Diethylnitrosamine enhances hepatic tumorigenic pathways in mice fed with high fat diet (Hfd)

Obesity has been implicated in the genesis of metabolic syndromes including insulin resistance and Type 2 Diabetes Mellitus (T2DM). Given the association between T2DM and the risk of hepatocellular carcinoma (HCC), our specific goal was to determine whether the liver of HFD-induced T2DM mice is more sensitive to the carcinogen diethylnitrosamine (DEN), due to a modification of the molecular pathways implicated in the early stages of HCC pathogenesis. C57BL/6 male mice (five-week-old) were divided into 4 groups: C, C + DEN, HFD and HFD + DEN. Mice were euthanized twenty-five weeks after DEN-injection. Livers of HDF-fed mice showed a higher proliferative index than Control groups. In line with this, HFD groups showed an increase of nuclear β-catenin, and interestingly, DEN treatment led to a slight increase in the expression of this protein in HFD group. Based on these results, and to confirm this effect, we analyzed β-catenin target genes, finding that DEN treatment in HFD group led to a significant increase of Vegf, c-myc, c-jun and cyclin D1 expression levels. According to our results, the expression of TCF4 showed to be significantly increased in HFD + DEN vs. HFD. In this regard, the β-catenin/TCF4 complex enhanced its association with pSmads 2/3, as we observed an increase of nuclear Smads expression in HFD + DEN, suggesting a possible role of TGF-β1/Smads signaling pathway in this phenomenon. Our results show that the liver of HFD fed model that resembles early T2DM pathology in mice, is more sensitive to DEN, by inducing both Wnt/β-catenin and TGF β1/Smads tumorigenic pathways.Fil: Arboatti, Ainelén Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Lambertucci, Flavia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Sedlmeier, María Guillermina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Pisani, Gerardo Bruno. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; ArgentinaFil: Monti, Juan Alberto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Alvarez, María de Luján. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Frances, Daniel Eleazar Antonio. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Ronco, Maria Teresa. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; ArgentinaFil: Carnovale, Cristina Ester. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Rosario. Instituto de Fisiología Experimental. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas. Instituto de Fisiología Experimental; Argentin

Disruption of tumor necrosis factor alpha receptor 1 signaling accelerates NAFLD progression in mice upon a high-fat diet

Obesity is accompanied by a low-grade inflammation state, characterized by increased proinflammatory cytokines levels such as tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin-1 beta (IL-1β). In this regard, there exists a lack of studies in hepatic tissue about the role of TNFα receptor 1 (TNFR1) in the context of obesity and insulin resistance during the progression of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD). The aim of this work was to evaluate the effects of high-caloric feeding (HFD) (40% fat, for 16 weeks) on liver inflammation-induced apoptosis, insulin resistance, hepatic lipid accumulation and its progression toward nonalcoholic steatohepatitis (NASH) in TNFR1 knock-out and wild-type mice. Mechanisms involved in HFD-derived IL-1β release and impairment of insulin signaling are still unknown, so we determined whether IL-1β affects liver insulin sensitivity and apoptosis through TNFα receptor 1 (TNFR1)-dependent pathways. We showed that knocking out TNFR1 induces an enhanced IL-1β plasmatic release upon HFD feed. This was correlated with higher hepatic and epididymal white adipose tissue mRNA levels. In vivo and in vitro assays confirmed an impairment in hepatic insulin signaling, in part due to IL-1β-induced decrease of AKT activation and diminution of IRS1 levels, followed by an increase in inflammation, macrophage (resident and recruited) accumulation, hepatocyte apoptotic process and finally hepatic damage. In addition, TNFR1 KO mice displayed higher levels of pro-fibrogenic markers. TNFR1 signaling disruption upon an HFD leads to an accelerated progression from simple steatosis to a more severe phenotype with many NASH features, pointing out a key role of TNFR1 in NAFLD progression.This work was supported by research grants from Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (PIP-CONICET 112201500508, to C.E.C.) and SAF2016-75004-R and SAF2015-70270-REDT (MINECO, Spain)to P.M.S. and O.M.Peer reviewe

Estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la susceptibilidad al desarrollo de hepatocarcinoma en modelos experimentales con alteraciones metabólicas como la diabetes mellitus

La diabetes mellitus (DM) supone un desorden metabólico caracterizado por la presencia de hiperglicemia crónica, que se acompaña de alteraciones en el metabolismo de los hidratos de carbono, de las proteínas y los lípidos. El origen y la etiología de la DM pueden ser muy diversos, pero conlleva de forma inexorable a la existencia de alteraciones en la secreción de insulina, en la sensibilidad a la acción de la hormona, o en ambas en algún momento de su historia natural. Específicamente la DM es considerada una patología inflamatoria que contribuye al desarrollo de otras enfermedades. Durante la diabetes el hígado está expuesto a altas concentraciones de citoquinas características de un cuadro inflamatorio. Además, los pacientes con DM1 reciben, desde el inicio de la patología, insulina en dosis farmacológicas que puede promover alteraciones en el balance entre proliferación y muerte celular en el hígado. La DM se sitúa entre las primeras causas de muerte en la mayoría de los países desarrollados, debido tanto a la alteración metabólica en sí misma, como a las complicaciones macro y microvasculares derivadas de ella y entre otras a la alteración hepática [26]. Desde hace relativamente poco tiempo se ha sugerido un riesgo dos veces superior de enfermedad hepática en los pacientes diabéticos [27]. El cáncer de hígado es uno de los tumores malignos más comunes en todo el mundo. El carcinoma hepatocelular o hepatocarcinoma (HCC) representa alrededor del 80%-90% de todos los cánceres de hígado y es la quinta causa más común de mortalidad [28, 29]. Su incidencia está creciendo drásticamente en el mundo occidental debido al incremento de afecciones hepáticas de base, siendo una de ellas el estado diabético, que produce en el hígado modificaciones que aumentan la sensibilización del mismo a desarrollar HCC [30, 31]. El riesgo de desarrollar HCC se da tanto en pacientes con DM1 como así también en aquellos con DM2 en los cuales la obesidad, el síndrome metabólico y el progresivo desarrollo de esteatohepatitis no-alcohólica, llevaría a la consecuente cirrosis y posterior desarrollo de cáncer. La dietilnitrosamina (DEN) es un conocido y potente agente hepatocarcinógeno [53–55]. La exposición al DEN se ha asociado con la acumulación hepatocelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) [37], lo que puede provocar daños oxidativos en el ADN. Asi mismo se sabe que el DEN induce daño en muchas enzimas involucradas en la reparación del ADN [51, 52, 59, 60]. Teniendo en cuenta lo descripto anteriormente el objetivo de nuestro trabajo fue analizar los posibles mecanismos moleculares involucrados en la sensibilización del hígado en el estado de diabetes mellitus al desarrollo del hepatocarcinoma. En una primera etapa del presente estudio utilizamos ratones C57BL/6 a los que se les administró STZ con el fin de establecer el cuadro diabético (DM1). Los ratones fueron tratados con insulina diariamente y una única dosis no necrogénica de DEN. En este modelo analizamos el balance entre apoptosis y proliferación celular, sabiendo que este balance juega un rol importante en el desarrollo del cáncer [61–63]. Observamos que tanto la apoptosis como la proliferación celular se encuentran modificadas en el estado diabético y frente al tratamiento con DEN, mostrando un desbalance entre ambos eventos, en favor de la proliferación. El hígado de los ratones diabéticos tratados con insulina es más sensible al efecto del tratamiento con DEN, ya que observamos un incremento significativo del índice de proliferación (IP), que favorecería en las células la alteración del ciclo celular, que es esencial, en la etapa temprana, para la transformación maligna. Asimismo, el análisis histopatológico puso de manifiesto lesiones hepáticas promovidas por el estado diabético, siendo muchas de ellas irreversibles. En conjunto, nuestros resultados muestran una mayor sensibilidad hepática al tratamiento con DEN