Conception d’un adaptateur moléculaire pour l’immobilisation de facteurs de croissance sur un substrat de collagène

RÉSUMÉ Les biomatériaux à base de collagène ont une place particulièrement importante dans le domaine de l’ingénierie tissulaire. Leur fonctionnalisation peut être facilement effectuée à l’aide de protéines chimères constituée d’une biomolécule, typiquement un facteur de croissance, fusionnée à un domaine de liaison au collagène. Cette fonctionnalisation peut conférer aux biomatériaux des propriétés mitogéniques et anti-apoptotiques, et influencer la colonisation de ce dernier par des cellules. De nombreuses études ont été menées en ce sens dans des domaines variés de la médecine régénératrice, comme la cicatrisation ou la régénération osseuse. Nous avons choisi d’immobiliser des facteurs de croissance étiquetés avec une hélice alpha (Ecoil-GF) sur un substrat de gélatine en utilisant un adaptateur moléculaire constitué du domaine de liaison au collagène de la fibronectine, étiqueté avec l’hélice alpha partenaire (CBD-Kcoil). Les hélices alpha Ecoil et Kcoil interagissent par interaction superhélice d’une manière spécifique avec une forte affinité, ce qui permet la formation d’un complexe entre la gélatine, l’adaptateur moléculaire CBD-Kcoil et le facteur de croissance Ecoil-GF. Nous avons produit et purifié le facteur de croissance des fibroblastes basique étiqueté avec l’hélice Ecoil (Ecoil-bFGF), et nous avons comparé son immobilisation avec celle du facteur de croissance épidermique, en utilisant l’adaptateur moléculaire CBD-Kcoil.----------ABSTRACT Collagen-based biomaterials have attracted a lot of interest in the field of tissue engineering. Their functionalization can be easily performed using chimeric proteins composed of a biomolecule, typically a growth factor, that is fused to a collagen-binding domain. This functionalization may provide biomaterials with mitogenic and anti-apoptotic properties, and influence the cellular fate within the implant. Many studies have been conducted to this end, in various fields of regenerative medicine, such as wound healing and bone regeneration. We chose to tether coil-tagged growth factors (Ecoil-GF) on a gelatin substrate using a molecular adaptor consisting of the collagen-binding domain of fibronectin, fused to the complementary coil (CBD-Kcoil). E and K coils interacted through coiled-coil interaction in a specific manner with high affinity, which enabled the formation of a ternary complex between the gelatin substrate, the molecular adapter CBD-Kcoil and the growth factor Ecoil-GF. We have produced and purified an Ecoil-tagged basic fibroblast growth factor (Ecoil-bFGF), and we have compared its tethering with that of the epidermal growth factor, using the molecular adaptor CBD-Kcoil

ALIX / Syntenin / Syndecan-4 : an ESCRT-to-membrane coupling required for completion of cytokinesis

