Unravelling the role of Ctdnep1-Eps8L2 interaction during nuclear positioning in migrating fibroblasts

Tese de mestrado, Biologia Molecular e Genética, Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2019As células eucarióticas posicionam ativamente e de forma precisa o seu núcleo no citoplasma. Este posicionamento é crucial para processos como a divisão, diferenciação e migração celulares. Durante a migração celular, o núcleo torna-se particularmente importante ao estar envolvido no estabelecimento de polaridade, integração de forças intracelulares e deformação nuclear para permitir o movimento da célula por constrições reduzidas. Estes processos dependem largamente do tipo de célula e do substrato de migração. Diferentes células iniciam a sua motilidade com o posicionamento do núcleo na zona posterior da célula, enquanto o centrossoma (estático) assume uma localização entre a frente migrante e o núcleo (onde o centrossoma se diz reorientado). Logo, surge na célula uma polarização frente migrante-centrossoma-núcleo na direção de migração. Este movimento nuclear é promovido por cabos dorsais de actina em movimento retrógrado que se ligam a proteínas do invólucro nuclear provenientes do complexo de Ligação do Nucleoesqueleto e Citoesqueleto (LINC), formando linhas Nucleares Transmembranares associadas a Actina (TAN). Apesar do complexo LINC ser o protagonista no modelo atual de acoplamento entre o núcleo e o citoesqueleto, outras proteínas têm sido identificadas na regulação do complexo LINC para a formação das linhas TAN. Contudo, o conhecimento sobre como a actina é organizada ou se existe outro mecanismo independente do complexo LINC é escasso. Recentemente no laboratório Gomes, foram identificadas duas novas proteínas envolvidas no movimento nuclear. São elas a Fosfatase 1 do Invólucro Nuclear de Domínio C-terminal (Ctdnep1) e a Proteína 2 de Substrato Tipo 8 de Recetor Cinase do Fator de Crescimento Epidérmico (Eps8L2). A Ctdnep1 (previamente designada por Dullard) é uma fosfatase localizada no invólucro nuclear e no retículo endoplasmático. Esta proteína foi descrita pela primeira vez em Xenopus laevis por participar no desenvolvimento do tubo neuronal. Atualmente, a Ctdnep1 é mais conhecida pelo seu papel na desfosforilação e ativação das Lipinas-1 e -2 em mamíferos e, consequentemente, na regulação do metabolismo global de ácidos gordos. Para esta desfosforilação ocorrer, é requerida a presença da Subunidade Reguladora da Fosfatase 1 do Invólucro Nuclear (Nep1-r1). A Eps8L2 é uma proteína do citoesqueleto pertencente à família de proteínas Eps8. Funcionalmente, a Eps8L2 é mais conhecida pelo seu papel no complexo Sos1-Abi1-PI3K-Eps8L2, necessário para a ativação da GTPase Rac, resultando na remodelação da actina no citoesqueleto. Adicionalmente, para regular a dinâmica da actina, a Eps8L2 é capaz de limitar a polarização dos filamentos de actina através do bloqueio dos terminais de rápido crescimento (atividade conhecida como capping da actina) e promover ligações cruzadas entre filamentos de actina formando estruturas mecanicamente mais resistentes (atividade conhecida como bundling da actina). A atividade de bundling da actina encontra-se amplamente descrita na manutenção dos estereocílios na cóclea. Previamente no laboratório Gomes, demonstrou-se que, em fibroblastos migrantes, o knockdown de Ctdnep1 ou Eps8L2 resulta numa deficiência no movimento retrógrado do núcleo e na reorientação do centrossoma, fenómenos relacionados com uma possível regulação da organização dos cabos dorsais de actina por Ctdnep1 e Eps8L2. Assim, na ausência destas proteínas, o principal mecanismo de posicionamento nuclear e migração celular em fibroblastos encontra-se danificado. Adicionalmente, foi identificada uma interação física e direta entre Ctdnep1 e Eps8L2. Contudo, não tinha sido totalmente explorado o modo como esta interação está relacionada com o posicionamento nuclear. Neste trabalho, caracteriza-se a interação entre Ctdnep1 e Eps8L2 relativamente à sua localização subcelular, mecanismo e papel durante a migração celular. Para estudar a localização subcelular da Ctdnep1 e da Eps8L2 em fibroblastos migrantes, realizou-se o knockin de marcadores (GFP e miRFP670, respetivamente) nas proteínas endógenas em células NIH 3T3, utilizando o sistema de Repetições Palindrómicas Curtas Agrupadas e Regularmente Interespaçadas (CRISPR)/Proteína 9 Associada a CRISPR (Cas9). Para enriquecer a população celular em células positivas para GFP ou miRFP670, realizou-se Separação Celular Ativada por Fluorescência (FACS). Contudo, apesar de serem recolhidas entre 1000 e 2000 células positivas por knockin, não foi possível observar células positivas ao microscópio, sendo frequentemente observada uma morte celular extensa após um curto período em cultura. Adicionalmente, uma segunda seleção por FACS não enriqueceu o número de células positivas. Para testar se a Cas9 não estava a realizar o corte em dupla cadeia na sequência-alvo e, consequentemente, as células não apresentavam a edição desejada, células NIH 3T3 foram transduzidas com as sequências codificantes para a Cas9 e os gRNAs utilizados anteriormente. Por sequenciação do DNA genómico, observou-se que a Cas9 estava efetivamente a cortar as sequências genómicas na região pretendida, validando os gRNAs utilizados. Adicionalmente, para investigar se as localizações subcelulares da Ctdnep1 e da Eps8L2 são influenciadas entre si, estão a ser geradas linhas celulares com knockouts para EPS8L2 ou CTDNEP1 em células transduzidas com gRNAs que têm como alvo a região do codão de iniciação. Numa segunda abordagem ao estudo da localização subcelular, geraram-se linhas celulares NIH 3T3 a expressar estavelmente sequências codificantes para Ctdnep1-GFP, Ctdnep1_D67E-GFP (a variante mutada sem atividade de fosfatase) ou Eps8L2-GFP. Utilizando estas linhas celulares, demonstrou-se que a Ctdnep1 se localiza no invólucro nuclear e no retículo endoplasmático, independentemente da sua atividade de fosfatase. Já a Eps8L2 apresenta uma localização distribuída pelo citoplasma. Assim, tendo em conta a restrição da localização da Ctdnep1 ao invólucro nuclear e ao retículo endoplasmático, especialmente perto do núcleo, sugere-se que esta seja a região de interação entre a Ctdnep1 e a Eps8L2. Contudo, algumas células não apresentavam os mesmos padrões de expressão, sendo esta visivelmente mais baixa, traduzindo a perda da expressão das proteínas marcadas ao longo do tempo. Consequentemente, as linhas celulares não se encontravam totalmente estáveis, sendo necessária uma seleção mais restrita de células positivas para GFP. Adicionalmente, questionou-se sobre a natureza da interação direta entre Ctdnep1 e Eps8L2. Tendo em consideração a atividade de fosfatase da Ctdnep1, colocou-se a hipótese de que a Ctdnep1 desfosforila a Eps8L2, o que resulta na ativação da capacidade da Eps8L2 para promover o bundling da actina. Consequentemente, formam-se cabos de actina espessos o suficiente para uma ligação eficiente ao complexo LINC, promovendo o movimento do núcleo. Para testar esta hipótese, Eps8L2 e Ctdnep1 (wild type ou D67E) exclusivamente ou na presença da subunidade reguladora Nep1-r1 foram co-expressas em células U2OS. Por espetrometria de massa, foi possível identificar os fosforesíduos em Eps8L2 e estudar diferenças no estado de fosforilação entre condições. Mais especificamente, os fosforesíduos S479 e S480 apresentaram um sinal de fosforilação significantemente inferior na presença de Ctdnep1 e Nep1-r1, comparativamente a Ctdnep1_D67E. Assim, estas serinas apresentam-se como possíveis substratos para a desfosforilação da Eps8L2 pela Ctdnep1. Quanto ao seu papel na migração celular, através de ensaios de cicatrização de feridas, demonstrou-se que aquando do knockdown de Ctdnep1 ou Eps8L2, não existe um impacto na migração celular em 2D. Contudo, esta observação não descarta a hipótese de Ctdnep1 e Eps8L2 desempenharem papéis determinantes para a migração celular em 3D. De facto, em substratos 3D as propriedades da matriz extracelular podem impor constrições únicas na migração celular, com a consequente utilização de vias moleculares fundamentalmente diferentes da migração em 2D, para deformar ou posicionar o núcleo. Assim, a possibilidade da interação Ctdnep1-Eps8L2 ser determinante para a migração em matrizes 3D deverá ser explorada. Coletivamente, neste trabalho aprofunda-se o papel da interação entre Ctdnep1 e Eps8L2 na organização da actina, bem como, as suas implicações durante o posicionamento nuclear. Outros pormenores necessitam de ser explorados, tais como, a possível função desta interação na mecano-transdução e expressão génica, a coordenação entre a interação Ctdnep1-Eps8L2 e outras previamente descritas para a