en el estado DM1+I, lo que sugiere que el grado de inflamación crónica, el aumento de los niveles de ROS y las alteraciones en el balance del ciclo celular derivado del tratamiento con insulina, entre otros factores, podrían jugar un papel fundamental en su sensibilización. Por otro lado evaluamos posibles marcadores tumorales tempranos de la iniciación del desarrollo de hepatocarcinoma en nuestro modelo de DM1 inducida por ETZ y tratadas con insulina. Nuestros resultados nos permiten sugerir como posibles marcadores tumorales a: p53 nuclear, VEGF, miR-122, COX-2 y -catenina nuclear. Todas estas variables se encuentran modificadas en el hígado diabético tratado con insulina previo al estímulo con el cancerígeno DEN, de manera que estarían poniendo de manifiesto la predisposición o sensibilización del órgano a desarrollar un tumor ya sea en la progresión misma de la enfermedad o frente a la exposición de agentes cancerígenos. En una segunda etapa, nuestro modelo de estudio fueron ratones C57BL/6 a los cuales se les indujo DM2 mediante una dieta rica en grasa (HFD) y recibieron una única dosis no necrogénica de DEN. Actualmente existen pruebas claras de que la DM2 y el HCC están estrechamente vinculados, debido a su asociación con la obesidad, la sensibilidad a la insulina disminuida y el NAFLD [238]. En nuestro trabajo demostramos que la DM2 inducida por HFD representa un factor de riesgo que aumenta la sensibilidad a la alteración del ciclo celular hepático inducida por DEN, indicada por un aumento en el IP, que es esencial, en las primeras etapas, para la transformación maligna. Por otro lado, nuestros resultados demuestran que en los hígados de ratones DM2 inducidos por HFD hay niveles nucleares más altos de proteínas involucradas en la regulación del ciclo celular como la ciclina D1 y la ciclina E1. El análisis histopatológico nos permitió observar alteraciones hepáticas, reversibles (esteatosis) e irreversibles (necrosis), promovidas por la DM2 inducida por HFD, que podría tornar al hígado más susceptible al desarrollo de un HCC por el tratamiento con DEN. Analizamos en nuestro modelo de DM2 inducida por HFD la cascada de señalización de Wnt/-catenina, que es descripta como fundamental en el desarrollo y crecimiento del hígado, así como en carcinogénesis. La acumulación nuclear de - catenina conduce a la activación de reconocidos genes target como Vegf, c-myc, c-jun y ciclina D1 [82, 83, 103]. En base a los resultados obtenidos, demostramos que la DM2 inducida por HFD sensibiliza al hígado, promoviendo la activación de la vía de señalización de Wnt/-catenina. Teniendo en cuenta que el aumento de TGF-1 se ha asociado con un mayor riesgo a desarrollar DM2 [22] y que la vía TGF-/Smads juega un rol fundamental en la iniciación del desarrollo de HCC [136, 156, 235] en nuestro trabajo, analizamos p- Smad 2/3 y Smad4 en la fracción nuclear obteniendo un aumento de las mismas, esto podría implicar un incremento de genes target implicados en el crecimiento celular, supervivencia y metástasis, poniendo en evidencia que esta vía de señalización estaría implicada en una mayor sensibilización del hígado de los ratones DM2 inducidos por HFD, al desarrollo de HCC frente a un estímulo carcinogénico. Una observación potencialmente relevante de nuestro estudio fue que un estímulo de las células con TGF-1 aumentó los niveles de ambas proteínas nucleares p-Smad 2/3 y -catenina, lo que sugiere un posible sinergismo entre estas dos vías de señalización en nuestro modelo. Estos resultados coinciden con autores que han descripto una interacción de ambas vías de señalización a través probablemente de la interacción con TCF-4 [168, 170–172, 245]. En el presente estudio hemos demostrado la existencia de proteínas nucleares y /o citosólicas en el hígado de ratones diabéticos que estarían caracterizando o poniendo en relieve su predisposición a iniciar el desarrollo de un hepatocarcinoma en la evolución de la enfermedad y/o frente a modificaciones predisponentes del medio ambiente.Fil: Arboatti, Ainelén Soledad. Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas; Argentina

