esclerose múltipla (EAE), não nos permitiu observar a produção de IFN- γ em linfócitos T γδ. No entanto, através do uso do modelo de infecção (Listeria monocytogenes) foi possível observar que a ausência de T-bet leva a um desaparecimento completo das células co-produtoras de IFN- γ e IL-17A. Estes resultados sugerem assim, que linfócitos T γδ27- requererem o factor de transcrição T-bet para a produção de IFN- γ. A análise da produção de IL-17A em linfócitos T γδ27- demonstrou que estes são inteiramente dependentes do factor de transcrição ROR γt. Verificámos ainda que esta dependência não se encontra limitada à produção de IL-17A estendendo-se também ao desenvolvimento de uma população específica de linfócitos T γδ27- que apenas produz IL-17A, designada CCR6+ γδ27-. Foi também possível observar que os linfócitos T γδ27- não requerem os factores de transcrição BATF e RORα para a produção de IL-17A. Durante esta análise, contrariamente ao esperado, foi ainda detectado um aumento no número de linfócitos T γδ27- que produziam IL-17A na ausência do RORα. Estes resultados levaram-nos a prosseguir um estudo mais detalhado sobre o papel do RORα em linfócitos T γδ27-. Para estudar o papel do factor de transcrição ROR em células T γ foram usados ratinhos que expressam uma forma truncada, não funcional, do factor RORα. Ao investigar o papel do RORα nos linfócitos T γδ, deparámo-nos que o aumento no número de células produtoras de IL-17A não se devia a um impacto na diferenciação dos linfócitos T CCR6+ γδ27-. No entanto, observámos um aumento da proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ4 (maioritariamente produtores de IL-17A) e uma diminuição na proporção de linfócitos T γδ expressando a cadeia Vγ1 (maioritariamente produtores de IFN- γ) no seu TCR. Este aumento foi não só detectado na periferia como também no timo, em linfócitos T γδ imaturos (CD24+), sugerindo a existência de um papel do ROR no rearranjo das cadeias gamma do TCR dos linfócitos T γδ. Mais ainda, podemos observar que o aumento no número de linfócitos produtores de IL-17A, após estimulo com IL-1β mais IL-23 durante a noite, não se devia apenas a um aumento do número de linfócitos Vγ4, mas também a um aumento do número de células produtoras de IL-17A de entre a população Vγ1-Vγ4-, que acreditamos ser constituída por linfócitos T Vγ6+ γδ. Estes resultados sugerem assim que o factor de transcrição RORα possui dois papéis distintos em linfócitos T γδ , através do controlo do rearranjo das cadeias gamma dos linfócitos T γδ e da regulação da produção de IL-17 em linfócitos T V 1-Vγ 4- γδ. Em suma, os nossos resultados sugerem a existência de algumas semelhanças nos mecanismos de regulação da produção de IL-17A e IFN-γ entre os linfócitos Th1 CD4 e os linfócitos T γδ27+ e γδ27-. Especificamente, estes resultados parecem sugerir um papel do factor de transcrição RORa no desenvolvimento e produção de IL-17A em linfócitos T γδ.γδ T cells are a major source of the proinflammatory cytokines IFN- γ and IL-17, together with αβ CD4 T helper cells. However in stark contrast with the latter, one of the main features of γδ T cells is their briskness at cytokine production in the periphery. This is mostly attributable to their programmed phenotype(s) that distinguishes IFN- γ-producing CD27+ (γδ27+) and IL-17-producing CD27- (γδ27-) subsets. Importantly, γδ27+ cells are stably committed to express Ifng but not Il17, whereas γδ27- cells spontaneously make IL-17 but can be induced to produce IFN-γ (as well as IL-17F, IL-22, GM-CSF) under specific inflammatory conditions. Our understanding of the transcriptional regulators of the production of these cytokine in both γδ T cell subsets lags behind that of CD4 T cells. Here we show that γδ T cells do not rely entirely on the same transcriptional mechanisms for their functional differentiation. Remarkably, IFN- γ production by both γδ27+ and IL17+ γδ27- T cells relies on the Th1 transcription factor (TF) T-bet but is dispensable of Eomes. This suggests a T-bet-dependent module for IFN- γ production shared by conventional CD4 T cells and innate-like γδ T cells. By contrast and to our surprise, regarding the Th17 TFs and IL-17 production, neither BATF nor RORα showed to be required by γδ27- T cells, which appear to depend solely on RORγt. Interestingly, mice lacking RORα showed an increased number of IL-17-producing Vγ1-Vγ4- cells upon stimulation as well as a change in the proportion of Vγ4+ and Vγ1+ γδ T cells. Together our findings illustrate a simpler mechanism for regulation of cytokine production by γδ T cells which allows a faster response to stimulus. In addition, our work revealed a role for RORα in the development of certain γδ T cell subsets as well as in the functional differentiation of IL-17-production

Over the influence : comparing the effects of digital influencers brand ownership strategies with brand endorsement strategies.

