Electrochemical enzyme-based biosensor array for monitoring of organic acids and ethanol in biogas processes

In light of steadily increasing energy demand and irreversible exhaustion of fossil fuels, further expansion of renewable energy sources is continually gaining importance. Utilization of biomass, as a widely available energy carrier, is capable of providing great contribution to sustainable energy supply. The efficient production of biogas, however, calls for an improved biomass supply chain. Economic operation of biogas plants depends in particular on reliable process monitoring. Often, process disturbances are accompanied by fluctuations in the concentration profile of some intermediates produced during the anaerobic fermentation process. Nowadays, the focus has mainly been set on volatile fatty acids (such as acetate and propionate) as an indicator for imbalanced process conditions and only little account has been taken to the relevance of other organic acids and alcohols, like lactate, formate and ethanol. In this work, an electrochemical enzyme-based biosensor array for simultaneous determination of D-lactate, L-lactate, formate and ethanol is developed. The amperometric sensing principle is based on two enzymes in each case: an analyte-specific NAD+-dependent dehydrogenase combined with a diaphorase from Clostridium kluyveri. The latter converts its substrate Fe(CN)63- to Fe(CN)64-, which generates a concentration-dependent current by oxidation at an polarized electrode. Enzymes were immobilized by chemical cross-linking with glutaraldehyde on platinum thin-film electrodes. The optimization of the biosensor performance has been investigated in regard to enzyme loading, glutaraldehyde concentration, cofactor concentration (NAD+ and Fe(CN)63-), pH value and temperature. The potential for repeated and long-term application has been proven by evaluation of operational and storage stability. Typically, enzyme-based biosensors are characterized by a high specificity due to the remarkable properties of enzymes as biological recognition element. Measurements in real samples, however, are prone to interfering effects by other electroactive species in the sample solution. The specificity of the biosensing system is determined in response to various interfering compounds and results reveal no cross-talk effects during simultaneous measurement of the four different analytes of interest. Successful practical performance for rapid and on-site analysis, has been demonstrated by quantification of D-lactate, L-lactate, formate and ethanol in various feedstocks (maize- and sugar cane silage) and spiked fermentation samples from three industrial biogas plants. Good correlation is obtained for results determined by the biosensor array in comparison to conventional commercial analytical methods applied (photometry and gas chromatography). In contrast to these techniques, the biosensor array offers the advantages of facile on-site application with a portable measurement set-up, rapid analysis time by simultaneous operation and application in untreated samples. The measuring system has also been applied for long-term monitoring of a lab-scale biogas reactor (0.01 m3) for a period of two months. Regular analysis of alcohol- and organic acid levels provides a beneficial supplementation to standard monitoring parameters, like biogas production, methane yield, pH and temperature. This additional information can help to identify changes in the microbial methane formation and potentially indicate upcoming imbalances at an early stage. For improved practical implementation of the developed biosensor array, the required cofactors have been co-immobilized on the sensor surface of screen-printed carbon electrodes. Modification with graphene oxide enables the establishment of a reagent-free biosensing system. Such biosensors can be manufactured economically by thick-film technology and used as disposable test strips for simplified on-site monitoring of several key intermediates in the biogas fermentation medium

Autonomous support for microorganism research in space