regulação da dinâmica do complexo LINC e linhas TAN ou o papel da interação na migração em matrizes 3D. Em última instância, este estudo reforça a necessidade de identificar novos intervenientes na complexa e refinada rede molecular que regula o posicionamento nuclear. A identificação e caracterização destes intervenientes é crucial para uma melhor compreensão de correlações fisiológicas importantes, particularmente entre posicionamento nuclear e doença.Positioning the nucleus within the cell is crucial for cell division, differentiation and proper migration. Different cells initiate their motility by positioning the nucleus to the cell rear, setting up a leading edge-centrosome-nucleus polarization in the direction of migration. This nuclear movement is promoted by retrograde moving dorsal actin cables that bind to the Linker of Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC) complex at the nuclear envelope, forming what is known as Transmembrane Actin-associated Nuclear (TAN) lines. In the last years, several proteins have been identified as regulators of the LINC complex for TAN lines formation. However, little is known about how actin is organized or if there is any other LINC complex-independent mechanism in this process. Recently in Gomes lab, two proteins were identified as novel players in nuclear movement: the C-Terminal Domain Nuclear Envelope Phosphatase 1 (Ctdnep1) and the Epidermal Growth Factor Receptor Kinase Substrate 8-Like Protein 2 (Eps8L2). These proteins were shown to physically and directly interact, being determinant for TAN line-dependent nuclear positioning in migrating fibroblasts by regulating dorsal actin cables organization. However, is not yet well understood how Ctdnep1-Eps8L2 interaction is coupled to nuclear positioning. Here, we further characterize this interaction regarding its subcellular localization, mechanistic basis and role in cell migration. Through the Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR Associated Protein 9 (Cas9) system, it is attempted to tag the endogenous Ctdnep1 and Eps8L2 in NIH 3T3 cells to study its subcellular localization. However, this approach was unsuccessful, since no positively tagged cells were observed after Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) selection. As an alternative, using NIH 3T3 stable cell lines expressing tagged versions of Ctdnep1 or Eps8L2, it is demonstrated that Ctdnep1 localizes to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum (regardless of its phosphatase activity), while Eps8L2 localizes to the cytoplasm. Given that Ctdnep1 localization is restricted to the nuclear envelope and endoplasmic reticulum, especially near the nucleus, it is suggested that this should be the region where Ctdnep1 and Eps8L2 interact. Taking advantage of the CRISPR/Cas9 tools developed, currently, Eps8L2 and Ctdnep1 knockout cell lines are being generated to further inquire if the subcellular localization of the two proteins influences one another. Furthermore, it is hypothesized that Ctdnep1 may control Eps8L2 activity by dephosphorylation, regulating perinuclear actin organization and, thus, affecting nuclear positioning and cell migration. Through mass spectrometry analysis, S479 and S480 are identified as possible phosphorylation sites for Eps8L2 and, thus, potential substrates for Ctdnep1 phosphatase activity. Additionally, wound-healing assays were performed to further enquire about Ctdnep1 and Eps8L2 role in cell migration. In the present experimental conditions, Ctdnep1-Eps8L2 interaction did not present a role in 2D-cell migration. Collectively, this work provides data that further pursues the role of Ctdnep1 and Eps8L2 interaction in actin organization as well as its implications during nuclear positioning. Other details regarding this interaction should also be explored, such as its possible function in mechanotransduction and gene expression, its coordination with other previously reported mechanisms for regulating LINC complex and TAN lines dynamics or its role in 3D cell migration. Ultimately, this work sheds light on the importance of identifying new players in the complex and refined network that regulates nuclear positioning. Deciphering the mechanisms connecting the nucleus to the cytoskeleton is valuable to better understand important physiological correlations between nuclear positioning and disease