As customers’ spending habits move towards online platforms, brands are investing in their digital connection to customers, especially through social media. In this context, brands are using their digital tools to communicate, engage and ultimately build stronger relationships with their customers. Due to the fast rise of social media, digital influencers have gained a strong voice, which gave them a privileged position to communicate effectively with their audience. With this and through endorsements, brands have increasingly been using influencers as communication touchpoints for their targets. However, some influencers have taken the bar higher by going solo and are now using their large audience and strong reputation to launch their own ventures. With this in mind, the research objectives strive to address one main goal: to understand if (and how) the relationship of the influencer with a brand (owner vs endorser) affects the customer’s brand attitude and purchase intentions. The current thesis developed an online questionnaire with 149 respondents and quantitative data was collected by randomly exposing the sample to two different scenarios: influencer as brand endorsers compared to influencers as brand owners. Results show that influencers´ ownership has a significant but lower effect on Purchase Intention and Brand Attitude when compared with influencers´ endorsement. Additionally, Perceived Quality, Brand Anthropomorphism and Brand Attachment present a significantly positive correlation with Purchase Intention and Brand Attitude. However it was concluded that these were not possible explaining factors for the significantly different results found.Com a evolução dos hábitos de consumo no sentido das plataformas digitais, as marcas estão a investir na ligação digital aos consumidores, especialmente através das redes sociais. Neste contexto, as marcas estão a utilizar ferramentas digitais para comunicar e fortalecer ligações com os consumidores. Devido ao crescimento das redes sociais, os influenciadores digitais ganharam preponderância, o que os colocou numa posição privilegiada para comunicar de forma eficaz com o seu público. Consequentemente, as marcas têm utilizado influenciadores como pontos de contacto para os seus targets, tornando-os os seus brand endorsers. Contudo, alguns influenciadores foram mais longe, ao utilizar as suas fortes reputações e alcance para lançar as próprias marcas. Assim, o objetivo desta investigação é entender se (e como) a relação do influenciador com a marca (criador da marca vs endorser) influencia a Brand Attitude e Intenção de Compra dos consumidores. Para tal, foi desenvolvido um questionário com 149 participantes e foram recolhidos dados quantitativos através da exposição aleatória da amostra a dois cenários: os influenciadores como brand endorsers comparando com os influenciadores como criadores das marcas. Os resultados obtidos mostram que a comunicação dos influenciadores como criadores de marcas tem um efeito significativo, mas inferior na Intenção de Compra e Brand Attitude quando comparado com a comunicação dos mesmos como brand endorsers. Adicionalmente, a Perceção de Qualidade, Brand Anthropomorphism e Brand Attachment têm uma correlação significativamente positiva com Intenção de Compra e Brand Attitude. Contudo, estes não podem ser considerados possíveis fatores explicativos para a diferença significativa nestes encontrada

Arquitectura e sustentabilidade: projecto de uma unidade primária de processamento de mel em medeiros-Montalegre