A preliminary design for performing on orbit, autonomous research on microorganisms and cultured cells/tissues is presented. An understanding of gravity and its effects on cells is crucial for space exploration as well as for terrestrial applications. The payload is designed to be compatible with the Commercial Experiment Transporter (COMET) launch vehicle, an orbiter middeck locker interface, and with Space Station Freedom. Uplink/downlink capabilities and sample return through controlled reentry are available for all carriers. Autonomous testing activities are preprogrammed with in-flight reprogrammability. Sensors for monitoring temperature, pH, light, gravity levels, vibrations, and radiation are provided for environmental regulation and experimental data collection. Additional experimental data acquisition includes optical density measurement, microscopy, video, and film photography. On-board full data storage capabilities are provided. A fluid transfer mechanism is utilized for inoculation, sampling, and nutrient replenishment of experiment cultures. In addition to payload design, representative experiments were developed to ensure scientific objectives remained compatible with hardware capabilities. The project is defined to provide biological data pertinent to extended duration crewed space flight including crew health issues and development of a Controlled Ecological Life Support System (CELSS). In addition, opportunities are opened for investigations leading to commercial applications of space, such as pharmaceutical development, modeling of terrestrial diseases, and material processing

Effect of curing conditions and harvesting stage of maturity on Ethiopian onion bulb drying properties

The study was conducted to investigate the impact of curing conditions and harvesting stageson the drying quality of onion bulbs. The onion bulbs (Bombay Red cultivar) were harvested at three harvesting stages (early, optimum, and late maturity) and cured at three different temperatures (30, 40 and 50 oC) and relative humidity (30, 50 and 70%). The results revealed that curing temperature, RH, and maturity stage had significant effects on all measuredattributesexcept total soluble solids

Valorization of Food Processing By-Products as Smart Food Packaging Materials and Its Application

Traditional food packaging systems cannot provide any information related to the food quality during storage to consumers. Recently, the renewable resources have been considered as starting materials for making biodegradable packaging film. A variety of food processing by-products have been utilized, either alone or in mixtures, to produce packaging films with proper properties. It shows high possibility for smart biodegradable filmmaking as well as is applicable in the food industry. In order to monitor the food quality and to reduce the food loss and waste, a new packaging technology has been increasingly developed. Smart packaging refers to packaging systems which can monitor, detect, and inform about the qualities of food in real time. Indicator is the most commonly used device, which can communicate through direct visual change, especially in color. Natural extract and synthetic color are usually added into smart packaging films. However, synthetic dyes may be harmful to the consumers’ health. Thus, the use of natural extract has been increased. Smart packaging films can be applied to various types of food products in order to monitor the food quality during transportation and storage. Thus, smart packaging could be used as a nondestructive tool to detect the food quality

Mõnede ravimijääkide sisaldus Eesti reoveesettes, nende stabiilsus keskkonnas ja akumuleerumine kompostväetisest toidutaimedesse

