Chronic obstructive pulmonary disease : a proteomics approach

Tese de doutoramento, Biologia (Biologia Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by chronic airflow limitation that is not fully reversible even under bronchodilators effect, caused by a mixture of small airway disease – obstructive bronchiolitis – and parenchymal destruction – emphysema. At the present time, COPD is the fourth leading cause of death and its prevalence and mortality are expected to continue increasing in next decade. Spirometry is the most reproducible way to measure lung function and is nowadays the best tool to diagnose airflow limitation and, consequently, diagnose COPD itself. Biomarkers for diagnosis and/or prognosis as well as novel targets for the development of more effective therapies for COPD are still needed. Proteomics has the capacity to provide large-scale information and consequently it has the potential to expand previous knowledge on COPD. Surprisingly, given the need for new biomarkers in COPD and the power of proteomics, proteomics have been quite neglected so far. Up to date only 50 reports (14 are reviews) match the search at Pubmed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed, accessed June 23, 2011) for COPD proteomics. Hence, there is a clear need to engage clinically valuable proteomics studies in order to match the need for new biomarkers in COPD. In last decade, the shotgun proteomics approach has become the method of choice for identifying and quantifying proteins in most large-scale studies. Compared with 2DE, shotgun proteomics allows higher data throughput and better protein detection sensitivity. This strategy is based on trypsin digestion of proteins into peptides. This produces a complex peptide mixture that is then separated by one- or multiple dimensional liquid chromatography (LC) and subjected to peptide sequencing using tandem mass spectrometry (MS/MS) before automated database searching. In the present work we have employed different methodologies within shotgun proteomics to generate solid and comprehensive data in COPD. There are quite a lot biological materials that can be used to investigate biomarkers for this disease. Although COPD is now known to possess a systemic inflammation xii component which is responsible for affecting other organs, it is in the lung that the events that lead to breathless take place. Investigating to the lung directly is therefore an optimal strategy to be able to identify proteins that may not be detectable elsewhere either because they are not present or diluted into undetectable concentrations. But this means that lung tissue has to be collected by biopsy which is an extremely invasive technique. But besides tissue biospecimens, other sources of biological materials used to study COPD is biofluids which includes sputum, bronchoalveolar and nasal lavage fluid, exhaled breath condensate, and blood. It had been observed before by means of microscopy that red blood cells (RBCs) from COPD patients showed deformations in their shape. RBCs are crucial to the uptake of oxygen from the lungs to the cells and this transport is dependent on their ability to change shapes rapidly while navigating through blood vessels. In addition, RBCs play a crucial role in antioxidant defense when fighting against oxidative stress, which has long been recognized as feature of COPD. In this work we made use of a RBC membrane fractionation procedure, stable isotope labeling and bidimensional liquid chromatography (strong cation exchange / reverse phase) before sample acquisition using a high-resolution fourier transform - ion cyclotron resonance (FT-ICR) mass spectrometer (Chapter III). A total of 4697 peptides were quantified as present in both COPD and control spectra corresponding to 1083 proteins. Three-hundred and fourteen proteins possessing at least two peptides were identified, 46% of which were annotated as membrane proteins. Golgin-245/p230 (GOLGA4), was identified as overexpressed in COPD, a protein which is reported to be essential for intracellular trafficking and cell surface delivery of tumor necrosis factor-α (TNF), the main proinflammatory cytokine made and secreted by inflammatory macrophages enhancing activation and recruitment of T-cells and ensuring robust innate and acquired immune responses. Chorein or Vacuolar protein sorting-associated protein 13A (VPS13A) is reported to play a role in the cytoskeleton organization has been associated with thorny deformations of circulating erythrocytes, possibly due to red cell membranes deformation. This protein was found to be underexpressed in COPD patients when compared to controls by MS and this underexpression was confirmed by WB. Consequently, underexpression of chorein may play an important role in the deformation of COPD RBCs. Many other interesting proteins were identified in the xiii context of COPD and, additionally, there were a considerable number of proteins described in RBC for the first time (Chapter III). To overcome the difficulty of acquiring fresh biopsies of well characterized patients, we have established in our laboratory a procedure to collect human fresh nasal epithelial cells. We have shown previously that these cells presented similar proteome of epithelial cells presented in the lower airway. Here, two different types of studies were presented using these cells: a study performed on the effects of cigarette smoke, which is the main risk factor for developing COPD (Chapter IV) and a comparative proteomic study between COPD patients and healthy individuals (Chapter V). Both were pioneer studies by investigating the proteome of fresh nasal epithelial cells from cigarette smoker subjects (Chapter IV) or COPD patients (Chapter V). In both studies a high-resolution mass analyzer, the orbitrap, was employed increasing the number of confident peptide/protein identifications. In Chapter IV, ninety-six proteins were found to be differentially expressed between the proteomes of healthy smokers and nonsmokers. These proteins were related to processes of antigen presentation, cell-to-cell signaling and interaction, cell morphology, drug metabolism, DNA repair, energy production or mitochondrial dysfunction. Although requiring further orthogonal validation, our data was consistent with previous evidences showing CD44, MUC5AC or SOD2 differential modulation in smokers due to inflammatory response pathways. In Chapter V, 89968 peptides and 1475 proteins were identified in total, of which 1173 proteins were identified by at least two peptides. We were able to confirm previous evidences that UPR is activated in COPD patients since we were able to observe overexpression in a considerable number of proteins involved in different protein complexes involved in UPR. This includes overexpression of VCP, both components of the Hsp10/Hsp60 chaperone