Influencia de la reducción del contenido de NaCl sobre las características fisicoquímicas y reológicas de queso Mozzarella

De acuerdo a estimaciones realizadas por el Ministerio de Salud de nuestro país, una reducción de 3 g de sal en la dieta diaria contribuiría anualmente a evitar unos 60.000 eventos cardiovasculares y cerebrovasculares. Una reducción en el contenido de sal de los alimentos procesados sería muy beneficiosa, ya que se calcula que más del 60% de la sal ingerida proviene de estos. En el caso de los quesos, la reducción de sal representa un desafío particular debido a que la misma posee un rol asociado al sabor y a la preservación del producto. En el presente trabajo, se evaluaron parámetros fisicoquímicos y el comportamiento reológico de quesos Mozzarella elaborados con menor contenido final de NaCl. A partir de 8 barras de queso Mozzarella se obtuvieron muestras de 2 cm de espesor y se llevaron a cabo 3 experiencias de salado variando el tiempo de inmersión de las muestras en una solución de NaCl (23%). Así, se obtuvieron los quesos control (C) y los quesos S1 y S2 (con reducciones de NaCl de aproximadamente el 60% y el 35% respecto de los quesos C, respectivamente). La maduración se llevó a cabo a 4 °C, obteniéndose las muestras a 1, 15, 28 y 43 días. Se determinaron los valores de pH, actividad de agua (aw) y los contenidos de humedad y NaCl. Además, se llevó a cabo una caracterización reológica de las muestras mediante barridos de temperatura en la región viscoelástica lineal. Para ello, se utilizó un reómetro con geometría de platos paralelos, y se trabajó en el rango de 25 a 60 °C, con una amplitud de deformación de 0.01 y a una frecuencia de 1 Hz. En las muestras analizadas se determinó la temperatura de cruce (Tc) de los módulos (G?=G??), la cual permite identificar la transición hacia el estado fundido a medida que el queso se calienta. Los valores promedio de contenido de humedad y de NaCl de los quesos C, S1 y S2 fueron de 46.3% - 1.24%, 47.7% - 0.50% y 47.2% - 0.81%, respectivamente. Se observaron diferencias en los valores de aw obtenidos, siendo significativamente mayores para los quesos con menor contenido de sal. No se observaron diferencias significativas en los valores de pH debido al contenido de sal de las muestras. La Tc disminuyó a medida que el tiempo de maduración aumentó o el contenido de NaCl se redujo, siendo los valores promedio observados para los quesos S1, S2 y C hacia el final de la maduración de 49.9, 50.5 y 52.9 °C, respectivamente. Este fenómeno estaría asociado a cambios en el grado de hidratación y agregación de las caseínas, en la composición de la matriz del queso y al resultado de las reacciones enzimáticas involucradas en el proceso de proteólisis. Los resultados obtenidos resultan alentadores para reducir el contenido de sal en un queso de consumo masivo, pero resulta necesario realizar estudios complementarios para determinar el menor contenido de sal con que se podría elaborar este queso sin que se vea afectada la calidad final del producto.Fil: Arboatti, Ainelén Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Rosario. Instituto de Fisiología Experimental (i); ArgentinaFil: Olivares, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química (i); ArgentinaFil: Zorrilla, Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química (i); ArgentinaFil: Sihufe, Guillermo Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico para la Industria Química (i); Argentin

The influence of sodium chloride reduction on physicochemical, biochemical, 1 rheological and sensory characteristics of Mozzarella cheese