Maakera rahvastiku kasv toob kaasa üha uusi lahendamist vajavaid keskkonnaprobleeme. Intensiivistuva toiduainete tootmise tingimustes on vaja üha enam tähelepanu pöörata toiduohutuse tagamisele. Käesoleva doktoritöö autor on uurinud toidutekkelisi parasitaarja viirushaigusi (Lillenberg ja Järvis, 2005), toiduainete saastumist patogeensete bakteritega (Roasto et al., 2009; Meremäe et al., 2010; Roasto et al., 2011), tegelenud mullas ja toidutaimedes sisalduvate ravimijääkide määramismeetodite väljatöötamisega (Lillenberg, 2003; Lillenberg et al., 2003) ning reoveepuhastusalase probleemistikuga (Nei ja Lillenberg, 20091). Põhiline osa uurimistööst on aga seotud reoveesette kasutamisvõimaluste uurimisega mullaviljakuse tõstmisel. Reoveesete on väga toiteaineterikas, kuid lisaks toitainetele sisaldab see kahjuks mitmesuguseid saasteaineid, olles seega oma olemuselt ohtlik jääde. Vaatamata sellele on reoveesetet lubatud kasutada väetisena haljastuses, metsanduses ja ka põllumajanduses tingimusel, et see on muudetud ohutuks keskkonnale ning inimeste ja loomade tervisele. Rahvusvaheliselt ja siseriiklikult kehtivad regulatsioonid nõuavad raskemetallide, fekaalsete coli-laadsete bakterite ja helmintide munade sisalduse määramist, mis on aga sette ohutuse hindamise seisukohalt selgelt ebapiisav, sest selles sisalduvate bioloogiliste ja keemiliste kontaminantide hulk võib-olla mitmeid kordi suurem. Seetõttu leiab reoveesete julgemat kasutamist haljastuses, metsanduses ja prügilate katmisel kui põllumajanduses. Üha enam on hakatud reoveesetet koos muude kütustega põletama või sellest biogaasi tootma. Viimasel aastakümnel on pööratud varasemast suuremat tähelepanu keskkonna saastumisele ravimijääkidega. Kanalisatsiooni ja sealt edasi reoveesettesse satub ravimeid, mille liikumine ahelas reovesi – reoveesete – kompost – muld – taim – inimene (või loom) võib ohustada ahela viimast lüli. Reoveesettes sisalduvate ravimijääkide lagunemiskiiruse sõltuvust komposti valmistamise tehnoloogiast ei ole seni maailmas uuritud, see 90 on uudne ja oluline teema. Piisavalt ei ole uuritud ka ravimite liikumist väetatud mullast taimedesse. Teaduspublikatsioonides rõhutatakse ravimite taimedesse akumuleerumise väljaselgitamise tähtsust. Mõned laialdaselt kasutatavad antibiootikumid, näiteks tetratsükliinid ja fluorokinoloonid, säilivad mullas kaua. Laborkatsed on kinnitanud, et sulfoonamiidid ja fluorokinoloonid akumuleeruvad taimedesse, sh. toidutaimedesse. Erinevalt loomorganismist puudub taimedel väljutusmehhanism ning seetõttu võivad ravimid taimedes kontsentreeruda. Kasvuperioodi lõpuks võib taime ravimisisaldus olla suurem kui kasvumullas ja ületada loomsele toidutoormele kehtestatud piirnormi, millega kaasneb oht inimese tervisele (Lillenberg et al., 2003). Tuginedes teadaolevatele andmetele, uuriti keskkonnas kauapüsivate ja potentsiaalselt taimedesse akumuleeruvate ravimijääkide sisaldust Eesti suuremate linnade, Tallinna ja Tartu, reoveesettes, nende lagunemist sette töötlemise käigus ja akumuleerumist mullast toidutaimedesse. Uuritavate ravimite valikul lähtuti ka eelnevatel aastatel Eestis müüdud ravimite kogustest (Eesti ravimistatistika 2002–2006; Eesti ravimistatistika 2006– 2008). Ravimijääkide sisaldust reoveesettes ja kompostis ei ole Eestis varem uuritud. Esmakordselt uuriti ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse madalate ravimikontsentratsioonide korral, millised võiksid reoveesettega väetatud mullas esineda. Reoveesette ja komposti proovid võeti AS Tallinna Vesi ja AS Tartu Veevärk reoveepuhastusjaamadest. Katsemullad valmistati ette Eesti Maaülikooli PKI mullateaduse ja agrokeemia osakonnas. Taimkatsed viidi läbi Luunjas, AS Grüne Fee kasvuhoones. Kromatograafilised analüüsid teostati Tartu Ülikooli Keemiainstituudis. Taimkatseteks valiti lehtsalat (Lactuca sativa L), porgand (Daucus carota L), kartul (Solanum tuberosum L) ja nisu (Triticum vulgare L). Käesolevas töös kasutatud uurimismetoodikate väljatöötamine ja töö tulemused on leidnud kajastamist ISI teadusartiklites (Lillenberg et al., 2009; Lillenberg et al., 20101; Lillenberg et al., 20102; Kipper et al., 2010). Töö tulemusi on esitletud ka mitmetel rahvusvahelistel konverentsidel (SETAC Varssavi, 2008; SETAC Tampa, 2008; CNSSS Tallinn, 2009; ICEST Bangkok, 2010; SETAC Sevilla, 2010; ICBEE Kairo, 2010) ning populaarses vormis ajakirjas „Keskkonnatehnika“ (Nei ja Lillenberg, 20092). 