complex (HSPD1 and HSPE1), CALR and two members of a large ER-localized multiprotein complex of at least 11 proteins, PPIB and ERP29. We also observed an increase in expression of proteins related to Nrf2-mediated oxidative stress response such as GSTP1, TXNRD1 and GSR. Additionally, we also report an increase in drug metabolism, as all significantly differentially expressed proteins related to this biofunction were overexpressed in COPD: GSTP1, GSR, AKR1C3 and ANXA2. Further validation by orthogonal methods is needed so that the activation of xiv UPR and Nrf2-mediated oxidative stress response and the increase in drug metabolism on the nasal epithelial cells of COPD patients is fully confirmed. In Chapter VI, serum collected from COPD patients was divided into 4 different groups in all different combinations of presence/absence of the two main features of COPD, chronic bronchitis and emphysema, to study their impact in the serum proteome. Due to its complex protein mixture, serum was first immunodepleted from its most abundant proteins, comprising about 94% of total protein content, before being analyzed by 1D-PAGE – LC-MS/MS (GeLC-MS/MS) in a linear ion trap mass spectrometer. This powerful strategy was able to identify as many as 2856 proteins, of which 929 were identified by two or more peptides. Plasminogen was found to be underexpressed in COPD patients that suffer simultaneously from emphysema and chronic bronchitis, while it maintained about the same expression level over the three other groups of COPD patients and this differential expression was successfully validated by ELISA. It was possible to identify other interesting proteins as TRAF3IP2, which is associated with innate immunity in response to pathogens, inflammatory signals and stress and has also been implicated in airway hyperresponsiveness or Isoform 1 of phosphatidylinositol-glycan-specific phospholipase D (GPLD1), which is GPI degrading enzyme that was described to be responsible for secretion of prostasin, which was the first of several membrane serine peptidases found to activate the epithelium-sodium channel (ENaC). Prostasin was also reported to have a critical role in regulating epithelial sodium transport in normal and pathological conditions in the lung. The work herein presented confirmed a few findings that had already been reported and more important revealed new insights into COPD disease mechanisms as well as provided new candidate biomarkers for these diseases. Further validation and integration of all data obtained into a systems biology approach will certainly contribute to increase knowledge of COPD and ultimately bringing the well being of patients.A Doença Pulmonar Obstrutiva Crónica (DPOC) é caracterizada por uma limitação obstrutiva do fluxo aéreo do exterior para os alvéolos e destes para o exterior. Esta limitação ventilatória não é completamente reversível mesmo após a administração de um broncodilatador e tende a ser progressiva. As causas que conduzem a esta limitação são um conjunto de patologias respiratórias do qual fazem parte a bronquite crónica e o enfisema. Para a obstrução do débito de ar na bronquite crónica, contribuem a inflamação das vias aéreas inferiores, a cicatrização das suas paredes, o edema do seu revestimento, o muco e o espasmo do músculo liso. A bronquite crónica manifesta-se por tosse frequente e produção aumentada de expectoração. No entanto nem todos os doentes portadores de bronquite crónica têm ou irão desenvolver uma limitação crónica do fluxo aéreo. No caso do enfisema, as paredes alveolares estão destruidas, pelo que os bronquíolos perdem o seu apoio estrutural e, por isso, entram em colapso quando expiram o ar. Por conseguinte, no enfisema a redução do fluxo de ar é permanente e de origem estrutural. Actualmente, nenhum tratamento tem a capacidade de reduzir a progressão da DPOC ou suprimir a inflamação das vias aéreas de pequeno calibre e do parênquima pulmonar. Nos dias de hoje, a DPOC é a quarta causa de morte no mundo e prevê-se que a sua prevalência e mortalidade continuem a aumentar ao longo da próxima década. Em Portugal e de acordo com um relatório divulgado pelo Observatório Nacional das Doenças Respiratórias (ONDR), cerca de 540 000 pessoas sofriam de DPOC em 2007, o que significa que 5,2% da população padece desta condição. Recentemente, um relatório divulgado pela iniciativa Burden of Obstructive Lung Disease (BOLD), revelou que a taxa de prevalência de DPOC em Portugal é de 14,2%. A espirometria é fundamental no diagnóstico e na avaliação da DPOC por ser o meio mais objectivo, padronizado e facilmente reprodutivel de medir o grau de obstrução das vias aéreas. Considera-se que existe obstrução brônquica e, portanto, DPOC, quando após a administração de um broncodilatador a relação FEV1/FVC é menor do xvi que 70% (FEV1 – Volume Expiratório Máximo no 1.º segundo; FVC – Capacidade Vital Forçada) A Proteómica tem a capacidade de provedenciar informação em larga escala e, consequentemente, de alargar o actual conhecimento da DPOC. Surpreendentemente dada a necessidade de encontrar novos biomarcadores em DPOC e do potencial da proteómica, esta tem sido negligenciada na investigação da doença até aos dias de hoje. Actualmente, existem apenas 50 publicações científicas, dos quais 14 são artigos de revisão, correspondentes a uma pesquisa no site da PubMed (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed, acedido em 23 de Junho de 2011) com o termo “COPD Proteomics”. No entanto, quando pesquisados em separado o número total de artigos com os termos “COPD” e “Proteomics” é de, aproximadamente, 30 000. Portanto, existe uma clara necessidade de produzir novos estudos de proteómica para colmatar esta lacuna e encontrar novos biomarcadores para a DPOC. Na última década, a abordagem designada por shotgun proteomics tornou-se a abordagem de eleição para a identificação e a quantificação de proteínas em estudos de larga escala. Comparando com a electroforese bidimensional (2DE), esta abordagem permite obter um maior número de identificações de péptidos e proteínas por ter uma maior sensibilidade. A estratégia de shotgun proteomics tem como base a digestão tríptica de proteínas para péptidos que vai conduzir a uma mistura complexa de péptidos que são separados através de uma ou múltiplas dimensões cromatográficas. Posteriormente sofrem uma sequenciação peptídica através de um espectómetro de massa e pesquisa automática contra uma base de dados. No presente trabalho utilizaram-se diferentes metodologias dentro da abordagem shotgun proteomics com o objectivo de gerar resultados contundentes em DPOC. Existe uma vasta gama de materiais biológicos que podem ser usados para procurar biomarcadores para esta doença. Embora a DPOC possua um componente de inflamação sistémica que é responsável por afectar outros orgãos, é no pulmão que os