Fabrication of Amperometric Electrodes

Carbon fiber electrodes are crucial for the detection of catecholamine release from vesicles in single cells for amperometry measurements. Here, we describe the techniques needed to generate low noise (<0.5 pA) electrodes. The techniques have been modified from published descriptions by previous researchers (1,2). Electrodes are made by preparing carbon fibers and threading them individually into each capillary tube by using a vacuum with a filter to aspirate the fiber. Next, the capillary tube with fiber is pulled by an electrode puller, creating two halves, each with a fine-pointed tip. The electrodes are dipped in hot, liquid epoxy mixed with hardener to create an epoxy-glass seal. Lastly, the electrodes are placed in an oven to cure the epoxy. Careful handling of the electrodes is critical to ensure that they are made consistently and without damage. This protocol shows how to fabricate and cut amperometric electrodes for recording from single cells

BMAJ-II, uma Fosfolipase A2 Homóloga Básica da Peçonha da serpente Bothrops marajoensis com potencial parasiticida

Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação: Mestrado em Biologia Experimental (PGBIOEXP) da Fundação Universidade Federal de Rondônia (UNIR) como requisito final para a obtenção do título de Mestre em Biologia Experimental. Orientador: Prof. Dr. Leonardo de Azevedo Calderon.Peçonhas de serpentes contêm várias proteínas que apresentam potencial para serem aplicadas em diversas áreas da saúde e medicina. Uma classe de toxina que vem sendo objeto de estudo, são as fosfolipases A2 (PLA2s), as quais têm importante participação no envenenamento ofídico, estando associadas a diversas respostas tais como processo inflamatório, miotoxicidade, cardiotoxicidade, hemólise e outros que ocorrem em acidentes ofídicos. Além disso, componentes de peçonhas de serpentes, tais como as L-aminoácido oxidases e PLA2s, demonstram potencial antiparasitário, podendo ser úteis para o desenvolvimento de alternativas terapêuticas nessa área. O presente trabalho teve como objetivo a purificação, caracterização bioquímica e biológica de uma nova PLA2 básica de Bothrops marajoensis com potencial atividade parasiticida. A peçonha foi fracionada aplicando duas etapas cromatográficas iniciando por troca iônica utilizando uma resina CM Sepharose em pH 8,0. A fração de interesse foi selecionada para as etapas seguintes baseada em sua massa molecular e tempo de retenção, e submetida a cromatografia de fase reversa em coluna C18. Realizou-se análise por SDS-PAGE da toxina isolada nomeada Bmaj-II, uma análise eletroforética bidimensional, o sequenciamento parcial de seus aminoácidos, um ensaio de atividade enzimática, uma investigação das estruturas secundárias por dicroísmo circular e ensaios de espalhamento de luz dinâmico. Em seguida, o potencial anti-parasitário da peçonha de B. marajoensis e de Bmaj-II foi avaliado contra promastigotas de Leishmania infantum e epimastigotas de Trypanosoma cruzi in vitro em concentrações de 6,25 a 100 μg/mL, e contra formas intraeritrocíticas de Plasmodium falciparum em concentrações entre 0,09 e 12,5 μg/mL. Posteriormente, a atividade citotóxica sobre células hospedeiras HepG2 foi avaliada. A Bmaj-II mostrou-se homogênea com uma massa molecular confirmada por espectrometria de massa MALDI-TOF2 de 13.956 Da. Apresentou-se um pI de 9,68 indicando compatibilidade de massa e pI de PLA2s de peçonhas de serpentes (svPLA2) básicas. Os resultados dos demais ensaios de caracterização estrutural sugerem a Bmaj-II como PLA2 homóloga Lys49 com uma alta tendência de formar agregações. A toxina isolada demonstrou significativa atividade antiparasitária contra todos os protozoários, contra L. infantum e T. cruzi aproximadamente 30% em concentração de 100 μg/mL, sendo observado também, uma atividade substancialmente maior da peçonha, entre 60-80% em concentração de 100 μg/mL. A atividade da peçonha e da Bmaj-II contra P. falciparum apresentou IC50 de 0,14 ± 0,08 e 6,41 ± 0,64 μg/mL, respectivamente, com valores de CC50 de citotoxicidade contra células HepG2 de 43,64 ± 7,94 e 53,07 μg/mL, respectivamente. Os resultados obtidos mostram o isolamento da Bmaj-II, uma PLA2 Lys49 inédita da peçonha de Bothrops marajoensis além de evidenciar sua atividade microbicida sobre L. infantum, T. cruzi, e P. falciparum. O estudo do seu potencial biotecnológico em relação à leishmaniose, a doença de Chagas e a malária deve ser aprofundado