91 8.2. Kirjanduse ülevaade Keskkonna saastumine ravimitega on muutunud oluliseks uurimisvaldkonnaks. Läbinud inimese või looma organismi, väljuvad ravimid kas muundumata kujul või metaboliitidena keskkonda. Neid on leitud sõnnikus ja reovees, reoveesettes ja pinnavees, kompostväetises ja väetatud mullas. Ravimid võivad keskkonnas kahjulikeks osutuda, kuna nad on loodud eesmärgiga mõjutada bioloogilisi objektide. Neil on sageli biostruktuuridega sarnased füüsikalis-keemilised omadused nagu lipofiilsus, mis võimaldab läbida biomembraane ja stabiilsus, mis hoiab ära nende inaktiivseks muutumise enne raviefekti tekitamist. Nii on ravimitel olemas vajalikud omadused, et akumuleeruda organismides ja kutsuda esile muutusi vee ja pinnase ökosüsteemides (Halling- Sørensen et al., 1998). Sõnniku või reoveesette kompostväetise koostises jõuavad ravimid põllumajandusmaadele. Osa neist lagundatakse mulla mikroorganismide poolt mõne päeva või nädala jooksul (Thiele-Bruhn, 2003), stabiilsemad võivad mullas muutumatuna säilida isegi üle aasta (Golet et al., 2002). Reoveesette kasutamine põllumajandusväetisena on globaalne probleem. Seoses maailma rahvastiku kiire kasvuga suurenevad ka reovee töötlemisel tekkiva sette kogused, mis tuleb puhastitest eemaldada. Reoveepuhastite territooriumitele kuhjuvad kompostihunnikud, mille utiliseerimine ei ole kerge. Kuigi reoveesette kompost on kahtlemata hea orgaaniline väetis, võib see osutuda keskkonnale, inimesele ja loomadele ohtlikuks nende keemiliste või bioloogiliste kontaminantide sisalduse tõttu, mille regulaarset kontrollimist reoveesette kasutamise määrus ette ei näe (ravimijäägid, patogeensed bakterid, seened, viirused). Komposti kasutamine haljastusväetisena või rekultiveerimiseks Eestis probleeme ei tekita, põllumajandusväetisena leiab kompost kasutamist palju harvemini. Ravimeid fluorokinoloonide, sulfoonamiidide ja tetratsükliinide rühmadest on leitud mitmel pool maailmas reovees, reoveesette koostises ja puhastatud vees (Golet et al., 2002; Lindberg et al., 2005; Göbel et al., 2005; Okuda et al., 2009; Spongberg and Witter, 2008; Gros et al., 2007) Reoveesette töötlemise tehnoloogiad on erinevad, kuid kõik need peaksid tagama sette ohutuse keskkonnale ning inimeste ja loomade tervisele. Töötlemata reoveesette kasutamine põllumajanduses on keelatud. Euroopa Liidus, sh. Eestis kehtiv reoveesette kasutamise määrus lubab 92 töödeldud reoveesetet kasutada põllumajandusväetisena, kui see ei sisalda üle normi fekaalseid coli-laadseid baktereid, raskemetallide jääke ega helmintide mune. Teiste bioloogiliste või keemiliste kontaminantide sisalduse kontrollimine ei ole kohustuslik (Riigi Teataja I, 2004). Kuigi on andmeid, et ravimid jõuavad mullast taimedesse, piirnormid ravimite jääkidele taimses toidutoormes puuduvad. Loomsele toidutoormele kehtestatud MRL (maximum residue limit – ravimijäägi maksimaalne lubatud sisaldus) sõltub ravimi farmakoloogilistest omadustest, looma liigist ja koest (EMA/EPMARs). Osa allikaid väidab, et ravimijääkide „omastamine” mullast on tühine (Boxall et al., 2006; Thiele Bruhn, 2003). Teised autorid, vastupidi, peavad ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse sedavõrd tõsiseks probleemiks, et on teinud ettepaneku kehtestada MRL ka taimsele toidutoormele (Brambilla et al., 1996). Artiklis (Jjemba, 2002) rõhutatakse ravimite taimedesse akumuleerumise uurimise olulisust. Vajalikuks peetakse ka ravimite degradatsiooni uurimist reoveesette erinevate töötlemistehnoloogiate korral. Vähestes töödes on uuritud ravimijääkide sisalduse vähenemist sõnniku kompostimisel (Dolliver et al., 2008). Ravimijääkide degradatsiooni reoveesette kompostimise käigus ei ole maailmas seni uuritud. Euroopa Liidus puuduvad normatiivid ravimijääkide sisalduse kohta reoveesette kompostis (EU Council Directive 86/278/EEC, 1986). Soovitatavad veterinaarravimite sisalduse piirnormid sõnnikus on 100 μg/kg ja sõnnikuga väetatud mullas 10 μg/kg (EMEA/CVMP/055/96, 1996). Kuid need normid on tänaseks seatud kahtluse alla kui liiga kõrged. Euroopa Liidu Teaduskomitee toksikoloogia, ökotoksikoloogia