mecanismos que originam a falta de ar estão presentes. Assim sendo, investigar directamente o pulmão é a estratégia ideal para poder encontrar as proteínas responsáveis por esses mecanismos que noutros materiais biológicos podem não estar presentes ou, quando presentes, se encontram em concentrações diminutas conduzindo à sua não detecção. Isto significa ter acesso a tecido pulmonar que é xvii obtido através de biopsia, uma técnica extremamente invasiva. Para além de tecido pulmonar, existem outras fontes de material biológico têm sido utilizadas para o estudo da DPOC como são os casos de expectoração, lavado nasal e lavado broncoalveolar, condensado do ar expirado e sangue e seus componentes. No presente trabalho foram utilizados eritrócitos, células do epitélio nasal e soro para o estudo da doença. Foi reportado por meios de microscopia que os eritrócitos de doentes com DPOC exibiam alterações na sua morfologia. Os eritrócitos são fundamentais no transporte de oxigénio dos pulmões para as células e este transporte depende da sua capacidade para mudar rapidamente a sua forma ao navegar pelos capilares sanguíneos. Os eritrócitos desempenham um papel fundamental no combate ao stress oxidativo, que é uma característica da DPOC. Devido à sua hipotética importância para a doença, eritrócitos foram isolados a partir de sangue total de doentes com DPOC e indivíduos saudáveis. Neste trabalho (Chapter III), foi utilizada uma técnica de fraccionamento membranar em conjunto com uma marcação isotópica com 18O/16O e posterior separação através de cromatografia bidimensional (cromatografia de troca catiónica e de fase inversa). A cromatografia de fase inversa estava directamente acoplada a um espectómetro de massa de alta resolução (espectómetro de massa de ressonância de ião-ciclotrão com transformada de Fourier – FT-ICR). Foi possível quantificar um total de 4697 péptidos presentes em ambos os grupos estudados, que corresponderam a 1083 proteínas. 314 proteínas foram identificadas por dois ou mais péptidos, 46% das quais se encontram anotadas como proteínas de membrana. A proteína GOLGA4 foi identificada como estando sobreexpressa em DPOC. Esta proteína está descrita como sendo essencial para o tráfego intracelular e pela colocação à superfície da célula da proteína tumor necrosis factor-α (TNF), a principal citocina pró-inflamatória produzida e secretada por macrófagos para activação e recrutamento de células T. Foi possível também identificar a proteína VPS13A que está associada a deformações em eritrócitos circulantes, possivelmente devido a deformações na membrana. Como resultado do estudo concluiu-se que em doentes com DPOC esta proteína se encontra subexpressa, resultado que foi confirmado por Western Blot. Devido à dificuldade em adquirir amostras de biópsias pulmonares em doentes com DPOC, foi desenvolvido no nosso laboratório um procedimento para obter células do xviii epitélio nasal. Em trabalhos anteriores foi demonstrado que estas células apresentam um comportamento semelhante às células epiteliais das vias respiratórias inferiores. Dois diferentes tipos de estudo foram realizados com estas células: um estudo sobre os efeitos do fumo do tabaco, que é o principal factor de risco para o desenvolvimento de DPOC (Chapter IV) e um estudo comparativo entre doentes com DPOC e indivíduos saudáveis (Chapter V). Ambos os estudos são estudos pioneiros uma vez que o proteoma de células do epitélio nasal nunca tinha sido descrito quer em indivíduos saudáveis fumadores, quer em doentes com DPOC. No primeiro estudo, 96 proteínas foram identificadas como diferencialmente expressas entre fumadores e não fumadores saudáveis. Estas proteínas estão relacionadas com processos de apresentação de antigénios, sinalização e interacção celular, morfologia celular, metabolismo de xenobióticos, reparação de DNA, produção de energia e disfunção mitocondrial. Os resultados obtidos foram consistentes com anteriores evidências que mostram uma diferente modulação de CD44, MUC5AC ou SOD2 em fumadores devido a processos de resposta inflamatória. No segundo estudo, foram identificados um total de 89968 péptidos correspondentes a 1475 proteínas das quais 1173 foram identificadas por dois ou mais péptidos. Foi possível confirmar resultados obtidos em estudos anteriores que referiam que mecanismos de Unfolded Protein Response (UPR) se encontravam activados em doentes com DPOC, uma vez que foi observada a sobreexpressão de um númeo considerável de proteínas envolvidas em diferentes complexos de proteínas relacionados com UPR. Exemplos dessas proteínas incluem a VCP, os dois componentes do complexo Hsp10/Hsp60, a CALR e dois membros de um grande complexo composto por, pelo menos, 11 proteínas, localizado no retículo endoplasmático: PPIB e ERP29. Foi também possível observar um aumento na expressão de proteínas relacionadas com os mecanismos de resposta ao stress oxidativo mediados por Nrf2, como GSTP1, TXNRD1 e GSR. Relativamente ao estudo efectuado com o soro (Chapter VI), quatro grupos foram constituídos para estudar as diferentes combinações de presença/ausência dos dois principais componentes da doença: a bronquite crónica e o enfisema. Uma vez que o soro é uma mistura complexa de proteínas, o soro de doentes de DPOC foi primeiramente imunodepletado das suas proteínas mais abundantes, que xix representam cerca de 94% do seu conteúdo total de proteína. As amostras de soro imunodepletado foram analisadas através de 1D-PAGE – LC-MS/MS (GeLC-MS/MS). Esta poderosa estratégia permitiu a identificação de 33049 péptidos correspondentes a 2856 proteínas, das quais 929 foram identificadas por dois ou mais péptidos. Foi possível observar uma subexpressão de PLG em doentes com DPOC que sofrem simultaneamente de enfisema e bronquite crónica. Esta subexpressão foi validada através de ELISA. Outras proteínas de interesse foram encontradas diferencialmente expressas em cada um dos grupos de doentes com DPOC, entre as quais TRAF3IP2, que está associada à resposta imunitária inata a patogéneos e à resposta exacerbada das vias respiratórias. O trabalho aqui descrito confirmou evidências anteriormente reportadas e ao mesmo tempo formulou novas hipóteses para os mecanismos da doença e revelou potenciais novos biomarcadores. Embora alguns resultados necessitem de posterior validação através de técnicas ortogonais, o presente trabalho tornou possível a descoberta de proteínas e, inclusivamente, vias metabólicas que não tinham sido anteriormente associadas à DPOC. Este trabalho enfatiza também o uso de células epiteliais nasais na investigação da patogénese da doença, uma vez que pode conduzir/conduz à identificação de novos biomarcadores específicos desta doença.Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/2006/31415); POCI/SAU-MMO/56163/2004; FCT/Poly-Annual Funding Program e FEDER/Saúde XXI Program (Portugal