La cytocinèse est l’étape finale de séparation des deux cellules filles, après la mitose. Elle commence avec la formation d’un sillon de clivage, généré par un anneau d’actomyosine, menant à la formation d’un pont intercellulaire dont le centre est dénommé « midbody ». Les mécanismes qui mènent à l’abscission sont encore largement incompris, mais le modèle actuellement retenu fait intervenir la polymérisation de filaments d’ESCRT-III. Ces protéines sont en particulier localisées au niveau des sites d’abscission et sont nécessaires à la coupure du pont intercellulaire. On ne sait pas si ces protéines ESCRT-III interagissent avec une protéine membranaire dans le cadre de la cytocinèse, comme c’est le cas dans d’autres événements topologiquement équivalents où les ESCRT-III sont impliquées, comme par exemple le bourgeonnement du VIH ou la formation des exosomes. Dans ce dernier cas, Synténine est connue pour agir comme un adaptateur entre les protéines transmembranaires Syndécans et les protéines ALIX/ESCRT-III, ce qui est nécessaire pour la scission des exosomes à l’intérieur des corps multivésiculaires. Avant mon arrivée, le laboratoire TMDC a purifié et analysé par spectrométrie de masse des « midbody remnants » de cellules HeLa, une structure résiduelle générée après l’abscission. Cette analyse a mis en évidence l’enrichissement d’environ 500 protéines dans ces « midbody remnants », dont une grande partie n’avaient jamais été décrites comme requises pour la cytocinèse, en particulier Synténine et Syndécan-4. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du couple Synténine/Syndécan-4 dans les dernières étapes de la cytocinèse, d’autant plus qu’aucune protéine transmembranaire n’a pour le moment été étudiée dans le cadre de l’abscission. Des expériences d’immunofluorescence sur des ponts intercellulaires de cellules HeLa ont montré que les protéines endogènes Syndécan-4, Synténine, ALIX et CHMP4B (une protéine du complexe ESCRT-III) colocalisent au niveau du midbody et sur son côté, au site d’abscission. En vidéomicroscopie, mScarlet-Synténine et GFP-Syndécan-4 sont d’abord recrutées au midbody, puis dans un deuxième temps, sont enrichies au site d’abscission, comme ce qui a déjà été montré pour les protéines ESCRT-III. Au niveau mécanistique, ALIX est nécessaire au recrutement de Synténine au pont intercellulaire, et Synténine est elle-même nécessaire au bon recrutement de Syndécan-4. D’un point de vue fonctionnel, la déplétion d’ALIX, de Synténine ou de Syndécan-4 retarde fortement l’abscission et empêche le recrutement stable des protéines ESCRT-III au site d’abscission. L’ensemble de ces résultats montre qu’ALIX, Synténine et Syndécan-4 interagissent dans le cadre de la cytocinèse et qu’ils permettent la bonne localisation des protéines ESCRT-III au niveau du site d’abscission. Syndecan-4 est la première protéine transmembranaire directement impliquée dans l’abscission ; je propose que cette protéine couple les forces générées par les filaments d’ALIX/ESCRT-III et la membrane, ce qui permet la scission effective du pont intercellulaire.Cytokinesis is the final step that mediates the separation of the two daughter cells after mitosis. It begins with the formation of a cleavage furrow, generated by an actomyosin ring, which leads to the formation of an intercellular bridge whose center is called the "midbody". The mechanisms that lead to abscission are not fully understood, but the commonly accepted model involves the polymerization of ESCRT-III filaments. In particular, these proteins are localized at the abscission sites and are required for the severing the intercellular bridge. It is not known whether these ESCRT-III proteins interact with a membrane protein in the context of cytokinesis, as it has been shown in other topologically equivalent events in which ESCRT-III are involved, such as HIV budding or biogenesis of exosomes. In the latter case, Syntenin is known to act as an adapter between the transmembrane proteins Syndecans and the ALIX / ESCRT-III proteins, and this is required for the proper release of exosomes within the multivesicular bodies. Before my arrival, the laboratory had purified and analyzed by mass spectrometry "midbody remnants" of HeLa cells, a midbody released after abscission. This analysis revealed the enrichment of approximately 500 proteins in the "midbody remnants", a large part of which had never been shown to be required for cytokinesis, in particular Syntenin and Syndecan-4. The aim of my thesis was to determine the role of the Syntenin / Syndecan-4 couple in the last stages of cytokinesis, especially because no transmembrane protein has yet been studied in the context of cytokinetic abscission. Immunofluorescence experiments on intercellular bridges of HeLa cells showed that the endogenous proteins Syndecan-4, Syntenin, ALIX and CHMP4B (a protein of the ESCRT-III complex) colocalize at the midbody and on its side, at the site of abscission. In videomicroscopy, mScarlet-Syntenin and GFP-Syndecan-4 are first recruited to the midbody, and then, in a second step, are enriched at the abscission site, as it has already been shown for ESCRT-III proteins. From a mechanistic point of view, ALIX is required for the recruitment of Syntenin at the intercellular bridge, and Syntenin is itself required for the proper recruitment of Syndecan-4. From a functional point of view, the depletion of ALIX, Syntenin or Syndecan-4 strongly delays abscission and prevents the stable recruitment of ESCRT-III proteins at the abscission site. All these results show that ALIX, Syntenin and Syndecan-4 interact together in the context of cytokinesis and that they allow the proper localization of ESCRT-III proteins at the abscission site. Syndecan-4 is the first transmembrane protein directly involved in abscission; I propose that this protein couples the forces generated by the ALIX / ESCRT-III filaments to the plasma membrane, and therefore promotes the scission of the intercellular bridge