A formação qualificada em secretariado – o papel do ensino superior politécnico na transferência de conhecimento

O presente artigo pretende evidenciar a importância da mudança de paradigma que temos assistido em relação ao perfil do secretariado e das funções que lhes são inerentes e exigidas pelo mercado de trabalho, em organizações que se pretendem competitivas e eficientes. Pretende-se ainda demonstrar de que forma a transferência de conhecimento e os critérios de formação de nível 6 (segundo o referencial europeu de qualificação, que corresponde ao grau de licenciatura em Portugal) exigidos no Espaço Europeu de Ensino Superior contribuem para a preparação de profissionais qualificados e diferenciados para o desempenho do apoio de secretariado nas mais diversas áreas de atuação

Sinais ungueais de doenças sistémicas

Trabalho final de mestrado integrado em Medicina área científica de Dermatologia, apresentado à Faculdade de Medicina da Universidade de CoimbraAs unhas são estruturas epiteliais cutâneas especializadas e têm como funções a protecção da extremidade dos dedos e a manipulação fina. São facilmente inspeccionadas num exame objectivo, podendo dar diversas informações ao médico. Alterações na cor, forma ou textura das unhas podem ser sugestivas de uma grande variedade de doenças sistémicas. É, por isso, útil saber identificar essas alterações para que seja possível fazer um diagnóstico célere e acompanhamento adequado do doente. São exemplos os dedos em baqueta de tambor, que muitas vezes sugerem doença pulmonar ou doença intestinal inflamatória crónica, e a coiloníquia classicamente associada a carência marcial. O principal objectivo deste trabalho consiste na elaboração de uma revisão das manifestações ungueais que fornecem pistas para o diagnóstico de doenças sistémicasNails are specialized keratinous appendages, whose functions are the protection of the tip of the digits and the manipulation of smaller objects with great precision. They are easily inspected in a physical examination, providing a great deal of information that can be useful to the physician. Changes in colour, shape or texture of the nails can suggest a wide range of systemic diseases. Therefore, it is useful to identify those changes so that it is possible to make an early diagnosis, as well as an appropriate monitoring of the patient. A good example is clubbing, a sign that, in most of the cases, suggests pulmonary disease or inflammatory bowel disease. Another classic example is koilonychias, commonly associated to iron deficiency. The main goal of this paper is to elaborate a revision of the nail manifestations that supply clues to the diagnosis of systemic disease

Valor nutricional de algumas espécies consumidas em Portugal

Dissertação de mest., Biologia Marinha, Faculdade de Ciências do Mar e do Ambiente, Universidade do Algarve, 2009Neste estudo avaliou-se o valor nutricional de cinco espécies de peixe consumidas em Portugal – a perca do Nilo, uma espécie de água doce importada, e o robalo, pregado, sargo e corvina, quatro espécies produzidas em aquicultura. Os resultados revelaram que o pescado produzido em aquicultura apresenta teores de gordura e em ácidos gordos ω6 mais elevados do que algumas espécies selvagens, que decorrem da composição das rações fornecidas. Pretendeu-se, também, conhecer o efeito de alguns tratamentos culinários na composição química, tendo-se observado a perda de água e a consequente concentração de todos os outros nutrientes ao nível do músculo. Este trabalho permitiu verificar que a grelhagem e cozedura constituem duas alternativas saudáveis de confecção, visto que o consumo de 150 g das espécies consideradas fornece mais de 100 % da dose diária recomendada de ácidos gordos ω3 e teores apreciáveis de EPA+DHA constituindo, simultaneamente, uma refeição hipocalórica e com baixos níveis de colesterol

Podcasts no ensino superior : um estudo em licenciaturas de gestão

O podcast possibilita um acesso fácil e rápido a grandes quantidades de informação em formato de áudio e vídeo. Pelas enormes potencialidades que oferece, este tem vindo a ser utilizado nos mais variados contextos, começando a ter uma importância cada vez maior no domínio educacional. Nesta comunicação descrevemos um estudo realizado no 1.º semestre do ano lectivo 2008/2009, em quatro unidades curriculares de quatro licenciaturas da Escola Superior de Gestão do Instituto Politécnico de Tomar. Neste estudo pretendeu-se criar e disponibilizar podcasts para dar feedback a um trabalho prático dos alunos e simultaneamente auscultar a sua opinião acerca destes. Os resultados indicam que os alunos aceitaram bem esta tecnologia, considerando os podcasts criados de qualidade. A maioria dos alunos ouviu-os mais que uma vez para poder tomar nota de aspectos que escaparam na 1.ª audição, tirar apontamentos e recapitulá-los. O computador foi o meio mais usado pelos alunos para ouvirem os podcasts. A maioria deles tirava notas enquanto ouvia os podcasts.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