Study of RNA-binding protein networks in colorectal cancer cells

Colorectal cancer (CRC) is one of the leading cancer-related deaths in the world, causing the death of almost 1 million people every year, thus highlighting the need for better prognostic biomarkers and reliable therapeutic targets. It is increasingly evident that RBPs are major players in stem cell biology and carcinogenesis, namely in CRC, and have the potential to regulate several cancer-related phenotypes when dysregulates. Therefore, we aimed at identifying new RBPs with a functional impact in the context of CRC. An in silico approach led us to three potential stemness-related RBPs: ASPM, TIMELESS and ZBTB16. The characterization of a cohort of human CRC cases showed that ASPM and ZBTB16 were preferentially overexpressed in tumoral tissue, whereas TIMELESS was expressed at low and high levels in the same proportion of cases. However, an association with a MSS status was found, indicating that TIMELESS might have a predictive prognostic value. TIMELESS knockdown induced several functional changes in CRC cell lines, some in a cell line-specific manner. TIMELESS depletion led to a prominent reduction of cells in S phase and sensitized them for apoptosis or necrosis which was further amplified by the exposure to the chemotherapeutic agent 5-FU. Furthermore, we observed that TIMELESS expression was restricted to the crypt base in normal tissue and the expression of several known ISC markers was altered upon TIMELESS removal. The phenotypic alterations also occurred at the level of mRNA metabolism in SW480 cells through a reduction of P-body aggregates. Our results show that TIMELESS might be implicated in key tumorigenic processes, such as promotion of cell proliferation and cell death avoidance. This work highlights the relevance of putative RBPs in CRC and the understanding of their functional impact opens an avenue for novel cancer therapies.O epitélio intestinal é o tecido que mais rapidamente se regenera em mamíferos, sendo renovado a cada 3-5 dias. Esta incrível capacidade é assegura por células estaminais localizadas no fundo das criptas intestinais identificadas pela expressão de Lgr5, um gene alvo da via de sinalização Wnt. Porém, as células Lgr5+ já foram identificadas como as células de origem do cancro colorectal (CCR), sendo fundamentais não só para o seu crescimento como também para a sua disseminação e resistência a quimioterapia. O CCR é atualmente a segunda causa de morte por cancro em Portugal e no mundo, tendo causado cerca de 940.000 mortes em 2020. A sua incidência está principalmente associada a estilos de vida típicos de países desenvolvidos que compreendem 60% das mortes. A etiologia e os mecanismos moleculares responsáveis tanto pelo aparecimento como pela progressão da doença já foram extensamente estudados ao longo das últimas décadas. Contudo, maioria dos pacientes apresenta doença metastática, sobretudo no fígado, na altura do diagnóstico e a remoção cirúrgica do tumor continua a ser a melhor opção de tratamento, o que a que a sobrevida a 5 anos em pacientes em estadio avançado ronde os 10%. Isto demonstra a falta de melhores biomarcadores com valor prognóstico e do desenvolvimento de terapias mais eficazes. Os mecanismos de regulação pós-transcricionais têm um papel fundamental na expressão génica, os quais são sobretudos mediados por proteínas de ligação ao ARN. Estas representam alvos terapeuticamente interessantes tendo em conta que são capazes de regular a expressão de múltiplas proteínas relevantes para o processo cancerígeno. A desregulação das proteínas de ligação ao ARN tem sido associados à biologia das células estaminais e à carcinogénese, nomeadamente no CCR. Desta forma, o nosso trabalho tem como objetivo a identificação de novas proteínas de ligação ao ARN relacionadas com o potencial estaminal e que desempenhem funções relevantes em células de CCR. Partindo de uma abordagem bioinformática selecionámos três candidatos associados a estaminalidade e diferencialmente expressos em casos de CCR: ASPM, TIMELESS e ZBTB16. A caraterização de uma série de 192 casos de CCR revelou que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores, enquanto que TIMELESS estava expresso em baixos e altos níveis na mesma proporção de casos. Além disso, procurámos ainda associar os dados de expressão com as características clinino patológicas dos pacientes que revelaram uma correlação estatisticamente significativa da elevada expressão de ASPM e TIMELESS com estabilidade de microssatélites tipicamente associada a um pior prognóstico. De seguida, e tendo em conta as observações anteriores e a disponibilidade de ferramentas molecular, prosseguimos o estudo do papel de TIMELESS na biologia do CCR. Considerando o papel central da via de sinalização Wnt nas células estaminais e no desenvolvimento de CCR, começámos por tentar esclarecer se TIMELESS é regulado pela via Wnt em cultura de organóides intestinais de ratinho. De facto, a estimulação da via Wnt levou a um aumento na expressão de TIMELESS, embora não expressiva a nível de ARNm, sugerindo que TIMELESS poderá não ser um alvo da via Wnt mas sim estar associado à expansão da população de células Lgr5+ induzida pela ativação da via. A inibição de TIMELESS por siARN produziu várias alterações a nível funcional nas linhas celulares de CCR HCT116 e SW480. A depleção de TIMELESS afetou a progressão das células no ciclo celular, aumentando as células nas fases G1 e G2/M, e diminuindo a fase S. Além disso, a remoção de TIMELESS também afetou a morte celular embora de forma distinta nas duas linhas celular. Nas células HCT116, a inibição de TIMELESS induziu a morte por apoptose, mas a combinação com o agente quimioterapêutico 5-FU potenciou a necrose. Por outro lado, a ausência de TIMELESS nas células SW480 causou principalmente morte por necrose, enquanto a adição de 5-FU teve um efeito considerável no aumento de células em apoptose. Este efeito específico das linhas celulares dever-se-á provavelmente ao seu perfil mutacional, pois as células HCT116 não apresentam p53 defeituoso, sendo, por isso, mais capazes de desencadear a morte celular programada, ao contrário das células SW480 que são mutantes em p53. Coletivamente, estas observações sugerem que a expressão de TIMELESS promove a proliferação celular ao prevenir a paragem do ciclo celular e está envolvida na manutenção da viabilidade celular ao evitar mecanismos de morte celular incluindo na presença de stress genotóxico. No entanto, e contrariamente ao que já havia sido publicado, não conseguimos associar TIMELESS à capacidade migratória de células de CCR, possivelmente devido ao facto da transfeção transiente não produzir alterações significativas no fenótipo celular visíveis por 24h. Além disso, a depleção de TIMELESS resultou ainda num aumento a expressão de alguns marcadores de células estaminais intestinais, contradizendo os resultados anteriores. Isto poderá indicar um possível mecanismo compensatório para as alterações causadas pela depleção de TIMELESS. Alterações essas que se estendem ao metabolismo de ARNm, pelo menos nas células SW480, visto que a ausência de TIMELESS afetou a dinâmicas dos corpos P, isto é, agregados citoplasmáticos de ARNm cuja tradução foi reprimida. Apesar do número de agregados se manter constante na inibição de TIMELESS, verificámos uma diminuição na área destes agregados que se refletiu também numa menor intensidade de fluorescência. Considerando os resultados obtidos, concluímos que TIMELESS está efetivamente implicado na biologia do CCR, estando envolvido tanto na proliferação como nos mecanismos de morte celular e estaminalidade. Trabalhos futuros serão necessários para determinar os mecanismos moleculares por detrás destes processos em CCR bem como esclarecer o seu papel na homeostasia do epitélio intestinal e mais concretamente nas células Lgr5+. Além disso, também demonstrámos que ASPM e ZBTB16 estão preferencialmente sobreexpressos em tumores humanos. Desta forma, ao determinar o envolvimento destas três proteínas em mecanismos de regulação póstranscricional, permitirá uma melhor compreensão e enquadramento dos mecanismos subjacentes ao desenvolvimento e progressão do CCR, que permanece uma das principais causas de mortes mundialmente. Assim, o presente trabalho permitiu identificar três novas potenciais proteínas de ligação ao ARNm, tendo uma delas, TIMELESS, sido demonstrada a sua relevância a nível funcional, o que abre novas perspetivas para novos biomarcadores e potenciais terapias para o CCR