No âmbito da dissertação para o Mestrado Integrado em Arquitectura, propõe-se o desenvolvimento de um trabalho de interesse ambiental e social que procura dar possíveis soluções às necessidades actuais, sob o tema "Arquitectura e sustentabilidade - Projecto de um armazém agrícola destinado à instalação de uma unidade primária de processamento de mel", a localizar na aldeia de Medeiros, concelho de Montalegre. Trata-se de um aglomerado rural, onde grande parte da população se dedica à agricultura e tem respeito pela Natureza. Verifica-se que toda a construção existente é baseada em métodos de construção tradicionais e mão de obra pouco qualificada. Este é um problema que afecta não só esta pequena aldeia, como também a maior parte do meio construído, na generalidade do país. A construção civil é um dos sectores económicos mais importantes da Europa. Esta indústria é actualmente, a principal responsável pelos danos causados ao meio ambiente. A poluição, a escassez de recursos, o consumo excessivo de energias não renováveis, a intensa produção de resíduos, bem como outros indicadores preocupantes, dão conta da problemática ambiental que representa. A Arquitectura, como disciplina de enorme impacto na determinação da qualidade de vida social, participa nas condições que constroem os parâmetros de um desenvolvimento sustentável. É instrumento de planeamento privilegiado, capaz de moldar o meio físico, social e cultural do ser humano. O presente trabalho surge do seguimento da problemática supracitada, cujo principal objectivo consiste na elaboração de um sistema construtivo apoiado por tecnologias e materiais de reduzido impacto ambiental.As part of the Dissertation for the Integrated Master in Architecture, we propose the development of an environmental and social work that seeks to respond to current needs, under the theme "Architecture and sustainability – an agricultural warehouse project aimed at installing a primary honey processing unit", to be located in the village of Medeiros, Montalegre. It is a rural agglomeration, where much of the population is dedicated to agriculture, and has respect for nature. All the existing construction is based on traditional building methods and little skilled labour. This is a problem that affects not only this tiny village, but also most of the country in terms of construction environment. Civil construction is one of Europe's most important economic sectors. This industry is now primarily responsible for the damage caused to the environment, essential source of resources that enable the human existence. Pollution, resource shortages, excessive consumption of non-renewable energy sources, the intense production of waste, as well as other troubling indicators, are some of the problems that it represents. Architecture, as a discipline of huge impact in determining the quality of social life, has a role in the conditions that build sustainable development parameters. It is a privileged, planning instrument capable of shaping the social, cultural and physical environment of the human being. The present work appears within the scope of the above mentioned issues, whose main objective is to develop a constructive system supported by technology and environmentally friendly material

Cabeço Monteiro, Idanha-a-Nova

Pretende-se que este trabalho seja o reflexo de uma aprendizagem contínua do curso de arquitetura, bem como o culminar de todo esse processo. Como conclusão do mestrado integrado em arquitetura, propõe-se o desenvolvimento de uma dissertação baseada na reabilitação de aldeias abandonadas em Portugal, como base no conceito de eco aldeias, dando maior relevância à vertente arquitetónica e à sua prática. Como já foi referido, a partir da análise do conceito e dos casos já existentes de eco aldeias, pretende-se isolar os fundamentos que possam conduzir a uma arquitetura sustentável, pensada para o lugar e para as pessoas. Será alvo de um projeto de reabilitação o caso de estudo – uma aldeia que foi sendo deixada ao abandono – para se proceder à respetiva reabilitação. O objetivo máximo desta intervenção, que vai além do projeto de reabilitação urbana, é reverter a situação de abandono e proporcionar condições favoráveis para a fixação da população no local de intervenção – Cabeço Monteiro (Idanha-a-Nova).This work is a reflection of a continuous learning about architecture. It is propose the development of a dissertation with focus the urban rehabilitation abandoned villages in Portugal, based on the concept of eco villages, giving greater emphasis to architectural aspect and its practice. As already mentioned, from the analysis of the concept and existing cases of eco villages, it is intended to isolate the fundamentals that can lead to sustainable architecture, designed for the place and the people. It will be the target of urban rehabilitation a projectfor a village that was being left abandoned - to proceed to the respective rehabilitation. The ultimate goal of this intervention, which goes beyond the urban renewal project, is to reverse the situation of abandonment and provide favorable conditions for the settlement of people on site intervention - Cabeço Monteiro (Idanha-a-Nova)

Reabilitação oral na maxila atrófica

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas MonizA reabilitação oral é a área da Medicina Dentária que permite devolver ao paciente a qualidade de vida, tanto a nível funcional como estético, existente antes da perda de peças dentárias. A reabsorção óssea é um processo fisiológico que ocorre ao longo da vida, exacerbandose quando ocorre a perda de função. Assim, é importante saber como solucionar as situações em que existe necessidade de reabilitação oral, tal como quando esta é acompanhada de falta de estrutura óssea. A reabsorção óssea pode ser classificada usando a Classificação de Atwood e que se divide em 6 tipos, havendo necessidade de enxerto óssea apenas para os graus 4,5 e 6 de atrofia maxilar. O enxerto ósseo tem como objectivo preencher zonas onde ocorreu reabsorção óssea para que estas possam ser devidamente reabilitadas. Este substituto ósseo pode ter diferentes origens, podendo ser humano, animal ou mesmo sintético. Entre as diferentes técnicas de enxerto ósseo aplicadas à maxila encontramos a técnica de distracção osteogénica, a técnica de enxerto com blocos ósseos, a técnica de enxerto com osso particulado, a técnica de enxerto de elevação do soalho do seio maxilar, a técnica de enxerto interposicional e a técnica de enxerto utilizando proteínas morfogénicas. Com base em diversos artigos, a presente monografia tem como objectivo identificar as diferentes técnicas que podem ser utilizadas para solucionar problemas de reabilitação oral ao nível dos diferentes graus de atrofia da maxila