ja keskkonna küsimustes (EU ESCTEE) peab antud piirnorme mitteteaduslikeks, kuna need ei välista ohtu kõigile mulla mikroorganismidele. Uueks, keskkonnale ohutuks ravimisisalduse piirnormiks mullas pakutakse 1 μg/kg. See on arvutatud arvestades erinevate ravimite MIC-i (Minimum Inhibitory Concentration – minimaalne inhibeeriv kontsentratsioon) väärtusi mulla mikroorganismidele. MIC-l põhinev ravimisisalduse piirnorm ei välista aga ravimresistentsuse arenemist mullamikroobidel. Selleks piisab palju väiksemast ravimikontsentratsioonist mullas – MEC (Minimum Effect Concentration - minimaalse mõju kontsentratsioon), mille juures mikroobide kasv aeglustub (O´Reilly and Smith, 1999). Ravimresistentsuse teket välistav ravimisisaldus mullas ei tohiks ületada 0,01–0,1 μg/kg (Montforts, 2005). 93 Anaeroobse töötlemisega ohutuks muudetud reoveesettest on leitud fluorokinoloonide jääke kontsentratsioonides 2130-2420 μg/kg (Golet et al., 2002), mis ületab ravimisisalduse piirnormi sõnnikus 100 μg/kg (EMEA/CVMP/055/96, 1996) üle kahekümne korra. Reoveesettega väetatud mullast on leitud fluorokinoloonide jääke 21 kuu pärast: tsiprofloksatsiini keskmiselt 270 μg/kg ja norfloksatsiini 300 μg/kg kohta (Golet et al., 2002). Walters et al. (2010) näitasid fluorokinoloonide pikaajalist säilimist reoveesettega väetatud mullas. Vahetult pärast reoveesette laotamist oli tsiprofloksatsiini sisaldus mullas 542 ja ofloksatsiini sisaldus 470 μg/kg (kuivaine kohta). 994 päeva pärast ei olnud kumbki antibiootikum mullas lõplikult lagunenud, nende sisalduseks saadi 390 μg/kg (tsiprofloksatsiin) ja 267 μg/kg (ofloksatsiin) (Walters et al., 2010). Sulfoonamiide on leitud reoveesetetest (Göbel et al., 2005) ja puhastatud reoveest (Göbel et al., 2004; Lindberg et al., 2005), sulfametoksasool ei ole reoveepuhastis biodegradeeritav (Richardson and Bowron, 1985). Reoveesette kompostimise käigus ei pruugi laguneda fluorokinoloonide ja tetratsükliinide jäägid. Nende aeglast degradeerumist põhjendatakse tugeva seondumisega tahketele osakestele (Marengo et al., 1997; Carmosini and Lee, 2008). Kaks nädalat pärast väetamist seasõnnikuga tuvastati tetratsükliini sisaldus erinevatelt sügavustelt võetud mullaproovides 195 ja 254 μg/kg (Sczesny et al., 2003). Seitse kuud pärast väetamist võetud mullaproovides oli keskmine tetratsükliini sisaldus 65,5 μg/kg (Hamscher et al., 2002). Kõik eeltoodud ravimijääkide sisaldused mullas ületavad mullale kehtestatud ravimite piirnormi 10 μg/kg kümneid kordi, teaduslikult põhjendatud mullaorganismidele ohutu piirnormi 1 μg/kg sadu kordi ja mullamikroobide ravimresistentsuse arenemist ennetava piirnormi 0,01–0,1 μg/kg tuhandeid kordi. Alates 1940. aastast kuni tänaseni on antibakteriaalsete ainete tootmine ja tarbimine maailmas mitmekordistunud, sama aja jooksul on oluliselt suurenenud ka bakterite antibiootikumresistentsus, nii ohutute kui ka patogeensete bakterite hulgas. Tetratsükliini resistentsust määrava geeni esinemissagedus on mullabakterite hulgas ajavahemikul 1970– 2008 kasvanud 15 korda, põhjuseks väetamine tetratsükliine sisaldava sõnniku või reoveesette kompostiga (Knapp et al., 2010). Reoveesettes ja settekompostis esinevad bakterid on sageli antibiootikumresistentsed, kuna on elanud pikka aega antibiootikume sisaldavas keskkonnas 94 (Reinthaler et al., 2003; Sahlström, et al., 2009). Niisuguste bakterite sattumine keskkonda põhjustab ravimresistentsuse levikut. Mullabakterite antibiootikumresistentsus kujutab endast potentsiaalset ohtu inimeste ja loomade tervisele, sest resistentsust määravad geenid võivad transformeeruda ohututelt mullabakteritelt patogeensetele bakteritele horisontaalse geeniülekande teel (Davies, 1994). Taimkatsed on näidanud, et antibakteriaalsed ained fluorokinoloonide, tetratsükliinide ja sulfoonamiidide rühmast akumuleeruvad mullast taimedesse (Migliore et al., 1995; Brambilla et al., 1996; Aruksaar et al., 1998; Aruksaar et al., 1999; Lillenberg et al., 2003; Boxall et al., 2006). Sel teel on võimalik ravimite sattumine mullast inimese toidulauale või loomasööda koostisesse. Erinevalt