Behavioral modulation of the coexistence between Apis melifera and Varroa destructor: A defense against colony colapse disorder?

Colony Collapse Disorder has become a global problem for beekeepers and for the crops which depend on bee polination. Multiple factors are known to increase the risk of colony colapse, and the ectoparasitic mite Varroa destructor that parasitizes honey bees is among the main threats to colony health. Although this mite is unlikely to, by itself, cause the collapse of hives, it plays an important role as it is a vector for many viral diseases. Such diseases are among the likely causes for Colony Collapse Disorder. The effects of V. destructor infestation are disparate in different parts of the world. Greater morbidity - in the form of colony losses - has been reported in colonies of European honey bees (EHB) in Europe, Asia and North America. However, this mite has been present in Brasil for many years and yet there are no reports of Africanized honey bee (AHB) colonies losses. Studies carried out in Mexico showed that some resistance behaviors to the mite - especially grooming and hygienic behavior - appear to be different in each subspecies. Could those difference in behaviors explain why the AHB are less susceptible to Colony Collapse Disorder? In order to answer this question, we propose a mathematical model of the coexistence dynamics of these two species, the bee and the mite, to analyze the role of resistance behaviors in the overall health of the colony, and, as a consequence, its ability to face epidemiological challenges

Estimating demand for primary health care services

A Work Project, presented as part of the requirements for the Award of a Masters Degree in Economics from the NOVA – School of Business and EconomicsPrimary health services exist with the purpose of providing basic health care to every person at a cost they can afford. But is it fully available to everyone? The objective of this work project is to estimate the demand for primary health care services having into account that in some regions the citizens are not using as much health care as they would like due to supply side constraints. Using the number of consultations as proxy for demand, and applying an econometric tool called switching regression, the demand for primary health care services will be estimated