Pre-molecular assessment of self-processes in neurotypical subjects using a single cognitive behavioral intervention evoking autobiographical memory

In the last 20 years, several contributions have been published on what concerns the conceptual and empirical connections between self-processes. However, only a limited number of publications addressed the viability of those processes to characterize mental health in neurotypical subjects with a normative pattern of neurodevelopment. Furthermore, even fewer experiments focused explicitly on the complexity of studying neurotypical phenomenal data. On the one hand, this normative pattern is commonly associated with mental health and a multifaceted self-concept and well-being. On the other hand, well-being is often related to a healthy cognitive life. However, how such intricate and complex relation between self-processes is established in neurotypical subjects requires further evidence. The novelty of this work is thus studying the first-person experience, which is correlated with the mental events aroused by a cognitive behavioral intervention. The prior methodology that led to the complete characterization of a neurotypical sample was already published by the authors, although the materials, the methods, the sample screening, and the sample size study required further explanation and exploration. This paper’s innovation is hence the phenomenological assessment of subjects’ self-regulation, which is used for mental health profiling, providing the basis for subsequent molecular typing. For that matter, a convenience sample of 128 (19–25-year-old) neurotypical young adults, healthy university students at the University of Lisbon, non-medicated and with no serious, uncontrolled, or chronic diseases, are characterized according to their cognitive functioning and self-concept. The procedure comprised (i) a mental status examination (psychological assessment) and (ii) a psychological intervention, i.e., a single cognitive behavioral intervention (intervention protocol). The psychological assessment was a standardized and structured clinical interview, which comprised the use of 4 psychological scales complementary to the classical Mental Status Examination (MSE). The intervention protocol applied a combined exercise of psychophysical training and autobiographical-self memory-recalling. The results permitted identifying and isolating four different subgroups (self awareness, self consciousness, reflective self, and pre-reflective self) in neurotypical subjects with discrete self-processes. The outcome of this study is screening four different aspects of self-reflection and the isolation between various forms of self-directed attention and their interconnections in these four mental health strata. The practical implication of this study is to fulfill an a priori pre-molecular assessment of self-regulation with separate cognitive characteristics. The reliability of these mental strata, their distinct neurophysiology, and discrete molecular fingerprint will be tested in a future publication by in silico characterization, total protein profiling, and simultaneous immunodetection of the neuropeptide and neuroimmune response of the same participants.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

Effect of Candida albicans and Candida dubliniensis planktonic/biofilm quorum sensing molecules on yeast morphogenesis

One of the aims of this work was to study the effect of farnesol, a quorum sensing molecule for Candida albicans, on morphologic inhibition of Candida dubliniensis. The second goal of this work was to confirm if Candida dubliniensis also excreted quorum sensing molecules, on both planktonic and biofilm forms. The results clearly demonstrate that Candida dubliniensis undergoes morphological alterations triggered by farnesol. It was also found that supernatants of Candida dubliniensis and Candida albicans grown in both planktonic or biofilm forms contain molecules that are capable of suppressing pseudohyphae formation on Candida dubliniensis cells grown in RPMI 1640. It can be concluded that both Candida dubliniensis and Candida albicans produces quorum sensing molecules either in planktonic or biofilm forms, which regulates Candida dubliniensis morphology

Headspace - SPME as a screening system for yeast metabolic compounds: a case study

Aim: This study aimed to identify and quantify the fusel alcohols secreted by the opportunistic yeasts Candida albicans and Candida dubliniensis to further get insights into the amino acid catabolism of those two organisms. Methods and Results: Fusel alcohols were screened in cell - free supernatants of yeasts cultivated in RPMI medium. For simultaneous identification and quantification of these alcohols, a Headspace - Solid Phase Micro Extraction (HS - SPME) coupled with gas chromatography - mass spectrometry (GC - MS) methodology, previously developed to analyse the volatile composition of fruits, was followed (Coelho et al. 2006). Results obtained show that both C. albicans and C. dubliniensis produced isoamyl alcohol and 2- phenylethanol, end – products of the catabolism of the amino acids leucine and phenylalanine, respectively. Significance and Impact of the study: The HS – SPME used herein allows the simultaneous identification and quantification of compounds, requires small sample volume, has high sensitivity and reproducibility, is simple and rapid and is solvent free. This revealed to be a powerful tool for the screening system of yeast metabolic compounds