loomorganismidest, kus ravimite jäägid väljuvad ekskrementidega, taimedel väljutusmehhanism puudub. Seetõttu on võimalik ravimijääkide kontsentreerumine pika kasvuperioodi jooksul (Lillenberg, et al., 2003). Tulemuseks võib olla kõrgem ravimijääkide sisaldus toidutaimedes, kui on lubatud loomsetes toitudes. Loomsele toormele kehtestatud MRL tuleneb ADI arvust (acceptable daily intake – päevane lubatud doos). ADI on päevas tarbida lubatud aine kogus inimese kehakaalu 1 kg kohta kogu eluaja jooksul, ilma tervist kahjustamata. Eristatakse toksikoloogilist ADI - aine ohutut doosi vältimaks otseseid kahjulikke kõrvaltoimeid organismile ja mikrobioloogilist ADI – aine ohutut doosi organismi normaalsele mikrofloorale, kusjuures ADItox > ADImic. Loomsele toormele kehtestatud MRL põhineb mikrobioloogilisel ADI arvul (EMA/EPMARs; EMEA/MRL/398/98). Toiduga saadav ravimikogus peab olema ohutu ka inimese organismis resideerivatele bakteritele. Mõnede ravimite puhul on antud piirnormid algse ravimi ja tema metaboliitide summaarse sisalduse kohta: näiteks enrofloksatsiin (EMEA/ MRL/820/02), mille peamiseks metaboliidiks loomorganismides on tsiprofloksatsiin (Mengozzi et al., 1996; Küng et al., 1993). Esimene neist on kasutusel ainult veterinaarmeditsiinis, teine ainult humaanmeditsiinis. Ka taimedes metaboliseerub omastatud enrofloksatsiin tsiprofloksatsiiniks. 10 mg/kg enrofloksatsiini sisaldusega mullas kasvanud salatis vedelikkromatograafilise HPLC meetodiga määramisel oli enrofloksatsiini ja tsiprofloksatsiini sisaldus vastavalt 300 μg/kg ja 70 μg/kg. Enrofloksatsiini ja tsiprofloksatsiini summaarseks sisalduseks 95 salatis saadi 370 μg/kg, mis ületab piimas ja lihas lubatud MRL 100 μg/ kg (EMEA/MRL/820/02) üle kolme korra (Lillenberg et al., 2003). Kuna taimedele ei ole MRL kehtestatud, on võimalik taimse toidu ohutust hinnata lähtuvalt loomsele toormele kehtestatud piirnormist (EMEA/ MRL/026/95; EMEA/MRL/820/02). Mõnede käesolevas töös uuritud ravimite puhul (norfloksatsiin ja ofloksatsiin) MRL loomse toorme jaoks puudub, sest need ravimid on kasutusel ainult humaanmeditsiinis. Norfloksatsiini ja ofloksatsiini sisaldust taimedes võib tinglikult võrrelda tsiprofloksatsiini ja enrofloksatsiini lubatud summaarse sisaldusega. 8.3. Uurimistöö eesmärgid 1. Uurida Eesti reoveesetet ning sette komposti mõningate keskkonnas kauem püsivate ja/või potentsiaalselt taimedesse akumuleeruvate antibakteriaalsete ainete: fluorokinoloonide, sulfoonamiidide ja tetratsükliinide leidumise suhtes. 2. Anda hinnang erinevatele komposti valmistamise tehnoloogiatele komposti ohutuks muutmise seisukohalt. 3. Uurida valitud ravimite akumuleerumist mullast toidutaimedesse. 4. Hinnata reoveesette komposti kui põllumajandusväetise ohutust, arvestades keskkonnakaitse ja toiduhügieeni nõudeid. 8.4. Materjal ja metoodika 8.4.1. Reoveesette ja komposti uuringud Tallinna ja Tartu reoveesetet ja reoveesette komposti analüüsiti aasta jooksul. Tartus ja Tallinnas on reoveesette stabiliseerimise meetodid erinevad: Tartus toimub pressitud sette aunkompostimine: 25%-lise kuivainesisaldusega sete viiakse väljale aunadesse ja segatakse tugiainega (purustatud puukoor) vahekorras ~1/1. Reoainetebakteriaalse lagundamise tulemusena tõuseb aunas temperatuur kuni +71 °C. Aeroobsete bakterite elutegevuseks vajalike tingimuste tagamiseks segatakse aunasid mitu korda kuus. Tallinnas on kasutusel biopuhastis settinud toormuda anaeroobne stabiliseerimine – metaankääritamine 96 +37 °C juures. Anaeroobsete bakterite metabolismi tulemusena peaksid lagunema keemilised kontaminandid. Kääritatud sete, kuivainesisaldusega 28%, viiakse väljale aunadesse ja segatakse tugiainega (turvas) vahekorras 1/0,75. Aunade segamine toimub üks kord kuus. Reoveesette proovid võeti enne segamist tugimaterjaliga. Mõlemas linnas võeti settest kolm proovi igal kuul aasta jooksul. Kompostiproovid võeti mõlemas linnas 2, 6 ja 12 kuud seisnud aunadest, kuus proovi auna erinevatest kohtadest. Kokku võeti 144 proovi, neist pooled Tartust, pooled Tallinnast. Ligikaudu 200 g reoveesetet või komposti koguti 500 ml mahuga