An essay on financial literacy and sustainable investing

Mestrado Bolonha em FinançasThe objective of the present study is to determine the association between sustainable investing and financial literacy. Some studies demonstrate a positive association between financial literacy and sustainable investing, while other research indicates a negative relationship between the two. Not only is the current body of literature inconclusive, but there is also a scarcity of study in this particular subject; consequently, we deemed it essential to analyze the issue. In addition, there was no research on this topic for the Portuguese population at the time of writing, making this study an important contribution to the literature. To develop this dissertation, the CMVM 2020 Online Investor Survey Results were analyzed to determine the factors that characterize a Portuguese green investor. To quantify the level of financial literacy, we employed two distinct indices: the first, an objective index based on the responses of participants to the survey's financial literacy quiz, and the second, a subjective index developed exclusively based on each individual's perceived knowledge. According to the data, both basic and advanced financial literacy have a positive correlation with sustainable investing. Demographic characteristics have a favourable correlation with sustainable investing, and the same holds true for risk perception. The results show that the income level at any level is not statistically significant. The results indicate that financial literacy plays a crucial role in explaining an individual's inclination to become a sustainable investor.O objectivo do presente estudo é determinar a associação entre o investimento sustentável e a literacia financeira. Alguns estudos demonstram uma associação positiva entre a literacia financeira e o investimento sustentável, enquanto outros estudos indicam uma relação negativa entre os dois. Não só o actual corpo de literatura é inconclusivo, como também existe uma escassez de estudo neste assunto específico; consequentemente, considerámos essencial analisar a questão. Além disso, não houve investigação sobre este tema para a população portuguesa na altura da redacção do presente relatório, o que torna este estudo um importante contributo para a conversa. Para desenvolver esta dissertação, foram analisados os resultados do Inquérito aos Investidores Online da CMVM 2020 para determinar os factores que caracterizam um investidor verde português. Para quantificar o nível de literacia financeira, utilizámos dois índices distintos: o primeiro, um índice objectivo baseado nas respostas dos participantes ao questionário de literacia financeira do inquérito, e o segundo, um índice subjectivo desenvolvido exclusivamente com base no conhecimento percepcionado de cada indivíduo. De acordo com os dados, tanto a literacia financeira básica como a literacia financeira avançada têm uma correlação positiva com o investimento sustentável. As características demográficas têm uma correlação favorável com o investimento sustentável, e o mesmo se aplica à percepção do risco. Os resultados mostram que o nível de rendimento a qualquer nível não é estatisticamente significativo. Os resultados indicam que a literacia financeira desempenha um papel crucial na explicação da inclinação de um indivíduo para se tornar um investidor sustentável.info:eu-repo/semantics/publishedVersio

A tour of health care: emergency room, hospital and home

My thesis is a small tour of the health care system (emergency room, hospital and home), with special emphasis on providers. Chapter 1 analyzes how emergency room doctors change their behavior when the waiting room is crowded. The outcomes reflect the time spent with the patient, the intensity of treatment, and discharge destination. Chapter 2 extends the previous setting to inpatient care, to determine how doctors react to hospital occupancy level. It identifies doctors’ discharging criteria as a causal factor for the positive relation between occupancy rates and readmissions. The analysis in Chapters 1 and 2 contributes to the doctors’ incentives literature, explaining how these agents behave in the context of a National Health Service, with no financial incentives. Chapter 3 examines the impact of informally providing care to a partner (at home) on the physical and mental health of the carer

Underwater Communications based on Resonant Inductive Links

Em anos mais recentes, os veículos não tripulados têm sofrido um avanço considerável no seu desenvolvimento. Devido ao subsequente aumento de interesse na exploração do oceano, em especial zonas de condições extremas cujo acesso está impossibilitado. Em concreto, nas aplicações subaquáticas, existem problemas substanciais relativos ao carregamento de forma wireless dos aparelhos, mais especificamente, à monitorização deste processo, assim como, na transferência dos dados recolhidos. Esta dissertação apresenta uma solução para o controlo de parâmetros associados ao carregamento wireless, reaproveitando o acoplamento indutivo ressonante para, além da transferência de potência já implementada, transmitir dados. Denote-se que o estudo e implementação foram desenvolvidos num sistema com um comutador de alta tensão, optimizado para uma resistência de carga igual a 12.5 Ohm, uma frequência de ressonância de 240 kHz para uma transferência de potência na ordem dos 80 W com uma eficiência máxima no acoplamento de 94%. O trabalho desenvolvido explora um patamar substancial de corrente disponível, desde 0.5 A a 2.5 A com um conjunto de resistências entre 1 Ohm a 11 Ohm. Com estes valores é possível determinar diferentes estados que, por sua vez, permitem uma comunicação wireless com um grande alcance dinâmico. A eficiência geral do acoplamento não sofre uma grande alteração para os diferentes estados necessários para o envio de informação. Sabendo que o teor de sal afeta diretamente o acoplamento e, consequentemente, os níveis de corrente do sistema, e ainda que os valores de salinidade do mar variam de região para região, é possível regular esta variação mudando o valor da resistência responsável pela modulação da carga, reforçando a modularidade do sistema. Este desenvolvimento apresenta uma solução simples e viável, apresentando-se como uma forte alternativa ao uso de circuitos externos adicionais.During more recent years there has been a considerable advancement in unmanned vehicles, more so in autonomous underwater vehicles, following the increasing interest in exploring unreachable parts of the ocean. Underwater autonomous work poses substantial obstacles when it comes to wirelessly charging the devices and most importantly to the monitoring of such operation, as well as the transfer of the data gathered. This thesis presents a solution for overseeing the parameters that come with the wireless charging of a system, repurposing the resonant inductive link to transmit bits of data in addition to the power transfer already in place. Furthermore, the work was developed on system designed with a high-voltage switching power driver, optimized for load resistance equal to 12.5 Ohm, having a resonance frequency of 240 kHz for a power transfer in the order of 80 W with a link efficiency up to 94%. The present work explores the substantial threshold of current available at the primary coil, from 0.5 A to 2.5 A with a variation of resistance from 1 Ohm to 11 Ohm seen at the secondary coil. This allows for a detection of different states which provide a wireless communication with a wide dynamic range. The overall efficiency of the link is not greatly affected by the different states necessary to transmit information. Knowing that the salinity value of the sea differs from region to region and in turn, both the levels of current and threshold are affected, it is possible to regulate the value of the resistance responsible for the load modulation to atone such difference, which makes for a system with a high level of modularity. This presents a simple and viable solution that is a clear alternative to the need of additional aftermarket circuits to monitor and assist the charging of devices underwater