ALIX / Syntenin / Syndecan-4 : un couplage entre la machinerie ESCRT et la membrane plasmique requis pour la cytocinèse

Cytokinesis is the final step that mediates the separation of the two daughter cells after mitosis. It begins with the formation of a cleavage furrow, generated by an actomyosin ring, which leads to the formation of an intercellular bridge whose center is called the "midbody". The mechanisms that lead to abscission are not fully understood, but the commonly accepted model involves the polymerization of ESCRT-III filaments. In particular, these proteins are localized at the abscission sites and are required for the severing the intercellular bridge. It is not known whether these ESCRT-III proteins interact with a membrane protein in the context of cytokinesis, as it has been shown in other topologically equivalent events in which ESCRT-III are involved, such as HIV budding or biogenesis of exosomes. In the latter case, Syntenin is known to act as an adapter between the transmembrane proteins Syndecans and the ALIX / ESCRT-III proteins, and this is required for the proper release of exosomes within the multivesicular bodies. Before my arrival, the laboratory had purified and analyzed by mass spectrometry "midbody remnants" of HeLa cells, a midbody released after abscission. This analysis revealed the enrichment of approximately 500 proteins in the "midbody remnants", a large part of which had never been shown to be required for cytokinesis, in particular Syntenin and Syndecan-4. The aim of my thesis was to determine the role of the Syntenin / Syndecan-4 couple in the last stages of cytokinesis, especially because no transmembrane protein has yet been studied in the context of cytokinetic abscission. Immunofluorescence experiments on intercellular bridges of HeLa cells showed that the endogenous proteins Syndecan-4, Syntenin, ALIX and CHMP4B (a protein of the ESCRT-III complex) colocalize at the midbody and on its side, at the site of abscission. In videomicroscopy, mScarlet-Syntenin and GFP-Syndecan-4 are first recruited to the midbody, and then, in a second step, are enriched at the abscission site, as it has already been shown for ESCRT-III proteins. From a mechanistic point of view, ALIX is required for the recruitment of Syntenin at the intercellular bridge, and Syntenin is itself required for the proper recruitment of Syndecan-4. From a functional point of view, the depletion of ALIX, Syntenin or Syndecan-4 strongly delays abscission and prevents the stable recruitment of ESCRT-III proteins at the abscission site. All these results show that ALIX, Syntenin and Syndecan-4 interact together in the context of cytokinesis and that they allow the proper localization of ESCRT-III proteins at the abscission site. Syndecan-4 is the first transmembrane protein directly involved in abscission; I propose that this protein couples the forces generated by the ALIX / ESCRT-III filaments to the plasma membrane, and therefore promotes the scission of the intercellular bridge.La cytocinèse est l’étape finale de séparation des deux cellules filles, après la mitose. Elle commence avec la formation d’un sillon de clivage, généré par un anneau d’actomyosine, menant à la formation d’un pont intercellulaire dont le centre est dénommé « midbody ». Les mécanismes qui mènent à l’abscission sont encore largement incompris, mais le modèle actuellement retenu fait intervenir la polymérisation de filaments d’ESCRT-III. Ces protéines sont en particulier localisées au niveau des sites d’abscission et sont nécessaires à la coupure du pont intercellulaire. On ne sait pas si ces protéines ESCRT-III interagissent avec une protéine membranaire dans le cadre de la cytocinèse, comme c’est le cas dans d’autres événements topologiquement équivalents où les ESCRT-III sont impliquées, comme par exemple le bourgeonnement du VIH ou la formation des exosomes. Dans ce dernier cas, Synténine est connue pour agir comme un adaptateur entre les protéines transmembranaires Syndécans et les protéines ALIX/ESCRT-III, ce qui est nécessaire pour la scission des exosomes à l’intérieur des corps multivésiculaires. Avant mon arrivée, le laboratoire TMDC a purifié et analysé par spectrométrie de masse des « midbody remnants » de cellules HeLa, une structure résiduelle générée après l’abscission. Cette analyse a mis en évidence l’enrichissement d’environ 500 protéines dans ces « midbody remnants », dont une grande partie n’avaient jamais été décrites comme requises pour la cytocinèse, en particulier Synténine et Syndécan-4. L’objectif de ma thèse a été de déterminer le rôle du couple Synténine/Syndécan-4 dans les dernières étapes de la cytocinèse, d’autant plus qu’aucune protéine transmembranaire n’a pour le moment été étudiée dans le cadre de l’abscission. Des expériences d’immunofluorescence sur des ponts intercellulaires de cellules HeLa ont montré que les protéines endogènes Syndécan-4, Synténine, ALIX et CHMP4B (une protéine du complexe ESCRT-III) colocalisent au niveau du midbody et sur son côté, au site d’abscission. En vidéomicroscopie, mScarlet-Synténine et GFP-Syndécan-4 sont d’abord recrutées au midbody, puis dans un deuxième temps, sont enrichies au site d’abscission, comme ce qui a déjà été montré pour les protéines ESCRT-III. Au niveau mécanistique, ALIX est nécessaire au recrutement de Synténine au pont intercellulaire, et Synténine est elle-même nécessaire au bon recrutement de Syndécan-4. D’un point de vue fonctionnel, la déplétion d’ALIX, de Synténine ou de Syndécan-4 retarde fortement l’abscission et empêche le recrutement stable des protéines ESCRT-III au site d’abscission. L’ensemble de ces résultats montre qu’ALIX, Synténine et Syndécan-4 interagissent dans le cadre de la cytocinèse et qu’ils permettent la bonne localisation des protéines ESCRT-III au niveau du site d’abscission. Syndecan-4 est la première protéine transmembranaire directement impliquée dans l’abscission ; je propose que cette protéine couple les forces générées par les filaments d’ALIX/ESCRT-III et la membrane, ce qui permet la scission effective du pont intercellulaire