Snake venom L-Amino acid oxidases: trends in pharmacology and biochemistry

Submitted by Claudete Queiroz ([email protected]) on 2016-05-03T18:02:40Z No. of bitstreams: 1 Snake Venom L-Amino Acid Oxidases Trends in - Pharmacology and Biochemistry.pdf: 3419937 bytes, checksum: 77270860cee91bddcc146303c805335c (MD5)Approved for entry into archive by EMERSON LEAL ([email protected]) on 2016-05-17T14:23:25Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Snake Venom L-Amino Acid Oxidases Trends in - Pharmacology and Biochemistry.pdf: 3419937 bytes, checksum: 77270860cee91bddcc146303c805335c (MD5)Made available in DSpace on 2016-05-17T14:23:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Snake Venom L-Amino Acid Oxidases Trends in - Pharmacology and Biochemistry.pdf: 3419937 bytes, checksum: 77270860cee91bddcc146303c805335c (MD5) Previous issue date: 2014Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Ciências Integradas do Pontal. Departamento de Genética e Bioquímica. Uberlândia, MG, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Ciências Integradas do Pontal. Departamento de Genética e Bioquímica. Uberlândia, MG, Brazil.Universidade de São Paulo. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto. Departamento de Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas. Ribeirão Preto, SP, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Universidade Federal de Uberlândia. Faculdade de Ciências Integradas do Pontal. Departamento de Genética e Bioquímica. Uberlândia, MG, Brazil.Universidade Federal de São João del Rei. Departamento de Química, Biotecnologia e Engenharia de Bioprocessos. Ouro Branco, MG, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Estudos de Biomoléculas Aplicadas à Saúde. Departamento de Medicina. Universidade Federal de Rondônia. Porto Velho, RO, Brazil.L-amino acid oxidases are enzymes found in several organisms, including venoms of snakes, where they contribute to the toxicity of ophidian envenomation. Their toxicity is primarily due to enzymatic activity, but other mechanisms have been proposed recently which require further investigation. L-amino acid oxidases exert biological and pharmacological effects, including actions on platelet aggregation and the induction of apoptosis, hemorrhage, and cytotoxicity. These proteins present a high biotechnological potential for the development of antimicrobial, antitumor, and antiprotozoan agents. This review provides an overview of the biochemical properties and pharmacological effects of snake venom L-amino acid oxidases, their structure/activity relationship, and supposed mechanisms of action described so far

Antitumoral Activity of Snake Venom Proteins: New Trends in Cancer Therapy

For more than half a century, cytotoxic agents have been investigated as a possible treatment for cancer. Research on animal venoms has revealed their high toxicity on tissues and cell cultures, both normal and tumoral. Snake venoms show the highest cytotoxic potential, since ophidian accidents cause a large amount of tissue damage, suggesting a promising utilization of these venoms or their components as antitumoral agents. Over the last few years, we have studied the effects of snake venoms and their isolated enzymes on tumor cell cultures. Some in vivo assays showed antineoplastic activity against induced tumors in mice. In human beings, both the crude venom and isolated enzymes revealed antitumor activities in preliminary assays, with measurable clinical responses in the advanced treatment phase. These enzymes include metalloproteases (MP), disintegrins, L-amino acid oxidases (LAAOs), C-type lectins, and phospholipases A2 (PLA2s). Their mechanisms of action include direct toxic action (PLA2s), free radical generation (LAAOs), apoptosis induction (PLA2s, MP, and LAAOs), and antiangiogenesis (disintegrins and lectins). Higher cytotoxic and cytostatic activities upon tumor cells than normal cells suggest the possibility for clinical applications. Further studies should be conducted to ensure the efficacy and safety of different snake venom compounds for cancer drug development

Influence of Quantal Size and cAMP on the Kinetics of Quantal Catecholamine Release from Rat Chromaffin Cells

Using carbon fiber amperometry, we exploited the natural variation in quantal size (Q) among individual granules in rat chromaffin cells to examine the influence of Q on quantal release kinetics. Although it is generally accepted that granules with larger Q have slower kinetics of release, we found that this trend was applicable only to granules with Q(1/3) < 0.6 pC(1/3). Granules with larger Q adapted specific mechanisms to maintain a rapid kinetic of release. The semistable fusion pores in the large-Q granules persisted for a longer duration and could reach a bigger size before the onset of very rapid dilation to allow a longer and larger foot signal. Most importantly, a large proportion of large-Q granules maintained a relatively short half-width in the main spike. This suggests that the most rapid phase of fusion pore dilation in many large-Q granules may be faster than that in small-Q granules. Moreover, cAMP selectively advanced the onset of the rapid dilation of the fusion pore in the large- but not the small-Q granules. Thus, our finding raises the possibility that fusion pore and/or granule matrix in small- and large-Q granules may have different molecular structures