Development of a machine learning-based pipeline able to predict genes associated with diseases and cell processes using interpretable network embeddings

Tese de Mestrado, Bioinformática e Biologia Computacional, 2022, Universidade de Lisboa, Faculdade de CiênciasA revolução tecnológica no mundo da sequenciação observada nas últimas duas décadas levou a um grande aumento no número de proteínas conhecidas. Porém, este aumento não foi correspondido com o aumento no seu número de anotações proteicas, em particular acerca do seu envolvimento em processos celulares e doenças. Atualmente, apenas cerca de 25% das proteínas humanas é conhecida por ter uma associação a uma doença. A lenta expansão de conhecimento destas associações deve-se essencialmente às técnicas experimentais necessárias para as descobrir, como por exemplo, estudos de ligação genética e genome-wide association studies, uma vez que falham quando aplicados a doenças heterogéneas, ou produzem números elevados de falsos positivos, respetivamente. Isto leva a um complexo processo de validação de resultados, que inevitavelmente desacelera o processo de anotação. O desenvolvimento de métodos capazes de produzir um número mais restrito de candidatos surge então como uma necessidade para a mais eficaz descoberta de associações, com vários tipos de métodos computacionais a terem sido desenvolvidos nas últimas décadas. Uma fração destes métodos foca-se no uso de redes. Os mecanismos de processos celulares e doenças surgem da coordenação de múltiplas proteínas que interagem fisicamente, formando módulos de doenças e de processos celulares numa rede de interações biológicas. As redes biológicas podem ser representadas sob a forma de grafos, objectos matemáticos que representam como um conjunto de entidades interage entre si. Os grafos são formados por um conjuntos de nós (ou vértices), ligados entre si por arestas, permitindo a fácil representação e análise de redes, como as de interação de proteínas. Estas redes podem então ser exploradas de forma a encontrar padrões de interação que caracterizem as proteínas que fazem parte de um determinado módulo, de modo a mais tarde expandir este conhecimento e encontrar novas proteínas candidatas que possam eventualmente estar associadas a esse mesmo módulo e ser experimentalmente validadas. A deteção dos padrões que caracterizam as proteínas associadas a cada módulo depende do uso de métricas capazes de discriminar as relações de interesse que cada proteína apresenta, podendo estas métricas ir desde a medição da distância de cada proteína ao módulo, ao uso de métodos mais complexos de difusão, tais como Random Walks with Restart. Muitos dos algoritmos já desenvolvidos focam-se no uso de métricas de proximidade, como o Closeness, que mede a centralidade de um determinado nó na rede, ou realizando um teste hipergeométrico de modo a analisar o enriquecimento de um nó em ligações com nós do módulo de interesse. A maioria dos algoritmos disponíveis na literatura baseia-se apenas na informação dada pela relação de cada nó com os nós do módulo em estudo, com uma minoria destes algoritmos a usar informação adicional de doenças fenotipicamente semelhantes. O mapeamento do interactoma humano ainda está por concluir, e, portanto, as redes de interação proteica usadas estão incompletas, faltando nós e arestas aos grafos contruídos. Para além disso, os processos de deteção de associações estão expostos à presença de falsos positivos. Tanto a incompletude das redes da interação como a presença de falsos positivos são fatores que podem afetar em larga escala as previsões de algoritmos que apenas se baseiam no próprio módulo, dificultando então o processo de seleção de novos candidatos. Será, portanto, interessante o desenvolvimento de um algoritmo capaz de usar uma maior fração dos dados ao seu dispor, sem depender do uso de informação, como a semelhança fenotípica, que permita uma maior precisão aquando da previsão de novos candidatos, mas também uma maior robustez sob a presença de alterações na rede de interação ou de anotações incorretas. Neste trabalho, é então proposto o desenvolvimento de um novo algoritmo para a previsão de novos candidatos associados com doenças ou processos celulares designado de Gene Annotation Prediction using Module-based Interpretable Network Embeddings (GAP-MINE). A maior contribuição deste algoritmo é o uso de network embeddings facilmente interpretáveis num contexto biológico. Network embeddings, são vetores usados para explicar a relação de cada nó da rede com os restantes através de um espaço multidimensional. Estes podem ser adaptados ao contexto de nosso problema, e assim explicar a relação que cada nó tem com cada módulo, criando, portanto, uma representação multidimensional que pode ser usada para descobrir os padrões que caracterizam as proteínas associadas a um determinado módulo, usando informação adicional contida no restante vetor. Para além disso, ao exprimirem a relação de cada nó com os diferentes módulos, estes vetores permitem uma melhor interpretação dos resultados, uma vez que permitem a análise dos módulos escolhidos. O algoritmo desenvolvido é composto por 6 passos que podem ser facilmente adaptados consoante a natureza do problema. Primeiramente, a rede de interação proteica foi construída utilizando as interações disponíveis na bases de dados APID e HuRI, juntamente com as anotações de associação de proteínas a processos e doenças, provenientes das bases de dados REACTOME e DisGeNET, respetivamente. A rede criada apresenta um total de 17 204 nós, ligados por 260 960 arestas. Foram criados três tipos de módulos: um de processos celulares, num total de 429, e dois do doença, que variam consoante a conectividade do módulo em si, porém tendo origem nos mesmo dados, totalizando um total de 203 aquando da utilização de módulos conectados, e de 301 aquando da utilização de módulos mais dispersos na rede. Cinco diferentes métricas foram, de seguida, aplicadas à rede (Hypergeometric Test, Closeness, Betweenness, Fraction Betweenness e Random Walks with Restart) sendo modificadas das suas formas normais de forma a explicar como cada nó se relaciona com os nós associados a um determinado módulo. Ao serem aplicadas aos diferentes módulos, é então formado um embedding para cada nó de dimensão igual ao número de módulos presentes na rede, resultando na matriz de embeddings de N vs. M dimensões, onde N é o número de nós da rede e M o número de módulos. À matriz é depois aplicado um passo de seleção, onde, para a classificação de um determinado módulo são selecionados os módulos que mais contribuem para a discriminação das proteínas associadas e não associadas ao mesmo. Tendo os módulos mais relevantes selecionados, os embeddings são fornecidos a um modelo de regressão logística, um algoritmo de classificação, que é treinado e otimizado com uma validação cruzada de 10 passos. Este algoritmo de classificação é depois avaliado usando um conjunto de teste, e aplicado para a totalidade dos dados de modo a prever as novas associações. Por fim, as associações previstas são validadas através comparação dos termos da Gene Ontology e da Human Phenotype Ontology (este último exclusivamente aplicado a proteínas de doença) em comum com os termos enriquecidos das proteínas do módulo alvo, e pela procura do identificador da proteína e do nome do módulo em títulos e resumos da literatura. O algoritmo GAP-MINE foi primeiramente comparado com um modelo padrão que apenas utiliza os valores obtidos para o módulo que se pretende classificar. Verificou-se que as Random Walks with Restart são as melhores métricas a ser usadas para a previsão de novas proteínas associadas aos módulos, obtendo valores medianos de F-Measure acima de 0.9 utilizando tanto o nosso algoritmo, como os modelos padrão. Comparando o nosso algoritmo com os modelos padrão, foi possível observar que foram obtidos resultados significativamente melhores em 2 dos 3 tipos de módulos aquando da utilização de tanto as Random Walks with Restart, como do Closeness como métricas, obtendo, no entanto, piores resultados usando Betweenness e Fraction Betweenness. Analisando as Random Walks with Restart em pormenor, foi possível verificar que a melhoria dos resultados obtidos se deveu a um aumento da precisão em todos os módulos, à custa de capturar um menor número de positivos. O mesmo comportamento foi verificado em testes feitos onde a rede utilizada foi alterada para simular casos de falta de informação ou da inclusão de falsos positivos. A combinação GAP-MINE com Random Walks with Restart foi também comparada com outros algoritmos já estabelecidos (GenePANDA, Raw e MaxLink), tendo sido observado que o nosso algoritmo é capaz de obter resultados significativamente melhores do que qualquer um dos três algoritmos. De forma geral, as previsões feitas pelo nosso algoritmo mostram-se enriquecidas em termos relevantes e relacionados com ostermos associados aos diferentes processos e doenças, tendo também sido possível verificar a presença na literatura de algumas das novas associações. Concluindo, o nosso algoritmo mostra-se ser uma alternativa capaz de prever novas associações entre proteínas e processos celulares/doenças, com uma melhoria de precisão, o que deverá facilitar o processo de validação experimental, e acelerar a descoberta de novas associações.The rapid growth of genomic sequences has expanded the number of known proteins, however, their annotation mapping to known diseases and cell processes is still trailing. Protein mapping relies on experimental methods, such as linkage mapping studies, that are both expensive and time-consuming, so computational methods have emerged as alternatives for candidate prioritization. Network-based algorithms are one kind of algorithm that has been developed for this purpose. Diseases and cell processes are resultant of the coordination of multiple physically interacting proteins, thus, biological networks can be used to search for new proteins that frequently interact with other disease or process associated proteins. Although several algorithms have been developed to tackle this problem, most of them do not use the full extent of available information within the network for their predictions, only relying on the known proteins associated with the disease/cell process of interest, or only using additional information from phenotypically similar diseases. Here we propose GAP-MINE, a network-based algorithm with module-based interpretable embeddings, that uses additional modules to improve the prediction of new gene annotations. GAP-MINE is an adaptable algorithm with diverse possibilities in each of its several steps, such as the use of different classification algorithms or different protein interaction networks. We applied GAP-MINE in the discovery of newly associated genes for a total of 429 processes and 301 diseases. Using Random Walks with Restart as the scoring function, GAP-MINE shows median F-Measure scores consistently above 0.9. Compared to baseline and literature algorithms, GAP-MINE not only shows significantly better results but is also more precise and robust to the addition of noise, with its candidates showing biologically relevant annotations. GAP-MINE is therefore a suitable algorithm for gene annotation prediction and could be used to narrow down the number of genes to validate experimentally