Cell Biology: Alix ESCRTs Pavarotti During Cell Division

International audienceCytokinesis leads to the physical separation of the daughter cells and requires the constriction of ESCRT filaments. How the ESCRT machinery is recruited in non-vertebrate organisms was puzzling, and is now shown to rely on a direct interaction between the ESCRT-associated protein ALIX and the kinesin motor Pavarotti in Drosophila

Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis

International audienc

Fluorogenic Protein Probes with Red or Near-Infrared Emission for Genetically Targeted Live-Cell Imaging

A series of red-emitting and near-infrared fluorogenic protein probes based on push-pull molecular rotor structures was developed. After characterization of their optical properties using Bovine Serum Albumin as a model protein, they were conjugated to a halogenoalkane ligand in order to target the protein self-labeling tag HaloTag. The interaction with HaloTag was investigated in vitro and then the most promising probes were applied to live-cell imaging in wash-free conditions using fluorogenic and chemogenetic targeting of HaloTag fusion proteins.<br /

The Flemmingsome reveals an ESCRT-to-membrane coupling via ALIX/syntenin/syndecan-4 required for completion of cytokinesis

International audienceCytokinesis requires the constriction of ESCRT-III filaments on the side of the midbody, where abscission occurs. After ESCRT recruitment at the midbody, it is not known how the ESCRT-III machinery localizes to the abscission site. To reveal actors involved in abscission, we obtained the proteome of intact, post-abscission midbodies (Flemmingsome) and identified 489 proteins enriched in this organelle. Among these proteins, we further characterized a plasma membrane-to-ESCRT module composed of the transmembrane proteoglycan syndecan-4, ALIX and syntenin, a protein that bridges ESCRT-III/ALIX to syndecans. The three proteins are highly recruited first at the midbody then at the abscission site, and their depletion delays abscission. Mechanistically, direct interactions between ALIX, syntenin and syndecan-4 are essential for proper enrichment of the ESCRT-III machinery at the abscission site, but not at the midbody. We propose that the ESCRT-III machinery must be physically coupled to a membrane protein at the cytokinetic abscission site for efficient scission, uncovering common requirements in cytokinesis, exosome formation and HIV budding