klaaspurki, segati ja kaeti hermeetiliselt suletava kaanega. Enne analüüsimist hoiti proove temperatuuril +4 °C. Analüüsid teostati reeglina ühe nädala jooksul. Pikemaks säilitamiseks hoiti proove sügavkülmas –80 °C. Töötati välja uus metoodika kolme antibiootikumide klassi - tetratsükliinide (TC), fluorokinoloonide (FQ) ja sulfoonamiidide (SA) määramiseks reoveesettes ja kompostis. Tsiprofloksatsiini (CIP), norfloksatsiini (NOR), ofloxatsiini (OFL), sulfadimetoksiini (SDM), sulfametoksasooli (SMX), tetratsükliini (TCL) ja doksütsükliini (DOX) ekstraheerimiseks kasutati PLE (pressurized liquid extraction) meetodit, ekstraktide puhastamiseks SPE (solid phase extraction) meetodit ja ekstraktid analüüsiti LC-MS (liquid chromatography-mass spectrometry) meetodil. PLE. Ekstraktsioon viidi läbi kasutades ekstraheeriva solvendina 0,35% fosforhappe ja atsetonitriili segu 1:1, pH 2,5. Ekstraktsiooni aeg: 10 min, temperatuur: 100–110 °C, rõhk: 100–110 atm., kordus: 5 tsüklit. SPE. Ekstrakti puhastamiseks kasutati kahte erinevat tüüpi ekstraktsioonipadruneid: SCX (strong cation-exchange) ja HLB (hydrophiliclipophilic balance). Sulfoonamiidide määramisel andsid kõrgema saagise SCX padrunid, fluorokinoloonide ja tetratsükliinide puhul HLB padrunid. Kuigi sulfoonamiidide saagis HLB padrunite kasutamisel langes, jäi see siiski aktsepteeritavale tasemele. Seepärast kasutati edaspidi kõigi kolme antibiootikumide grupi üheaegseks määramiseks ainult HLB padruneid. LC-MS. Antibiootikumide sisalduse määramiseks reoveesettes ja kompostis kasutati instrumenti Agilent Series 1100 LC- MSD Trap XCT. Meetodi määramispiirid olid HLB 97 padrunite kasutamise korral CIP 1,8; NOR 1,3; OFL 0,8; SMX 0,1; SDM 0,1; DOX 80 ja TCL 160 μg/kg. Standardhälbed olid vastavalt 0,18; 0,13; 0,08; 0,01; 0,01; 7,7 ja 15,7. Saagiste protsent varieerus olenevalt ainest ja ekstraktsioonipadruni tüübist. Materjalide ja metoodika detailne kirjeldus on avaldatud artiklis II (Lillenberg et al., 2009). 8.4.2. Taimede kasvatamine, proovi ettevalmistamine ja uuringud Taimi kasvatati kasvuhoones plastikpottides, kahes erinevas mullas: liiv-savi mullas pHKCl 6,7; niiskusesisaldus 19,5% ja savi-liiv mullas pHKCl 6,9; niiskusesisaldus 8% (Lisa 1). Antibiootikumid lisati mulda vesilahustena, nii et kõikide ainete lõppkontsentratsiooniks potis oli 10, 100, 500, 1000 μg/kg või 10 mg/kg mulla kuivkaalu kohta. Parema lahustuvuse saavutamiseks lahustati fluorokinoloonid eelnevalt 2 ml-s 0,1 mM ammooniumatsetaat/metanool puhverlahuses (75/25), pH 2,8 (kohandatud 0,1%-lise sipelghappega). Sulfoonamiidid lahustati eelnevalt 2 ml 0,3 M NaOH vesilahuses. Iga kontsentratsiooni jaoks võeti kolm paralleelpotti. Kontrolliks kasvatati taimi antibiootikumidevabas mullas, samuti kolmes paralleelpotis. Katsetaimedeks olid lehtsalat (Lactuca sativa L), porgand (Daucus carota L), kartul (Solanum tuberosum L) ja nisu (Triticum vulgare L). Lehtsalati ja porgandi seemned osteti kauplusest, nisuseemned ja kartulid saadi EMÜ Põllumajandus- ja keskkonnainstituudi mullateaduse ja agrokeemia osakonnast. Mulla kogused pottides olid kartulil 5, nisul 3, porgandil 1,5 ja salatil 0,5 kg. Salati kasvuaeg viie antibiootikumi juuresolekul alates seemnete külvamisest oli 70 päeva, teistel taimedel 120 päeva (kartulil alates kartuli muldapanekust). Seejärel taimed koristati ja eraldati võsud juurtest. Mullaga kokkupuutunud taimeosad pesti hoolikalt jooksva vee all. Söödavad osad kuivatati eraldi: salatil lehed, kartulil mugulad, porgandil peajuur ja nisul terad. Kartulid ja porgandid tükeldati enne kuivatamist. Kuivatamine toimus pimedas ruumis, et vältida fotokeemilisi reaktsioone, mis võiksid põhjustada fluorokinoloonide lagunemist (Hooper and Wolfson, 1991). Kuivanud taimed jahvatati peeneks purustusveskis. Täieliku kuivkaalu saavutamiseks hoiti taimset materjali termostaadis +45 °C juures 24 tundi. Enne analüüsimist hoiti taimede proove hermeetilistes plastikaatkottides sügavkülmas temperatuuril –80 °C. 98 Antibiootikumid ekstraheeriti taimsest materjalist LE (liquid extraction) meetodil. Ekstraktid puhastati SPE meetodil