Musica em doentes hospitalizados: alterações na frequência cardíaca

ABSTRACT: Introduction: Music can be characterized as a representation of feelings, having also scientifically evidenced benefits in various contexts. The heart rate variability is directly related to the central nervous system and any situations that can influence it. Therefore, depending on the type of music, heart rate may be subject to changes that may be related to the emotional well-being that music stimulate. To that purpose, the main objective was to study the heart rate variation in a group of individuals exposed to music that can trigger different emotional states. Methods: In the first phase of the study, 20 classical music songs were tested in 73 healthy subjects, in order to distinguish two songs that stimulate distinct emotions with the purpose of applying them in the second phase of the study, namely to a sample collected in 3 geographical dispersed hospitals, so as to ensure an evaluation in the same clinical contexts but different geographic locations. The two songs were applied to 50 subjects and we registered the heart rate in four different times, before and after each song with an interval of 3 minutes between each time, including a break between songs. Thus, this study is considered prospective cross-sectional with non-probability sampling technique for convenience. Results: We found statistically significant differences in heart rate at the 2-4 moment (p = 0.04) and at the 3-4 moment (p = 0.005), with a significant correlation of the same with Gender and Moment (p = 0.019), Place and Moment / Music (p = 0.039) and Stress and Moment / Music (p = 0.030). Conclusion: We found changes in heart rate according to the emotional nature of music, thus confirming the central research hypothesis of this study.info:eu-repo/semantics/publishedVersio