Podcasts na promoção e divulgação de políticas sociais

Os podcasts têm-se tornado num dos recursos mais populares da Web 2.0 devido às suas enormes potencialidades. Actualmente é possível encontrar podcasts sobre vastíssimos temas e com imensos fins. Nesta comunicação descrevemos os podcast áudio e os screencasts criados pelos alunos no domínio das políticas sociais no âmbito da unidade curricular de Sociedade de Informação em Políticas Sociais da 1.ª edição da pós-graduação em Gestão Pública em Políticas Sociais leccionada no primeiro semestre do ano lectivo 2010/2011 na Escola Superior de Gestão do Instituto Politécnico de Tomar. Esta comunicação apresenta também a reacção dos alunos à formação recebida, à utilização das ferramentas Audacity e Jing e ao uso dos podcasts na sua actividade profissional. Os resultados indicam que os alunos aceitaram bem esta tecnologia, considerando a formação recebida adequada e as ferramentas relativamente fáceis de utilizar. A maioria perspectiva utilizar podcasts na sua actividade profissional, nomeadamente, podcasts áudio e screencasts.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT

Administração e qualidade ou qualidade na administração

Pretende-se com este trabalho abordar a problemática da administração de empresas e a organizacional em termos de qualidade e produtividade, essencial para a competitividade organizacional e empresarial. Tal abordagem é relevante por ser plenamente reconhecido que as administrações organizacionais e de qualidade buscam excelência e sobrevivência organizacional. Administrar mas administrar bem significa ter qualidade na administração. Abordamos, no ponto 1 os primórdios da administração até aos mais modernos conceitos de administração. O ponto 2 faz uma breve alusão aos conceitos básicos de Administração Privada e Pública para uma melhor compreensão. No ponto 3 abordamos a qualidade nas organizações, funções da administração, liderança, motivação, empreendedorismo e gestão do conhecimento

Climate change and emerging chemical contaminants in marine organisms: Bioaccumulation, ecotoxicology and public health impacts

Chemical contamination and climate change constitute two of the greatest environmental problems related with the increase of anthropogenic activities. Despite both factors acting alone can have negative effects at different levels of biological organization, as well as in seafood safety, the underlying interactions between them are still poorly understood. In this context, this PhD thesis aimed to assess the combined effects of seawater warming and/or acidification on the bioaccumulation of different emerging chemical contaminants (ECCs; MeHg, iAs, DCF, VFX, TCS, Decs, TBBPA, PFOS e PFOA) and ecotoxicological responses of two marine taxonomic groups (fish and bivalves). Overall, warming promoted the bioaccumulation of lipophilic and persistent ECCs (e.g. MeHg, Decs and TBBPA), suggesting increased risks of human exposure to these compounds through the consumption of contaminated seafood in tomorrow’s ocean. Conversely, warming and/or acidification elicited lower bioaccumulation of ionisable and/or less persistent compounds (e.g. iAs, VFX and TCS). Yet, this trend may not necessarily represent lower human risks, as it may be associated with enhanced biotransformation of parental ECCs, potentially representing increased levels of metabolites for which the toxicological attributes (to both biota and humans) are still unknown. Regarding the ecotoxicological effects, overall, the simultaneous exposure to ECCs, warming and acidification promoted more severe responses (at the biochemical, animal condition and behavioural levels) than the ones elicited when each stressor acted in isolation. Such results reveal that the exposure to ECCs in a climate change context will likely defy the resilience of marine organisms, particularly those inhabiting coastal areas. Hence, climate change will greatly challenge the sustainability and management of fisheries and aquaculture resources, thus, calling for urgent regulatory, mitigation and/or adaptive actions at a global scale

Life quality and the wellness in elderly. study case of the Casa do Menino Jesus

This research aims to present an analysis on the absence of innovative social responses to elderly, taking into account the need for stimulation of this population segment. Our main goal is not only a theoretical approach about the issue of elderly, but also present a study on the potentialities of the Casa do Menino Jesus, our case study, can apply for funding of a multisensorial stimulation response for elderly. This paper is divided into three parts: theoretical framework and characterization of our social organization, according to an exploratory research, structuring a strategic plan of the organization, through field research, and as final result, to present a proposal for funding and implementation of an innovative social response, according to the underlying legislation to Portugal 2020. The sample is focused on the population of Mirandela municipality. To conclude, it is important to make this local approach, because of the increasing number elder people with dementia problems and specific needs of treatment and stimulation.CG