Excessive intake of sodium has been associated with harmful effects on human health. Therefore, salt reduction in manufactured products is been targeted as a way to reduce dietary sodium intake. Sodium chloride (NaCl) plays an important role in cheese, and reducing the NaCl level in cheese may adversely affect its characteristics. Our objective was to evaluate the influence of different levels of salt reduction on the physicochemical, biochemical, rheological, and sensory characteristics of Mozzarella cheese. Samples were brine-salted for different periods to obtain cheeses with different levels of salt reduction (C: control cheese; S1: cheese with 60% salt reduction, S2: cheese with 35% salt reduction). Samples were analysed during 43 days of ripening. As expected, salt flavour intensity decreased with a decrease in NaCl levels. Small differences between control and experimental cheeses due to salting condition were observed in moisture content, water activity, maturation index, αs1-casein, αs1-I-casein, crossover temperature (when the elastic component equals the viscous component) and in some sensory attributes (aroma, colour, global flavour and creaminess). No significant differences due to salting condition were observed in pH, γ-casein, β-casein degradation, activation energy (parameter that quantifies the matrix degradation with heating), residual flavour, acidity and bitter taste. Taking into account the minor differences observed after the significant salt reduction analysed, it is considered that decreasing NaCl may not jeopardise the standard Mozzarella cheese quality.Fil: Arboatti, Ainelén Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico Para la Industria Química (i); ArgentinaFil: Olivares, María Laura. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico Para la Industria Química (i); ArgentinaFil: Sabbag, Nora G.. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Costa, Silvia C.. Universidad Nacional del Litoral; ArgentinaFil: Zorrilla, Susana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico Para la Industria Química (i); ArgentinaFil: Sihufe, Guillermo Adrian. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Santa Fe. Instituto de Desarrollo Tecnológico Para la Industria Química (i); Argentin

Diethylnitrosamine Increases Proliferation in Early Stages of Hepatic Carcinogenesis in Insulin-Treated Type 1 Diabetic Mice

Diethylnitrosamine (DEN) induces hepatocarcinogenesis, increasing mitotic hepatocytes and leading to chronic inflammation. In addition, type 1 diabetes mellitus (T1DM) is also characterized by a proinflammatory state and by requiring insulin exogenous treatment. Given the association of diabetes, insulin treatment, and cell proliferation, our specific goal was to determine whether the liver in the diabetic state presents a greater response to DEN-induced cell cycle alteration, which is essential for the malignant transformation. Male C57BL/6 mice (four-week-old) were divided into 4 groups: C, C + DEN, T1DM, and T1DM + DEN. Mice were euthanized ten weeks after DEN injection. DEN per se produced an increase in liver lipid peroxidation levels. Besides, in T1DM + DEN, we found a greater increase in the proliferation index, in comparison with C + DEN. These results are in agreement with the increased expression observed in cell cycle progression markers: cyclin D1 and E1. In addition, a proapoptotic factor, such as activated caspase-3, evidenced a decrease in T1DM + DEN, while the Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and the protooncogene p53 showed a higher increase with respect to C + DEN. Overall, the results allow us to highlight a major DEN response in T1DM, which may explain in part the greater predisposition to the development of hepatocarcinoma (HCC) during the diabetic state

The effect of reduced sodium chloride content on the microbiological and biochemical properties of a soft surface-ripened cheese

Many health authorities have targeted salt reduction in food products as a means to reduce dietary sodium intake due to the harmful effects associated with its excessive consumption. In the present work, we evaluated the effect of reducing sodium chloride (NaCl) content on the microbiological and biochemical characteristics of an experimental surface-ripened cheese. A control cheese (1.8% NaCl) and a cheese with a reduced NaCl content (1.3% NaCl) were sampled weekly over a period of 27 d. Reducing NaCl content induced microbial perturbations such as the lesser development of the yeast Debaryomyces hansenii and the greater development of the gram-negative bacterium Hafnia alvei. This was accompanied by changes in proteolytic kinetics and in profiles of volatile aroma compounds and biogenic amine production. Finally, the development of the spoilage microorganism Pseudomonas fragi was significantly higher in the cheese with a reduced salt content