ja analüüsiti LC-MS metodil. LE. Antibiootikumid ekstraheeriti kuivatatud taimsest materjalist atsetonitriili ja äädikhappe seguga 1:1. SPE. Ekstraktide puhastamiseks kasutati HLB padruneid. LC-MS. Antibiootikumide sisalduse määramiseks kasutati instrumenti Agilent Series 1100 LC-MSD Trap XCT. Ekstraheerimist on detailselt kirjeldatud artiklis V (Lillenberg et al., 20102). Antibiootikumide saagised varieerusid kõikide proovimaatriksite piirides 54-98%. Valideerimine teostati maatriksis, kus saavutati kõige madalam saagise protsent (porgandi juur liiv-savimullas: 54-78%), seega on valideerimise hinnang metoodikale antud konservatiivselt. Meetodi määramispiirid varieerusid sõltuvalt a

Selective simultaneous ultra-performance liquid chromatographic quantification of some benzodiazepines drug residues in pharmaceutical industrial wastewater

Purpose: To investigate the sensitivity and selectivity of ultra-performance liquid chromatographic (UPLC) quantification of bromazepam (BRZ) and diazepam (DZP) in pharmaceutical industrial wastewater. Methods: Wastewater samples were collected from the effluents of a pharmaceutical industrial plant producing BRZ and DZP in tablet dosage forms. The quantification of BRZ and DZP was done after their solid-phase extraction. The resolution process was performed on WatersTM column as the stationary phase. The mobile phase was acetonitrile: methanol: 0.05 M phosphate buffer (pH 6.5), at a volume ratio of 5:2:3, with a flow rate of 0.7 mL/min. Detection was carried out at 240 nm in a concentration range of 10 – 250 ng/mL. The method was fully validated in line with ICH-Q2B regulations. Results: The UPLC method was validated for the quantification of BRZ and DZP. The relative percentage recoveries were 99.55 ± 0.48 (n = 5) and 101.34 ± 0.86 (n = 5), for BRZ and DZP, respectively, in spiked distilled water, and 99.16 ± 0.77 (n = 5) and 99.32 ± 0.56 (n = 5), in tap water, respectively. The UPLC revealed effluent content ranging from 20.68 – 44.77 mg/mL for BRZ and 22.77 – 41.83 ng/mL for DZP. These values were not significantly different from their reference standards (p > 0.05). Conclusion: A sensitive and selective UPLC-method has been developed for the reproducible determination of BRZ and DZP in industrial wastewater samples. The effective monitoring of the pharmaceutical industrial pollutant will help to conserve the environment and minimize the hazardous effects of these pollutants

Paper-based devices as new smart analytical tools for sustainable detection of environmental pollutants

The use of paper as a multifunctional material in electrochemical sensing has been intensively explored over the last decade. The combination among different kinds of paper as well as their coupling with different electro chemical cell configurations have been demonstrated, disclosing innovative sensing performances and features that are still to be fully investigated. This ongoing research has found applications in a variety of fields, including the biomedical, agri-food, security, and environmental ones, thanks to the high versatility and adaptability of the paper material. In this review, we report a critical and comparative analysis of electrochemical devices based on paper published within 2010–2021 and applied for the detection of pollutants of environmental interest in fresh water, seawater, and other real environmental matrices. Several paper types, from common office paper to Whatman filter paper with different filtering grades, were proved to be useful in this field. In detail, the multifarious roles played by the paper are discussed, highlighting how the paper can be a suitable material for electrochemical sensing while being capable of simplifying the measurement of complex real matrices or real izing programmable origami-like structures. Among the most important pollutants, a special focus is dedicated to the emerging pollutants. Furthermore, the unique advantages achieved by the paper have been analyzed and highlighted, reporting the future perspectives regarding the use of this surprising material